在此，我们描述了一种用于胶质母细胞瘤（GBM）的临床前原位小鼠模型，该模型通过将来源于基因工程小鼠模型肿瘤的细胞进行颅内注射而建立。该模型呈现出人类GBM疾病的典型特征。在转化研究中，小鼠脑肿瘤可通过影像学手段进行追踪 体内 MRI 与组织病理学
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摘要
摘要
用于人类多形性胶质母细胞瘤（GBM）的基因工程小鼠（GEM）模型对于理解脑肿瘤的发生与发展至关重要。与异种移植肿瘤不同，GEM模型中的肿瘤发生于免疫功能完整的宿主体内，并处于天然的微环境之中。然而，由于肿瘤潜伏期较长、肿瘤发生频率存在异质性以及高级别肿瘤出现时间不确定，GBM GEM模型在临床前治疗研究中的应用面临挑战。经诱导后的小鼠 通过 颅内原位注射更适用于临床前研究，并能保留基因工程小鼠（GEM）肿瘤的特征。我们建立了一种源自携带Rb、Kras和p53异常（TRP）基因工程小鼠模型的原位脑肿瘤模型，该模型可发展为胶质母细胞瘤（GBM）肿瘤 呈现肿瘤细胞的线性坏死灶以及类似于人胶质母细胞瘤（GBM）的密集血管化特征。源自GEM GBM肿瘤的细胞被颅内注射至野生型、品系匹配的受体小鼠体内，可重现IV级肿瘤，从而绕过GEM小鼠中较长的肿瘤潜伏期，实现用于临床前研究的大规模且可重复的实验队列构建。TRP GEM GBM模型的高度增殖性、侵袭性和血管化特征在原位移植肿瘤中得以再现，且组织病理学标志物反映了人类GBM的分子亚型。肿瘤生长通过连续的MRI扫描进行监测。由于在免疫健全模型中颅内肿瘤具有侵袭性，严格遵循本文所述的注射操作流程对于防止颅外肿瘤生长至关重要。
引言
胶质母细胞瘤（GBM；IV级胶质瘤）是最常见且恶性程度最高的脑肿瘤，目前的治疗方法无效，导致 中位生存期为15个月1可靠的、能够准确模拟脑肿瘤生长及发病过程中复杂信号通路的临床前模型，对于加快评估胶质母细胞瘤（GBM）新治疗方案的进展至关重要。将人脑肿瘤细胞系皮下植入免疫缺陷小鼠的鼠类模型，无法反映脑肿瘤原有的免疫微环境，也不能用于评估治疗药物穿越血脑屏障的能力。2理想的临床前小鼠模型还应高度再现人类胶质母细胞瘤（GBM）的组织病理学特征，包括对周围实质组织的高度侵袭性3尽管基因工程小鼠（GEM）模型在免疫系统完整的情况下可发生肿瘤，但通常需要复杂的育种方案，且肿瘤的发生可能较为缓慢且不一致4GEM来源的异种移植模型更适合需要在较短时间内获得大量荷瘤小鼠的临床前治疗研究。
在先前的一篇报告中，我们描述了一种直接来源于基因工程小鼠（GEM）肿瘤的原位胶质母细胞瘤（GBM）小鼠模型。GEM小鼠中肿瘤的发生起始于表达胶质纤维酸性蛋白（GFAP）的细胞群（主要是星形胶质细胞）发生的遗传事件，这些事件最终导致肿瘤进展为GBM。这些TRP GEM小鼠携带一个TgGZT121转基因（T），在GFAP驱动的Cre重组酶作用下表达T121蛋白。T121蛋白的表达导致Rb（Rb1、p107和p10....
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方案
本研究方案已获得弗雷德里克国家癌症研究所动物护理与使用委员会的批准。弗雷德里克国家癌症研究所已通过国际实验动物评估和认可委员会（AAALAC International）的认证，并遵循《公共卫生服务实验室动物护理与使用政策》。动物护理按照《实验室动物护理与使用指南》（国家研究委员会，2011；国家科学院出版社，华盛顿特区）中所述程序进行。
1. 注射用细胞的制备
注意：本模型所用的小鼠脑肿瘤原代细胞（MBRs）最初来源于他莫昔芬诱导的 TRP 基因工程小鼠（GEM），具体方法见 El Meskini 等人5 的描述。有关细胞制备的详细信息可参考该文献。
- 在生物安全柜中，使用无菌技术执行以下步骤。
- 原代脑肿瘤细胞培养 体外 直到它们进入指数生长期。
- 用0.25%胰蛋白酶消化收集细胞，待细胞脱落后，加入生长培养基稀释以灭活胰蛋白酶。
- 通过离心（400 x g）沉淀细胞 g 用无血清培养基洗涤，计数前重复一次。
- 手动或使用自动细胞计数器对细胞进行计数。根据最终注射体积为 2 µL 的要求，将细胞重悬于含 5% 无菌甲基纤维素的 1× 磷酸盐缓冲液（PBS）中，浓度根据具体细胞系和脑肿瘤模型而定。对于 GBM ....
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结果
注射了脑肿瘤细胞的小鼠应每日监测肿瘤生长迹象，例如癫痫发作、共济失调或体重减轻。脑肿瘤的生长也可通过定期进行MRI扫描来监测。每周的MRI扫描能够可视化大脑内不断增加的肿瘤负荷并进行肿瘤体积测量。图 1C）。特别是，TRP肿瘤表现出侵袭性生长，颅内注射后2至3周内即可通过磁共振成像测量其3D肿瘤体积（平均体积为30至40立方毫米）。3在一项代表性研究中，将一组荷脑瘤小鼠分为对照组与放射治疗组；MRI肿瘤体积测量显示放射治疗后肿瘤生长抑制效果缺失。图 2A)，导致治疗组小鼠的生存率未见提升。图 2B).
尸检时，肿瘤可表现为肿胀右半球脑组织上的暗色斑点。图 3A，中间面板），或在肿瘤较大时，呈现为隆起的暗色区域。为进行组织病理学分析，需沿注射部位区域进行矢状切面（图3A
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讨论
在胶质母细胞瘤（GBM）中，临床前模型对于评估新的治疗靶点和新型治疗策略至关重要。GBM的基因工程小鼠模型具有肿瘤在原位发生的优点，但通常存在较长的潜伏期和不可预测的肿瘤生长特性13。GEM模型的肿瘤潜伏期为4-5个月，且不同小鼠之间成像、入组和治疗的理想时间窗口存在差异。相比之下，原位模型具有明确且可操作的生长与治疗时间线，约为4-5周，且植入后可通过磁共振成像（MRI）稳定检测到肿瘤。利用GEM来源的原位模型，可在每只小鼠中将肿瘤精确植入相同位置，同时实现对肿瘤生长启动的时间控制，并保留周围脑组织微环境的优势。在TRP原位模型中，活化的RTK、PTEN和RB信号通路共同构建出一种能够模拟人类GBM组织学特征的肿瘤模型。与人类GBM类似，TRP原位GBM肿瘤表现出侵袭性生长的特征，例如坏死灶周围出现假栅栏样排列的肿瘤细胞以及新生血管形成。此外，肿瘤还会向周围脑实质浸润。因此，可在TRP原位肿瘤模型中对可能抑制患者肿瘤浸润和迁移的药物进行临床前评估。将来自侵袭性GEM肿瘤的细胞注射至同系小鼠时需格外谨慎，以避免细胞意外泄漏并在靶区外生长。本研究所描述的方法若常规应用，可用于构建大量携带肿瘤.......
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
我们感谢 Alan E. Kulaga 先生提供的出色技术支持，感谢 Michelle L. Gumprecht 女士对外科技术的改进。我们感谢 Philip L. Martin 博士进行病理学分析，感谢美国国家癌症研究所小动物影像项目（Frederick National Laboratory Small Animal Imaging Program）的 Lilia Ileva 女士和 Joseph Kalen 博士提供 MRI 扫描。
本项目全部或部分使用了美国国家癌症研究所、美国国立卫生研究院的联邦资金，合同编号为 HHSN261201500003I。本出版物的内容不一定反映美国卫生与公共服务部的观点或政策，提及商品名、商业产品或组织亦不表示美国政府的 endorsement。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1× PBS 中含 5% 羧甲基纤维素，经高压灭菌 | Millipore Sigma | M7027 | |
| 1 mL 结核菌素注射器，滑动式针头接口 | BD | 309659 | |
| 6" 棉签 | Puritan | S-18991 | |
| 可调节载物台平台 | David Kopf Instruments | Model 901 | |
| 气溶胶屏障吸头 | Fisher Scientific | 02-707-33 | |
| 酒精消毒片，无菌，大号 - 2.5 × 3 英寸 | PDI | C69900 | |
| B6D2 小鼠品系 (C57Bl/6J × DBA/2J) | Jackson Laboratory | Jax #10006 | |
| 骨蜡 | Surgical Specialties | 901 | |
| 0.25% 布比卡因 | Henry Schein | 6023287 | |
| BuprenorphineSR | ZooPharm | n/a | |
| 透明乙烯基管，内径 1/8 英寸，外径 3/16 英寸 | UDP | T10004001 | |
| CVS 润滑性眼膏 | CVS Pharmacy | 247881 | |
| 一次性手术刀，#10 刀片 | Scalpel Miltex | 16-63810 | |
| 配备氧气接口和麻醉箱的气体麻醉机 | Somni Scientific | n/a | 研究者可使用机构 标准设备 |
| 小鼠用气体麻醉平台 | David Kopf Instruments | Model 923-B | |
| GraphPad Prism | Graphpad | Prism 9 版本 9.4.1 | |
| Hamilton 30 号针头，½ “，小接头，pst 3 型针尖 | Hamilton | 特殊订单 | |
| Hamilton 精密微量注射器，1701 RN，无针头，10 µL | Hamilton | 7653-01 | |
| 带微珠的热珠灭菌器 | Fine Science Tools | 18000-45 | |
| Invitrogen Countess 3 自动细胞计数仪 | Fisher Scientific | AMQAX2000 | |
| 异氟烷（IsoFlurane） | Piramal Critical Care | 29404 | |
| 异丙醇消毒片 | PDI | C69900 | |
| ITK_SNAP（版本 36.X，2011 年至今） | 宾夕法尼亚大学宾大图像计算与科学实验室（PICSL）及犹他大学科学计算与成像研究所（SCI） | ||
| 配备数字读出控制台的 KOPF 小动物立体定位仪 | David Kopf Instruments | Model 940 | |
| Masterflex 接头，PVDF 材质，直型，软管倒刺式变径接头，内径 1/4" × 内径 1/8" | Masterflex | HV-30616-16 | |
| 小鼠加热板 | David Kopf Instruments | PH HP-4M | |
| 小鼠直肠探头 | David Kopf Instruments | PH RET-3-ISO | |
| Nalgene Super Versi-Dry 表面防护罩 | ThermoFisher Scientific | 74000-00 | |
| P20 移液器 | Gilson | F123600 | |
| 聚维酮碘外科洗手液 | Dynarex | 1415 | |
| Reflex 9 mm 伤口缝合钉施加器 | Fine Science Tools | 12031-09 | |
| Reflex 9 mm 伤口缝合钉移除器 | Fine Science Tools | 12033-00 | |
| Reflex 9 mm 伤口缝合钉 | Fine Science Tools | 12032-09 | |
| Semken 镊子，弯型 | Fine Science Tools | 11009-13 | |
| 温度控制器 | David Kopf Instruments | PH TCAT-2LV | |
| 胰蛋白酶-EDTA（0.25%） | ThermoFisher Scientific | 25200056 | |
| 带 25 号针头的结核菌素注射器，滑动式针头接口 | BD | 309626 | |
| UltraMicroPump 3 配 Micro2T 控制器 | World Precision Instruments | Model UMP3T |
参考文献
- Tamimi, A. F., Juweid, M. Epidemiology and Outcome of Glioblastoma. Glioblastoma. , (2017).
- Robertson, F. L., Marques-Torrejon, M. A., Morrison, G. M., Pollard, S. M. Experimental models and tools to tackle glioblastoma. Disease Models & Mechanisms. 12 (9), (2019).
- Wen, P. Y., Kesari, S.
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