方法文章

高内涵筛选实验用于鉴定抗体依赖性细胞介导的细胞毒性调节化合物

DOI：

10.3791/64485

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2023年8月18日

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1Department of Medical Chemistry, Faculty of Medicine, University of Debrecen, 2Doctoral School of Molecular Medicine, University of Debrecen, 3National Academy of Scientist Education, University of Debrecen, 4ELKH-DE Cell Biology and Signaling Research Group

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

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本方案介绍了一种自动化的、基于图像的高通量技术，用于在存在治疗性抗 HER-2 抗体的情况下，筛选能够调节自然杀伤细胞介导的乳腺癌细胞杀伤作用的化合物。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

使用抗原特异性抗体或免疫检查点抑制剂的免疫治疗已彻底改变了乳腺癌的治疗方式。表达表皮生长因子受体HER2的乳腺癌细胞可被抗HER-2抗体曲妥珠单抗（trastuzumab）靶向识别。抗体依赖性细胞介导的细胞毒性（ADCC）是介导HER-2抗肿瘤作用的重要机制。与癌细胞结合的曲妥珠单抗可被ADCC效应细胞表面的Fc受体识别例如，自然杀伤（NK）细胞、巨噬细胞和粒细胞），从而触发这些免疫细胞的细胞毒活性，导致癌细胞死亡。我们旨在建立一种基于成像的检测方法，用于定量抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用（ADCC），并通过高内涵筛选鉴定新型ADCC调节化合物。在该检测中，将过表达HER2的JIMT-1乳腺癌细胞与NK-92细胞在曲妥珠单抗存在下共培养，通过自动化显微镜和定量图像分析来量化靶细胞的死亡。靶细胞与效应细胞根据其EGFP荧光信号进行区分。我们展示了如何在该检测中测试化合物文库，以鉴定ADCC调节药物。为此，使用实验室现有试剂中随机选取的精细化学品构建了一个化合物文库测试板。测试文库中还包含了三种预期会干扰NK细胞迁移和脱颗粒的微管去稳定化化合物（秋水仙碱、长春新碱、鬼臼毒素）。测试筛选将这三种阳性对照化合物均识别为有效命中，验证了该方法适用于从化学文库中鉴定ADCC调节药物。利用该检测方法，可对化合物文库进行筛选，以发现能够增强ADCC的化合物，这些化合物有望作为佐剂治疗药物，用于接受抗癌免疫治疗的患者。此外，该方法还可用于识别癌症患者因不同适应症而使用的治疗药物中可能存在的不良ADCC抑制副作用。

引言

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使用抗癌抗体、免疫检查点抑制剂或表达嵌合抗原受体的T细胞（CAR-T细胞）进行免疫治疗是癌症治疗的一种强有力策略1,2,3。曲妥珠单抗是一种人源化的抗HER-2（人表皮生长因子受体2）单克隆抗体，用于治疗HER-2阳性的早期或转移性乳腺癌，以及HER-2阳性的转移性胃癌4,5,6。其主要作用机制是抑制表皮生长因子的促增殖效应4。然而有研究报道，即使癌细胞已失去对HER-2刺激的响应能力，曲妥珠单抗仍能有效诱导癌细胞死亡7。这种看似矛盾的作用效应源于抗体依赖性细胞介导的细胞毒性（ADCC）7。ADCC可由自然杀伤（NK）细胞、粒细胞和巨噬细胞介导，这些细胞统称为ADCC的效应细胞8,9。当抗体（如曲妥珠单抗）结合到肿瘤细胞上后，这些效应细胞通过其Fc受体与抗体的恒定区（Fc区）结合。抗体在肿瘤细胞与表达Fc受体的效应细胞之间起到桥梁作用，从而触发效应细胞释放细胞毒性介质10。自然杀伤细胞释放其颗粒中的细胞毒性内容物，其中包括穿孔素，在靶细胞膜上形成孔道，以及颗粒酶（激活细胞死亡信号通路），进入免疫突触，最终导致癌细胞发生凋亡（见图1）。

NK细胞通过FcγR和曲妥珠单抗与HER2相互作用靶向肿瘤的免疫治疗示意图。
图1：ADCC中的效应细胞与靶细胞相互作用。 效应NK细胞表面的Fcγ受体识别特异性结合肿瘤细胞表面HER2分子的抗HER2曲妥珠单抗抗体的Fc区。由此在两种细胞之间形成所谓的免疫突触，诱导效应细胞定向释放其细胞毒性颗粒。释放的穿孔素和颗粒酶分子最终导致靶细胞发生凋亡。请点击此处查看该图的放大版本。

已有多种检测方法被用于量化细胞毒性，包括抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用（ADCC）。其中的金标准是放射性铬释放法，该方法通过用放射性同位素51Cr标记靶细胞，并通过测定裂解靶细胞上清液中的放射性来量化ADCC11。由于放射性药物和废弃物在操作、储存和处置方面受到严格管制，存在明显问题，该方法在生命科学研究人员中已日益不受欢迎。此外，该方法也不适用于高通量应用。通过检测杀伤后靶细胞释放的酶（例如，乳酸脱氢酶）活性，可提供一种非放射性的51Cr检测替代方案12。然而，这些检测方法无法区分靶细胞与效应细胞的死亡。电细胞基底阻抗传感（ECIS）已被证明适用于ADCC的定量13，但大多数实验室缺乏ECIS设备，且该技术不适用于高通量应用/筛选。荧光标记细胞在许多细胞生物学检测中是一种广受欢迎的替代方法，常用于流式细胞术或基于酶标仪的应用14,15,16。然而，这些检测通常包含洗涤步骤，或在其他方面与高通量应用不兼容（例如，基于流式细胞术的技术）。一些理论上应适用于ADCC定量的常用细胞毒性检测方法，实际上无法可靠地测定ADCC效率13。近年来，随着荧光共聚焦显微镜的普及，基于图像的高内涵检测在生命科学的各个领域正变得越来越流行17。一方面，细胞成像设备如今已相当普及；另一方面，从所获取的图像中几乎可以提取无限多的形态学参数。因此，我们着手开发一种兼容高内涵筛选的ADCC检测方法，并证明其适用于化合物文库筛选。

本文介绍了一种基于成像的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性（ADCC）检测方法，并展示了如何将该检测用于高内涵筛选（HCS），以鉴定可调节ADCC活性的化合物。该模型基于JIMT-1乳腺癌靶细胞、CD16.176V.NK-92效应细胞以及人源化抗HER2单克隆抗体曲妥珠单抗（trastuzumab）。利用该方法，可筛选出能够增强自然杀伤（NK）细胞杀伤肿瘤作用的药物，或通过鉴定干扰ADCC过程的小分子化合物，深入理解NK细胞介导的ADCC作用机制。我们建议，生命科学研究人员在需要定量评估细胞介导的细胞毒性（尤其是ADCC）时，可将本检测方法应用于基础科学研究或药物开发。对于具备荧光成像设备并有一定定量图像分析经验的实验室，该检测方法可作为一种可行的替代方案。

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方案

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注意：实验流程的关键步骤见图2。

ADCC 方法示意图：曲妥珠单抗将 NK-92 细胞与 JIMT-1 EGFP 细胞共孵育，进行高内涵分析。
图 2：ADCC 筛选的工作流程。 将 JIMT-1-EGFP 靶细胞接种至 96 孔高内涵筛选板中，并用化合物文库中的药物处理。随后加入未标记的 NK（效应）细胞和曲妥珠单抗，在孵育 0 时间点和 3 小时后对孔板进行成像。ADCC 评估基于存活（贴壁）靶细胞数量的变化。请点击此处查看该图的放大版本。

1. HCS 平板的包被

  1. 用50 µL/孔的JIMT-1培养基（DMEM/F-12培养基，添加20%胎牛血清（FBS）、0.3 U/mL胰岛素（100 IU/mL，Humulin R）和1%青霉素-链霉素）包被96孔高内涵筛选（HSC）板。
  2. 将培养板放入CO2培养箱中孵育1小时。
    ​注意：包被对于使JIMT-1细胞贴附于培养板的玻璃表面至关重要。

2. JIMT-1 增强型绿色荧光蛋白（EGFP）细胞的接种

注意：表达EGFP的JIMT-1细胞系为本研究团队先前工作中构建18，细胞培养于含JIMT-1培养基（培养基成分见步骤1.1）的T25组织培养瓶中。

  1. 用 2 mL 无菌 PBS 清洗细胞。
  2. 向培养瓶中加入 1 mL 胰蛋白酶-EDTA 溶液，并将培养瓶放回 CO2 培养箱中孵育 10 分钟。
  3. 孵育结束后，轻敲培养瓶，检查 JIMT-1 细胞是否已脱落。
  4. 加入 2 mL JIMT-1 培养基终止消化，并将细胞悬液收集至 15 mL 离心管中。
  5. 使用 0.4% 台盼蓝染液（80 µL 染液 + 20 µL 细胞悬液）在布氏计数板中对细胞进行计数，并将细胞浓度调整至 133,000 个/mL。
  6. 从 96 孔板中吸除包被液（见步骤 1.2）。
  7. 用移液器向高内涵筛选板（HCS 板）的每孔加入 75 µL 细胞悬液（参见 材料表）。
  8. 将细胞置于 CO2 培养箱中，在 37 °C 下过夜培养，使其充分贴壁。

3. 使用化合物文库对 JIMT-1 EGFP 细胞进行预处理

  1. 吸弃 JIMT-1 细胞的培养基，每孔加入 50 µL 新鲜的 JIMT-1 培养基。将培养板转移至高通量筛选实验室。
    注意：使用液体处理机器人可使化合物文库的添加更高效且具有更好的重复性。
  2. 使用校准至 25 nL 体积的针工具，将化合物文库板中的待测化合物转移至检测板中。重复此步骤四次。经过四轮转移后，最终体积为 100 nL（最终浓度为 20 µM）。
  3. 每步操作之间，先用 50% DMSO 清洗针工具，再用 70% 乙醇清洗。
  4. 将培养板置于 37 °C 的 CO2 培养箱中孵育 1 小时。

4. 通过添加效应细胞启动ADCC实验

注意：CD16.176V.NK92 细胞（下文简称 NK92 细胞）在添加了 20% FBS、1% MEM-NEAA、1% 丙酮酸钠、1% 谷氨酰胺、1% 青霉素-链霉素和 100 IU/mL IL-2 的 α-MEM 培养基中培养。

  1. 用台盼蓝计数NK92细胞（80 µL染料 + 20 µL细胞悬液），调整细胞密度至400,000个细胞/mL。
  2. 将4 mL细胞悬液在室温下以150 × g 离心3分钟。
  3. 通过向JIMT-1培养基中加入20 µg/mL抗HER2抗体（曲妥珠单抗）制备ADCC培养基。
  4. 用5 mL ADCC培养基重悬NK细胞沉淀。
  5. 将50 µL ADCC培养基中的20,000个NK细胞加入靶向JIMT-1细胞中，终体积为100 µL，终浓度为10 µg/mL曲妥珠单抗。
  6. 将检测板放入内置孵育器的高内涵分析设备中，孵育条件设为37 °C。

5. 成像

注意：应在两个时间点对培养板进行成像，第一次是在效应细胞加入靶细胞后立即进行，第二次是在自然杀伤（NK）细胞加入后3小时进行。成像可使用高内涵分析仪及其配套软件或合适的替代设备（参见材料表）。

  1. 从培养板列表中选择培养板类型（96孔细胞载体超薄板）。
  2. 若在培养板中进行检测，请选择双峰自动对焦。
  3. 使用10倍物镜，非共聚焦模式。
  4. 选择2×2 binning，以使信噪比提高一倍。
  5. 在650–760 nm波长下采集明场图像，并在488 nm（激发）和500–550 nm（发射）波长下采集EGFP转导的JIMT-1细胞的荧光图像。
  6. 选择成像的视野数和时间点数。

6. 图像分析

注意：为了分析抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用（ADCC）效率，需对存活的 JIMT-1 细胞进行计数。被 ADCC 杀死的靶细胞会从培养表面脱落并移出显微镜的焦平面。因此，ADCC 反应开始和结束时存活细胞数量的差值即为通过 ADCC 被清除的靶细胞数量。视频中展示了一个对照 ADCC 孔，以说明如何建立评估序列。

  1. 使用查找细胞模块检测图像上对应于细胞的区域。
    注意：每个细胞在图像上被识别为荧光强度高于其周围区域的区域。
  2. 使用内置的M算法选择细胞，设定最小直径为80 µm。
  3. 将分割灵敏度（用于将大对象分割为较小对象）设置为0.5。
  4. 将通用阈值（像素强度的最低水平）设置为0。
  5. 通过两个步骤排除具有高EGFP荧光强度的背景区域的检测。
    1. 首先，使用计算强度属性功能确定先前选定的细胞区域中的EGFP荧光强度。
    2. 使用选择群体选项设置最小和最大强度阈值。

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结果

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为了展示该检测方法在实际中的应用，我们从实验室货架上随机选取了16种化合物，构建了一个测试化合物库（图3）。此外，还加入了DMSO作为阴性对照，以及三种微管聚合抑制剂（秋水仙碱、长春新碱和鬼臼毒素）作为阳性对照。后三者预期可通过干扰自然杀伤（NK）细胞向癌细胞的迁移及NK细胞的脱颗粒过程来抑制抗体依赖性细胞介导的细胞毒性（ADCC）。所有测试化合物及DMSO均以四复孔形式加入测试化合物库板中，同时在板的第一列和最后一列也加入了DMSO（图3）。

用于化合物及位置的药物筛选板布局。化学测试的实验设置。

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讨论

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ADCC 反应早在较长时间前就已被描述，该过程的关键分子事件也已被阐明。19测量抗体依赖性细胞介导的细胞毒性（ADCC）的方法包括经典的放射性铬释放实验、胞质酶释放实验，以及多种基于荧光的流式细胞术或微孔板检测方法。20然而，这些检测方法的一个常见局限性是难以适用于高通量应用。此前，我们开发了一种基于成像的高内涵筛选（HCS）检测方法，适用于筛选可调节抗体依赖性细胞介导的细胞毒性（ADCC）的化合物库18然而，先前开发的检测方法存在一个主要缺陷 即，需要一个洗涤步骤，因为靶细胞必须预先用钙黄绿素-乙酰氧基甲酯（calcein-acetoxymethyl ester）染色，并且在加入NK细胞和曲妥珠单抗之前必须去除多余的染料。当前的方法代表了该检测的改进版本，即使用EGFP转导的JIMT-1细胞，可在无需染色和洗涤步骤的情况下直接区分效应细胞与靶细胞。此外，还必须注意到本检测的一个特点：无法区分死亡细胞与正在死亡但尚未完全脱落的细胞。此外，测试化合物可能会增强细胞黏附，导致细胞碎...

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披露

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作者声明无利益冲突。

致谢

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LV 获得了匈牙利国家研究、开发与创新办公室资助项目 GINOP-2.3.2-15-2016-00010 TUMORDNS"、GINOP-2.3.2-15-2016-00048-STAYALIVE 以及 OTKA K132193、K147482 的支持。CD16.176V.NK-92 细胞由 Kerry S. Campbell 博士（美国宾夕法尼亚州福克斯蔡斯癌症中心，代表加州圣地亚哥 Brink Biologics 公司）提供，该细胞系受全球专利保护，并已授权给 Nantkwest 公司使用。作者感谢 György Vereb 和 Árpád Szöőr 在 NK-92 细胞系使用及技术建议方面提供的帮助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
5-氟尿嘧啶ApplichemA7686在化合物库中
96孔 Cell Carrier Ultra 板PerkinElmerLLC 6055302
桦木醇SigmaB9757在化合物库中
CD16.176V.NK92 细胞Nankwest Inc. 
链霉菌素ChemCruzsc-396822在化合物库中
顺铂Santa Cruz Biotechnologysc-200896在化合物库中
秋水仙碱SigmaC9754在化合物库中
刀豆蛋白ACalbiochem234567在化合物库中
地塞米松SigmaD4902在化合物库中
DMEM/F-12 培养基SigmaD8437在 JIMT-1 EGFP 培养基中
DMSOSigmaD2650在化合物库中
依托泊苷SigmaE1383E1383
胎牛血清（FBS）BioseraFB-1090/500JIMT-1 EGFP 和 NK 培养基
非瑟酮SigmaF4043在化合物库中
Freedom EVO 液体处理机器人TECAN
没食子鞣酸Fluka Chemical Corp.16201在化合物库中
谷氨酰胺Gibco35,050–061在 NK 培养基中
Harmony 软件 PerkinElmer
人源化抗 HER2 单克隆抗体（Herzuma）EGIS Pharmaceuticals, Budapest HungaryN/A
Humulin R（胰岛素）Eli LillyHI0219在 JIMT-1 EGFP 培养基中
IL-2Novartis Hungária Kft.PHC0026在 NK 培养基中
异靛蓝Sigma114618在化合物库中
MEM 非必需氨基酸（MEM-NEAA）Gibco11,140–050在 NK 培养基中
丙酮酸钠LonzaBE13-115E在 NK 培养基中
柚皮素SigmaN5893在化合物库中
NQDI-1SigmaSML0185在化合物库中
Opera Phenix 高内涵分析设备PerkinElmer
青霉素–链霉素BioseraLM-A4118JIMT-1 EGFP 和 NK 培养基
己酮可可碱SigmaP1784在化合物库中
磷酸盐缓冲液（PBS）LonzaBE17-517Q用于洗涤细胞
鬼臼毒素SigmaP4405在化合物库中
槲皮素SigmaQ4951在化合物库中
单宁酸SigmaT8406在化合物库中
替莫唑胺SigmaT2577在化合物库中
0.4% 台盼蓝溶液SigmaT8154用于细胞计数
硫酸长春新碱SigmaV0400000在化合物库中
α-MEMSigmaM8042在 NK 培养基中

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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标签

NK HER2 ADCC

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