高内涵筛选实验用于鉴定抗体依赖性细胞介导的细胞毒性调节化合物

摘要

本方案介绍了一种自动化的、基于图像的高通量技术，用于在存在治疗性抗 HER-2 抗体的情况下，筛选能够调节自然杀伤细胞介导的乳腺癌细胞杀伤作用的化合物。

摘要

使用抗原特异性抗体或免疫检查点抑制剂的免疫治疗已彻底改变了乳腺癌的治疗方式。表达表皮生长因子受体HER2的乳腺癌细胞可被抗HER-2抗体曲妥珠单抗（trastuzumab）靶向识别。抗体依赖性细胞介导的细胞毒性（ADCC）是介导HER-2抗肿瘤作用的重要机制。与癌细胞结合的曲妥珠单抗可被ADCC效应细胞表面的Fc受体识别例如，自然杀伤（NK）细胞、巨噬细胞和粒细胞），从而触发这些免疫细胞的细胞毒活性，导致癌细胞死亡。我们旨在建立一种基于成像的检测方法，用于定量抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用（ADCC），并通过高内涵筛选鉴定新型ADCC调节化合物。在该检测中，将过表达HER2的JIMT-1乳腺癌细胞与NK-92细胞在曲妥珠单抗存在下共培养，通过自动化显微镜和定量图像分析来量化靶细胞的死亡。靶细胞与效应细胞根据其EGFP荧光信号进行区分。我们展示了如何在该检测中测试化合物文库，以鉴定ADCC调节药物。为此，使用实验室现有试剂中随机选取的精细化学品构建了一个化合物文库测试板。测试文库中还包含了三种预期会干扰NK细胞迁移和脱颗粒的微管去稳定化化合物（秋水仙碱、长春新碱、鬼臼毒素）。测试筛选将这三种阳性对照化合物均识别为有效命中，验证了该方法适用于从化学文库中鉴定ADCC调节药物。利用该检测方法，可对化合物文库进行筛选，以发现能够增强ADCC的化合物，这些化合物有望作为佐剂治疗药物，用于接受抗癌免疫治疗的患者。此外，该方法还可用于识别癌症患者因不同适应症而使用的治疗药物中可能存在的不良ADCC抑制副作用。

引言

使用抗癌抗体、免疫检查点抑制剂或表达嵌合抗原受体的T细胞（CAR-T细胞）进行免疫治疗，是癌症治疗的一种强有力手段^1,2,3。曲妥珠单抗是一种人源化的抗HER-2（人表皮生长因子受体2）单克隆抗体，用于治疗HER-2阳性的早期或转移性乳腺癌，以及HER-2阳性的转移性胃癌^4,5,6。其主要作用机制是抑制表皮生长因子的促增殖效应⁴。然而有研究报道，即使癌细胞已失去对HER-2信号刺激的响应能力，曲妥珠单抗仍能有效诱导癌细胞死亡⁷。这种看似矛盾的作用效应归因于抗体依赖性细胞介导的细胞毒性（ADCC）⁷。ADCC可由自然杀伤（NK）细胞、粒细胞和巨噬细胞介导，这些细胞统称为ADCC的效应细胞^8,9。当抗体（如曲妥珠单抗）与肿瘤细胞结合后，这些效应细胞通过其Fc受体识别并结合抗体的恒定区（Fc区）。抗体在肿瘤细胞....

方案

注意：实验流程的关键步骤见图2。

图 2：ADCC 筛选的工作流程。 将 JIMT-1-EGFP 靶细胞接种至 96 孔高内涵筛选板中，并用化合物文库中的药物进行处理。随后加入未标记的 NK（效应）细胞和曲妥珠单抗，在孵育 0 时间点及孵育 3 小时后对孔板进行成像。ADCC 评估基于存活（贴壁）靶细胞数量的变化。请点击此处查看该图的放大版本。

1. HCS 平板的包被

....

结果

为了演示该检测方法在实际中的应用，我们从实验室的试剂架上随机选取了16种化合物，构建了一个测试化合物库（图3）。此外，还加入了DMSO作为阴性对照，以及三种微管蛋白聚合抑制剂（秋水仙碱、长春新碱和鬼臼毒素）作为阳性对照。后三者预期可通过干扰自然杀伤（NK）细胞向癌细胞的迁移及其脱颗粒过程来抑制抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用（ADCC）。所有测试化合物及DMSO均以四复孔形式加入测试化合物库板中，同时在板的首列和末列也加入了DMSO（图3）。

讨论

ADCC 反应早在较长时间前就已被描述，该过程的关键分子事件也已被阐明。¹⁹测量抗体依赖性细胞介导的细胞毒性（ADCC）的方法包括经典的放射性铬释放实验、胞质酶释放实验，以及多种基于荧光的流式细胞术或微孔板检测方法。²⁰然而，这些检测方法的一个常见局限性是难以适用于高通量应用。此前，我们开发了一种基于成像的高内涵筛选（HCS）检测方法，适用于筛选可调节抗体依赖性细胞介导的细胞毒性（ADCC）的化合物库¹⁸然而，先前开发的检测方法存在一个主要缺陷 即，需要一个洗涤步骤，因为靶细胞必须预先用钙黄绿素-乙酰氧基甲酯（calcein-acetoxymethyl ester）染色，并且在加入NK细胞和曲妥珠单抗之前必须去除多余的染料。当前的方法代表了该检测的改进版本，即使用EGFP转导的JIMT-1细胞，可在无需染色和洗涤步骤的情况下直接区分效应细胞与靶细胞。此外，还必须注意到本检测的一个特点：无法区分死亡细胞与正在死亡但尚未完全脱落的细胞。此外，测试化合物可能会增强细胞黏附，导致细胞碎.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
5-氟尿嘧啶	Applichem	A7686	在化合物库中
96孔 Cell Carrier Ultra 板	PerkinElmer	LLC 6055302
桦木醇	Sigma	B9757	在化合物库中
CD16.176V.NK92 细胞	Nankwest Inc.
链霉菌素	ChemCruz	sc-396822	在化合物库中
顺铂	Santa Cruz Biotechnology	sc-200896	在化合物库中
秋水仙碱	Sigma	C9754	在化合物库中
刀豆蛋白A	Calbiochem	234567	在化合物库中
地塞米松	Sigma	D4902	在化合物库中
DMEM/F-12 培养基	Sigma	D8437	在 JIMT-1 EGFP 培养基中
DMSO	Sigma	D2650	在化合物库中
依托泊苷	Sigma	E1383	E1383
胎牛血清（FBS）	Biosera	FB-1090/500	JIMT-1 EGFP 和 NK 培养基
非瑟酮	Sigma	F4043	在化合物库中
Freedom EVO 液体处理机器人	TECAN
没食子鞣酸	Fluka Chemical Corp.	16201	在化合物库中
谷氨酰胺	Gibco	35,050–061	在 NK 培养基中
Harmony 软件	PerkinElmer
人源化抗 HER2 单克隆抗体（Herzuma）	EGIS Pharmaceuticals, Budapest Hungary	N/A
Humulin R（胰岛素）	Eli Lilly	HI0219	在 JIMT-1 EGFP 培养基中
IL-2	Novartis Hungária Kft.	PHC0026	在 NK 培养基中
异靛蓝	Sigma	114618	在化合物库中
MEM 非必需氨基酸（MEM-NEAA）	Gibco	11,140–050	在 NK 培养基中
丙酮酸钠	Lonza	BE13-115E	在 NK 培养基中
柚皮素	Sigma	N5893	在化合物库中
NQDI-1	Sigma	SML0185	在化合物库中
Opera Phenix 高内涵分析设备	PerkinElmer
青霉素–链霉素	Biosera	LM-A4118	JIMT-1 EGFP 和 NK 培养基
己酮可可碱	Sigma	P1784	在化合物库中
磷酸盐缓冲液（PBS）	Lonza	BE17-517Q	用于洗涤细胞
鬼臼毒素	Sigma	P4405	在化合物库中
槲皮素	Sigma	Q4951	在化合物库中
单宁酸	Sigma	T8406	在化合物库中
替莫唑胺	Sigma	T2577	在化合物库中
0.4% 台盼蓝溶液	Sigma	T8154	用于细胞计数
硫酸长春新碱	Sigma	V0400000	在化合物库中
α-MEM	Sigma	M8042	在 NK 培养基中