在此，我们描述了一种用于胶质母细胞瘤（GBM）的临床前原位小鼠模型，该模型通过将来源于基因工程小鼠模型肿瘤的细胞进行颅内注射而建立。该模型呈现出人类GBM疾病的典型特征。在转化研究中，小鼠脑肿瘤可通过影像学手段进行追踪 体内 MRI 与组织病理学
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
用于人类多形性胶质母细胞瘤（GBM）的基因工程小鼠（GEM）模型对于理解脑肿瘤的发生与发展至关重要。与异种移植肿瘤不同，GEM模型中的肿瘤发生于免疫功能完整的宿主体内，并处于天然的微环境之中。然而，由于肿瘤潜伏期较长、肿瘤发生频率存在异质性以及高级别肿瘤出现时间不确定，GBM GEM模型在临床前治疗研究中的应用面临挑战。经诱导后的小鼠 通过 颅内原位注射更适用于临床前研究，并能保留基因工程小鼠（GEM）肿瘤的特征。我们建立了一种源自携带Rb、Kras和p53异常（TRP）基因工程小鼠模型的原位脑肿瘤模型，该模型可发展为胶质母细胞瘤（GBM）肿瘤 呈现肿瘤细胞的线性坏死灶以及类似于人胶质母细胞瘤（GBM）的密集血管化特征。源自GEM GBM肿瘤的细胞被颅内注射至野生型、品系匹配的受体小鼠体内，可重现IV级肿瘤，从而绕过GEM小鼠中较长的肿瘤潜伏期，实现用于临床前研究的大规模且可重复的实验队列构建。TRP GEM GBM模型的高度增殖性、侵袭性和血管化特征在原位移植肿瘤中得以再现，且组织病理学标志物反映了人类GBM的分子亚型。肿瘤生长通过连续的MRI扫描进行监测。由于在免疫健全模型中颅内肿瘤具有侵袭性，严格遵循本文所述的注射操作流程对于防止颅外肿瘤生长至关重要。
引言
胶质母细胞瘤（GBM；IV级胶质瘤）是最常见且恶性程度最高的脑肿瘤，目前的治疗方法无效，导致 中位生存期为15个月1可靠的、能够准确模拟脑肿瘤生长及发病过程中复杂信号通路的临床前模型，对于加快评估胶质母细胞瘤（GBM）新治疗方案的进展至关重要。将人脑肿瘤细胞系皮下植入免疫缺陷小鼠的鼠类模型，无法反映脑肿瘤原有的免疫微环境，也不能用于评估治疗药物穿越血脑屏障的能力。2理想的临床前小鼠模型还应高度再现人类胶质母细胞瘤（GBM）的组织病理学特征，包括对周围实质组织的高度侵袭性3尽管基因工程小鼠（GEM）模型在免疫系统完整的情况下可发生肿瘤，但通常需要复杂的育种方案，且肿瘤的发生可能较为缓慢且不一致4GEM来源的异种移植模型更适合需要在较短时间内获得大量荷瘤小鼠的临床前治疗研究。
在先前的一篇报告中，我们描述了一种直接来源于基因工程小鼠（GEM）肿瘤的原位胶质母细胞瘤（GBM）小鼠模型。GEM小鼠中肿瘤的发生起始于表达胶质纤维酸性蛋白（GFAP）的细胞群（主要是星形胶质细胞）发生的遗传事件，这些事件最终导致肿瘤进展为GBM。这些TRP GEM小鼠携带一个TgGZT121转基因（T），在GFAP驱动的Cre重组酶作用下表达T121蛋白。T121蛋白的表达导致Rb（Rb1、p107和p103）蛋白活性受到抑制。同时，TRP小鼠还携带一个由GFAP驱动的Cre转基因（GFAP-CreERT2），在他莫昔芬诱导后可特异性靶向成年星形胶质细胞中的基因表达。此外，TRP小鼠携带一个Cre依赖性的突变型Kras等位基因（KrasG12D；R），以模拟受体酪氨酸激酶通路的激活，并且在Pten基因（P）上呈杂合性缺失5,6。受体酪氨酸激酶（RTK）、PI3K和RB信号网络中的并发基因异常参与了74%的GBM发病过程7。因此，TRP小鼠中所引入的基因工程突变模拟了人类GBM中主要的信号通路改变，特别是那些共同激活RTK下游靶点的GBM肿瘤5。
GEM来源的同系正位模型被验证为一种可重现人类脑肿瘤特征（包括侵袭性及亚型生物标志物的存在）的模型，可作为评估靶向GBM异常通路的抗癌治疗药物的平台。从TRP小鼠脑中收获的肿瘤组织分离细胞，经培养后使用立体定位仪将细胞注射至遗传背景匹配小鼠大脑皮层，进行颅内移植。该临床前正位小鼠模型产生的GBM肿瘤具有高细胞密度、侵袭性强、多形性明显、有丝分裂率高，并表现出肿瘤细胞呈线性分布的坏死灶以及丰富的血管生成，这些特征与人类GBM观察结果一致。肿瘤体积和生长情况通过 体内 磁共振成像（MRI）
本报告中，我们以TRP肿瘤为例，描述了将原代胶质母细胞瘤（GBM）细胞或细胞系注射至野生型小鼠脑内的最佳技术。该方案也可根据需要调整用于免疫缺陷小鼠及其他GBM细胞系。我们提供了关键操作建议，以避免常见问题，如细胞制备不当或注射部位细胞渗漏，并确保正确使用立体定位设备，从而保证模型的可重复性与可靠性。为实现转化研究目的，我们通过活体动物脑肿瘤生长的磁共振成像（MRI）检测、组织学表征，以及荷瘤小鼠治疗实例，对该模型进行了验证。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
方案
本研究方案已获得弗雷德里克国家癌症研究所动物护理与使用委员会的批准。弗雷德里克国家癌症研究所已通过国际实验动物评估和认可委员会（AAALAC International）的认证，并遵循《公共卫生服务实验室动物护理与使用政策》。动物护理按照《实验室动物护理与使用指南》（国家研究委员会，2011；国家科学院出版社，华盛顿特区）中所述程序进行。
1. 注射用细胞的制备
注意：本模型所用的小鼠脑肿瘤原代细胞（MBRs）最初来源于他莫昔芬诱导的 TRP 基因工程小鼠（GEM），具体方法见 El Meskini 等人5 的描述。有关细胞制备的详细信息可参考该文献。
- 在生物安全柜中，使用无菌技术执行以下步骤。
- 原代脑肿瘤细胞培养 体外 直到它们进入指数生长期。
- 用0.25%胰蛋白酶消化收集细胞，待细胞脱落后，加入生长培养基稀释以灭活胰蛋白酶。
- 通过离心（400 x g）沉淀细胞 g 用无血清培养基洗涤，计数前重复一次。
- 手动或使用自动细胞计数器对细胞进行计数。根据最终注射体积为 2 µL 的要求，将细胞重悬于含 5% 无菌甲基纤维素的 1× 磷酸盐缓冲液（PBS）中，浓度根据具体细胞系和脑肿瘤模型而定。对于 GBM GEM TRP 细胞，我们注射 2 µL 浓度为 25 × 10⁶6 细胞/毫升溶液，或50,000个细胞。
2. 小鼠品系
- 培育或购买与脑肿瘤细胞品系背景相匹配的合适小鼠品系。对于TRP细胞，使用9周龄的B6D2F1/J小鼠（由C57BL/6J [B6]雌鼠与DBA/2J [D2]雄鼠杂交获得）作为肿瘤细胞受体。
3. 手术区域的准备
注意：所有外科手术步骤均需在洁净且已消毒的环境中，采用无菌技术进行。术者应穿戴刷手服和个人防护装备，包括口罩。手术器械在使用前必须经过高温灭菌。
- 在立体定位仪下方及工作台面上放置表面保护垫。
- 将麻醉机的乙烯基导管连接至立体定位仪气体麻醉平台的进气口（IN port），另一根导管连接至出气口（OUT port）。
- 将数字显示器连接至电源并接入设备。
- 将微量泵控制器（图1A）连接至电源，并将微量泵（图1A）安装至设备的操纵臂上（同时参见制造商说明书）。
- 将微量泵设定为 2,000 nL 注射体积时的流速为 5.6 nL/s。
- 开启热珠灭菌器。
- 将小鼠加热垫插入温度控制器并连接电源。将加热板放置于工作台平台上，设置板温为 37 °C。
- 向30 G精密注射器中反向装填，注意避免引入气泡。插入推杆并安装针头，仅握住针头的针座部分。轻压推杆，直至有少量甲基纤维素细胞混合液从针尖滴出。使用70%酒精擦拭垫小心擦拭针头侧面，或在工作台面上放置无菌纱布垫后轻蘸清洁。注意避免弯曲或折断针头。
- 将精密注射器固定于微量泵上，并将操纵臂旋转至远离工作台的位置，以防止在将小鼠放置于工作台前发生注射器-针头移位。
4. 手术前小鼠的准备
- 将小鼠放入诱导室中，异氟烷蒸发器设置为 2.5%，或根据机构指南进行麻醉。打开异氟烷气流至鼻罩。
- 将小鼠转移至立体定位仪，并将其固定在鼻罩上，门齿置于鼻罩支撑处（图 1B，9）。拧紧鼻罩上的旋钮以固定（图 1B）。通过夹捏脚趾检查反射，确保麻醉深度适当。
- 观察耳朵、足部和黏膜的颜色（粉红色），以确认氧合充足。同时监测呼吸频率（呼吸频率升高或降低可能提示需要调整异氟烷浓度）。
- 将耳棒（图 1B）插入双侧耳道，并拧紧旋钮以固定头部。
- 在小鼠麻醉期间，涂抹眼膏以润滑眼睛。
- 使用弯头镊子拔除小鼠头部计划切口区域约 150% 范围内的毛发，以确保充分的无菌条件。
- 皮下注射 0.5–1 mg/kg 的缓释布托啡诺镇痛剂，或使用其他经方案批准的镇痛药物。
- 插入直肠探头以监测小鼠体温，防止因麻醉导致的低体温。维持小鼠体温在 36.5 至 38.5 °C 之间。
- 采用由内向外画圈的方式消毒手术区域，交替使用外科擦洗液和乙醇共三次。
- 用镊子拉紧皮肤，从两眼之间开始，使用手术刀片做约 1 cm 的切口。切口处应能观察到前囟（bregma）。
注意：为确保无菌操作，仅可用灭菌器械的尖端接触手术部位，且器械尖端只能放置在无菌表面上（例如高压灭菌器械包的内侧）。 - 使用棉签的木柄端刮除多余的结缔组织，再用另一根棉签的棉头端擦干。
5. 细胞注射
- 将带有注射器的操纵臂移回小鼠上方，拧紧旋钮以固定。使用水平面上的 X 和 Y 旋钮，将注射器支架移动至前囟位置。通过 Z 旋钮降低针头，确认前囟的位置，并将数字读数显示屏归零。
- 使用 X 和 Y 旋钮及相应的数字读数，将针头移动至目标位置。对于皮层区域，适当坐标为前囟后方 3 mm、外侧右方 2 mm，以及硬脑膜下 2 mm 深处。使用 Z 旋钮将针头移至颅骨表面。
- 使用带 25 G 针头的 1 mL 注射器在颅骨上穿刺一个小孔。将针头斜面朝向 30 G 精密注射器针头，并小心地将操纵臂向一侧旋转。用拇指和食指缓慢来回滚动针头，施加轻柔压力，直至针尖刚好刺穿颅骨。
- 用棉签轻轻擦拭针孔周围的血液。将装有细胞悬液的精密注射器针头重新置于孔上方的正确位置。调整针尖对准孔位，使用 Z 旋钮将针头降至脑部硬脑膜表面，并将数字读数显示屏归零。
- 使用 Z 旋钮将针头下降 1 mm，然后等待 1 分钟。重复此步骤，直至达到目标深度（如所示为 2 mm）。
注意：应缓慢降低针头，以防止对周围脑组织造成额外损伤以及细胞溶液回流。 - 启动微量泵，并监控确保泵在注入 2 µL 后停止。在指定速度下，此过程应持续约 6 分钟。之后，在移动针头前等待 1 分钟。
6. 移除针头并关闭伤口
- 将针头抬高 1 mm，然后等待 1 分钟。重复此操作，直至针头完全脱离颅骨。
- 如有必要，使用棉签轻轻擦拭注射部位周围的血液。
- 使用棉签的木端取一小块骨蜡（约 1 mm），将其塑成圆锥形，放入颅骨的开孔中，并将蜡推入孔内。
- 使用 bead 灭菌器加热镊子，用其熔化颅骨上残留的蜡并抹平表面。
- 在切口处滴入约两滴布比卡因（麻醉剂）溶液，用镊子将皮肤边缘拉拢对齐。
- 将皮肤拉紧，使用一到两个伤口夹闭合皮肤。
- 将小鼠置于清洁的恢复笼中，放置在无风区域的加热垫上，并密切观察小鼠状态。待小鼠完全从麻醉中苏醒并恢复正常的活动行为后，再将其送回常规饲养环境。
- 手术后每日检查小鼠状况，并根据机构指南给予镇痛处理。
- 若使用缓释型丁丙诺啡（步骤 4.6）进行镇痛，其缓释制剂作用可持续 72 小时。仅当 72 小时后出现明显疼痛或不适时才需重复给药。若操作正确，小鼠对颅内注射耐受良好，通常无需额外镇痛。
- 术后 7–10 天拆除缝合钉。
- 通过活体动物成像（MRI）监测肿瘤生长情况。
- 当达到人道终点时（例如动物体重减轻超过 20% 或出现低体温），实施安乐死。
- 由于此类脑肿瘤具有侵袭性，应观察小鼠是否出现神经系统症状，如步态不稳、部分瘫痪、原地转圈或头部倾斜。一旦观察到上述任一提示肿瘤进展的临床体征，应立即对小鼠实施安乐死。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
注射了脑肿瘤细胞的小鼠应每日监测肿瘤生长迹象，例如癫痫发作、共济失调或体重减轻。脑肿瘤的生长也可通过定期进行MRI扫描来监测。每周的MRI扫描能够可视化大脑内不断增加的肿瘤负荷并进行肿瘤体积测量。图 1C）。特别是，TRP肿瘤表现出侵袭性生长，颅内注射后2至3周内即可通过磁共振成像测量其3D肿瘤体积（平均体积为30至40立方毫米）。3在一项代表性研究中，将一组荷脑瘤小鼠分为对照组与放射治疗组；MRI肿瘤体积测量显示放射治疗后肿瘤生长抑制效果缺失。图 2A)，导致治疗组小鼠的生存率未见提升。图 2B).
尸检时，肿瘤可表现为肿胀右半球脑组织上的暗色斑点。图 3A，中间面板），或在肿瘤较大时，呈现为隆起的暗色区域。为进行组织病理学分析，需沿注射部位区域进行矢状切面（图3A
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
在胶质母细胞瘤（GBM）中，临床前模型对于评估新的治疗靶点和新型治疗策略至关重要。GBM的基因工程小鼠模型具有肿瘤在原位发生的优点，但通常存在较长的潜伏期和不可预测的肿瘤生长特性13。GEM模型的肿瘤潜伏期为4-5个月，且不同小鼠之间成像、入组和治疗的理想时间窗口存在差异。相比之下，原位模型具有明确且可操作的生长与治疗时间线，约为4-5周，且植入后可通过磁共振成像（MRI）稳定检测到肿瘤。利用GEM来源的原位模型，可在每只小鼠中将肿瘤精确植入相同位置，同时实现对肿瘤生长启动的时间控制，并保留周围脑组织微环境的优势。在TRP原位模型中，活化的RTK、PTEN和RB信号通路共同构建出一种能够模拟人类GBM组织学特征的肿瘤模型。与人类GBM类似，TRP原位GBM肿瘤表现出侵袭性生长的特征，例如坏死灶周围出现假栅栏样排列的肿瘤细胞以及新生血管形成。此外，肿瘤还会向周围脑实质浸润。因此，可在TRP原位肿瘤模型中对可能抑制患者肿瘤浸润和迁移的药物进行临床前评估。将来自侵袭性GEM肿瘤的细胞注射至同系小鼠时需格外谨慎，以避免细胞意外泄漏并在靶区外生长。本研究所描述的方法若常规应用，可用于构建大量携带肿瘤...
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
作者声明无利益冲突。
致谢
我们感谢 Alan E. Kulaga 先生提供的出色技术支持，感谢 Michelle L. Gumprecht 女士对外科技术的改进。我们感谢 Philip L. Martin 博士进行病理学分析，感谢美国国家癌症研究所小动物影像项目（Frederick National Laboratory Small Animal Imaging Program）的 Lilia Ileva 女士和 Joseph Kalen 博士提供 MRI 扫描。
本项目全部或部分使用了美国国家癌症研究所、美国国立卫生研究院的联邦资金，合同编号为 HHSN261201500003I。本出版物的内容不一定反映美国卫生与公共服务部的观点或政策，提及商品名、商业产品或组织亦不表示美国政府的 endorsement。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1× PBS 中含 5% 羧甲基纤维素，经高压灭菌 | Millipore Sigma | M7027 | |
| 1 mL 结核菌素注射器，滑动式针头接口 | BD | 309659 | |
| 6" 棉签 | Puritan | S-18991 | |
| 可调节载物台平台 | David Kopf Instruments | Model 901 | |
| 气溶胶屏障吸头 | Fisher Scientific | 02-707-33 | |
| 酒精消毒片，无菌，大号 - 2.5 × 3 英寸 | PDI | C69900 | |
| B6D2 小鼠品系 (C57Bl/6J × DBA/2J) | Jackson Laboratory | Jax #10006 | |
| 骨蜡 | Surgical Specialties | 901 | |
| 0.25% 布比卡因 | Henry Schein | 6023287 | |
| BuprenorphineSR | ZooPharm | n/a | |
| 透明乙烯基管，内径 1/8 英寸，外径 3/16 英寸 | UDP | T10004001 | |
| CVS 润滑性眼膏 | CVS Pharmacy | 247881 | |
| 一次性手术刀，#10 刀片 | Scalpel Miltex | 16-63810 | |
| 配备氧气接口和麻醉箱的气体麻醉机 | Somni Scientific | n/a | 研究者可使用机构 标准设备 |
| 小鼠用气体麻醉平台 | David Kopf Instruments | Model 923-B | |
| GraphPad Prism | Graphpad | Prism 9 版本 9.4.1 | |
| Hamilton 30 号针头，½ “，小接头，pst 3 型针尖 | Hamilton | 特殊订单 | |
| Hamilton 精密微量注射器，1701 RN，无针头，10 µL | Hamilton | 7653-01 | |
| 带微珠的热珠灭菌器 | Fine Science Tools | 18000-45 | |
| Invitrogen Countess 3 自动细胞计数仪 | Fisher Scientific | AMQAX2000 | |
| 异氟烷（IsoFlurane） | Piramal Critical Care | 29404 | |
| 异丙醇消毒片 | PDI | C69900 | |
| ITK_SNAP（版本 36.X，2011 年至今） | 宾夕法尼亚大学宾大图像计算与科学实验室（PICSL）及犹他大学科学计算与成像研究所（SCI） | ||
| 配备数字读出控制台的 KOPF 小动物立体定位仪 | David Kopf Instruments | Model 940 | |
| Masterflex 接头，PVDF 材质，直型，软管倒刺式变径接头，内径 1/4" × 内径 1/8" | Masterflex | HV-30616-16 | |
| 小鼠加热板 | David Kopf Instruments | PH HP-4M | |
| 小鼠直肠探头 | David Kopf Instruments | PH RET-3-ISO | |
| Nalgene Super Versi-Dry 表面防护罩 | ThermoFisher Scientific | 74000-00 | |
| P20 移液器 | Gilson | F123600 | |
| 聚维酮碘外科洗手液 | Dynarex | 1415 | |
| Reflex 9 mm 伤口缝合钉施加器 | Fine Science Tools | 12031-09 | |
| Reflex 9 mm 伤口缝合钉移除器 | Fine Science Tools | 12033-00 | |
| Reflex 9 mm 伤口缝合钉 | Fine Science Tools | 12032-09 | |
| Semken 镊子，弯型 | Fine Science Tools | 11009-13 | |
| 温度控制器 | David Kopf Instruments | PH TCAT-2LV | |
| 胰蛋白酶-EDTA（0.25%） | ThermoFisher Scientific | 25200056 | |
| 带 25 号针头的结核菌素注射器，滑动式针头接口 | BD | 309626 | |
| UltraMicroPump 3 配 Micro2T 控制器 | World Precision Instruments | Model UMP3T |
参考文献
- Tamimi, A. F., Juweid, M. Epidemiology and Outcome of Glioblastoma. Glioblastoma. , (2017).
- Robertson, F. L., Marques-Torrejon, M. A., Morrison, G. M., Pollard, S. M. Experimental models and tools to tackle glioblastoma. Disease Models & Mechanisms. 12 (9), (2019).
- Wen, P. Y., Kesari, S. Malignant gliomas in adults. The New England Journal of Medicine. 359 (5), 492-507 (2008).
- Haddad, A. F., et al. Mouse models of glioblastoma for the evaluation of novel therapeutic strategies. Neuro-Oncology Advances. 3 (1), (2021).
- El Meskini, R., et al. A preclinical orthotopic model for glioblastoma recapitulates key features of human tumors and demonstrates sensitivity to a combination of MEK and PI3K pathway inhibitors. Disease Models & Mechanisms. 8 (1), 45-56 (2015).
- Song, Y., et al. Evolutionary etiology of high-grade astrocytomas. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (44), 17933-17938 (2013).
- Cancer Genome Atlas Research Network. Comprehensive genomic characterization defines human glioblastoma genes and core pathways. Nature. 455 (7216), 1061-1068 (2008).
- Motomura, K., et al. Immunohistochemical analysis-based proteomic subclassification of newly diagnosed glioblastomas. Cancer Science. 103 (10), 1871-1879 (2012).
- Choyke, P. L., Dwyer, A. J., Knopp, M. V. Functional tumor imaging with dynamic contrast-enhanced magnetic resonance imaging. Journal of Magnetic Resonance Imaging. 17 (5), 509-520 (2003).
- Raza, S. M., et al. Identification of necrosis-associated genes in glioblastoma by cDNA microarray analysis. Clinical Cancer Research. 10, 212-221 (2004).
- Raza, S. M., et al. Necrosis and glioblastoma: a friend or a foe? A review and a hypothesis. Neurosurgery. 51 (1), 2-12 (2002).
- Hambardzumyan, D., Bergers, G. Glioblastoma: defining tumor niches. Trends in Cancer. 1 (4), 252-265 (2015).
- Kijima, N., Kanemura, Y. Glioblastoma. Mouse Models of Glioblastoma. , Exon Publications. (2017).
- Casanova, F., Carney, P. R., Sarntinoranont, M. Effect of needle insertion speed on tissue injury, stress, and backflow distribution for convection-enhanced delivery in the rat brain. PloS One. 9 (4), 94919(2014).
- Jin, F., Jin-Lee, H. J., Johnson, A. J. Mouse Models of Experimental Glioblastoma. Gliomas. , Exon Publications. (2021).
- Zalles, M., Towner, R. A. Pre-Clinical Models and Potential Novel Therapies for Glioblastomas. Gliomas. , Exon Publications. 1-13 (2021).
- Wierzbicki, K., et al. Targeting and therapeutic monitoring of H3K27M-mutant glioma. Current Oncology Reports. 22 (2), 19(2020).
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
