用于鉴定抗体依赖性细胞毒性修饰化合物的高内涵筛选检测

Summary

该协议提供了一种自动化的、基于图像的高通量技术，用于在存在治疗性抗 HER-2 抗体的情况下鉴定调节自然杀伤细胞介导的乳腺癌细胞杀伤的化合物。

Abstract

使用抗原特异性抗体或免疫检查点抑制剂的免疫疗法彻底改变了乳腺癌的治疗。表达表皮生长因子受体HER2的乳腺癌细胞可以被抗HER-2抗体曲妥珠单抗靶向。抗体依赖性细胞毒性（ADCC）是HER-2抗肿瘤作用的重要机制。与癌细胞结合的曲妥珠单抗可以被ADCC效应细胞（例如自然杀伤（NK）细胞、巨噬细胞和粒细胞）的Fc受体识别，触发这些免疫细胞的细胞毒性活性，导致癌细胞死亡。我们着手开发一种用于定量ADCC的基于图像的检测方法，以通过高内涵筛选鉴定新型ADCC调节剂化合物。在该测定中，HER2过表达JIMT-1乳腺癌细胞在曲妥珠单抗存在下与NK-92细胞共培养，并通过自动显微镜和定量图像分析量化靶细胞死亡。根据其EGFP荧光将靶细胞与效应细胞区分开来。我们展示了如何在测定中测试化合物库以鉴定ADCC调节剂药物。为此，使用实验室货架上随机选择的精细化学品建立了一个化合物库测试板。测试库中还包括三种有望干扰NK细胞迁移和脱颗粒的微管不稳定化合物（秋水仙碱，长春新碱，鬼臼毒素）。测试筛选将所有三种阳性对照化合物鉴定为命中，证明该方法适用于鉴定化学库中的ADCC修饰药物。通过该测定，可以进行化合物库筛选以鉴定ADCC增强化合物，这些化合物可用作治疗接受抗癌免疫治疗的患者的辅助治疗剂。此外，该方法还可用于鉴定癌症患者针对不同适应症服用的治疗药物的任何不良ADCC抑制副作用。

Introduction

使用抗癌抗体、免疫检查点抑制剂或嵌合抗原受体表达 T （CAR-T） 细胞进行免疫治疗是癌症治疗的有力方法¹，^2，3。曲妥珠单抗是一种人源化单克隆抗HER-2（人表皮生长因子受体2）抗体，用于治疗HER-2阳性早期或转移性乳腺癌，以及HER-2阳性转移性胃癌⁴，^5，6。它主要通过抑制表皮生长因子⁴的增殖刺激作用起作用。然而，据报道，曲妥珠单抗有效地触发癌细胞死亡，即使癌细胞已经失去了对 HER-2 刺激的反应性⁷。抗体的这种矛盾效应是由于抗体依赖性细胞介导的细胞毒性（ADCC）⁷。ADCC 可由自然杀伤 （NK） 细胞、粒细胞和巨噬细胞介导，统称为 ADCC^8，9 的效应细胞。如果抗体（如曲妥珠单抗）与肿瘤细胞结合，则这些效应细胞使用其Fc受体结合抗体的恒定（Fc）区域。抗体桥接肿瘤细胞和携带Fc受体的效....

Protocol

注意:检测工作流程的关键步骤如图 2所示。

图 2:ADCC 屏幕的工作流程。 接种到96孔HCS板中的JIMT-1-EGFP靶细胞用化合物库的药物处理。反过来，加入未染色的NK（效应）细胞和曲妥珠单抗，并在0时间点和孵育3小时后对板进行成像。ADCC评估基于活（表面贴壁）靶细胞数量的变化。 请点击此处查看此图的大图。

1. HCS板的涂层

1. 用 50 μL/孔 JIMT-1 培养基（补充有 20% 胎牛血清 （FBS）、0.3 U/mL 胰岛素（100 IU/mL、Humulin R 和 1% 青霉素-链霉素）的....

Results

为了演示该测定在现实生活中的工作原理，我们创建了一个测试库，其中包含从实验室货架中随机选择的16种化合物（图3）。此外，DMSO也作为阴性对照，三种微管聚合抑制剂化合物（秋水仙碱，长春新碱和鬼臼毒素）作为阳性对照。后者有望通过干扰NK细胞向癌细胞的迁移和NK细胞脱颗粒来抑制ADCC。将所有测试化合物和DMSO一式四份放置在测试文库板上，并将DMSO也添加到板的第一列和最后一列中（图3）。

图 3:用于测试 HCS ADCC 测定的化合物库。 （A） 显示了化合物库的板图。每种化合物一式两.......

Discussion

ADCC反应在很久以前就已经描述过了。该过程的关键分子事件也已描述¹⁹。测量ADCC的方法范围从金标准放射性铬释放测定，细胞质酶释放测定到几种基于荧光的流式细胞术或微孔板测定²⁰。然而，这些测定的一个常见局限性是它们不适合高通量应用。此前，我们开发了一种基于图像的HCS测定法，适用于筛选ADCC修饰药物的化合物库¹⁸。然而，先前开发的测定有一个主要缺点， 即它需要一个洗涤步骤，因为靶细胞必须用钙黄绿素-乙酰氧基甲基酯预染色，并且在加入NK细胞和曲妥珠单抗之前必须去除多余的染料。目前的方法代表了该测定的高级版本，因为使用EGFP转导的JIMT-1细胞允许直接区分效应细胞和靶细胞，而无需染色和洗涤步骤。此外，还必须意识到我们测定的特征，即它无法区分死亡和垂死细胞（尚未完全分离）。此外，测试化合物可能会增加细胞粘附，并且，因此细胞碎片可能残留在焦平面中，从而导致假阳性结果。此外，测试化合物的荧光特性可能会引起干扰。因此，尽管筛选通常运行一次，但强烈建议在其他类型的分析中也验证命中率。.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
化合物库中	5-氟尿嘧啶	Applichem	A7686
96 孔细胞载体 Ultra 板	PerkinElmer	LLC 6055302
白桦脂醇	Sigma	B9757	化合物库中
CD16.176V.NK92 细胞	Nankwest Inc.
库中	Cerulenin	ChemCruz	sc-396822
顺铂	Santa Cruz Biotechnology	库中	sc-200896
库中	秋水仙碱	Sigma	C9754
Concanavalin-A	库中	钙生化学	234567
地塞米松	Sigma	D4902	中化合物库
DMEM/F-12 培养基	Sigma	D8437	在 JIMT-1 EGFP 培养基
DMSO	Sigma	D2650	在化合物库中
依托泊苷	Sigma	E1383	E1383
胎牛血清 （FBS）	Biosera	FB-1090/500	JIMT-1 EGFP 和 NK 培养基
非瑟酮	Sigma	F4043	化合物库
Freedom EVO 液体处理机器人	TECAN
Gallotannin	Fluka Chemical Corp.	化合物库中	16201
谷氨酰胺	Gibco	35,050–NK	培养基
Harmony 软件	PerkinElmer
人源化抗 HER2 单克隆抗体 （Herzuma）	EGIS Pharmaceuticals，匈牙利布达佩斯	N/A
Humulin R（胰岛素）	Eli Lilly	HI0219	JIMT-1 EGFP 培养基
IL-2	Novartis Hungária Kft.	PHC0026	在 NK 培养基中
Isatin	Sigma	114618	在化合物库中
MEM 非必需氨基酸 （MEM-NEAA）	Gibco	11,140–050	在 NK 培养基中
Na-丙酮酸	Lonza	BE13-115E	在 NK 培养基中
柚皮素	Sigma	N5893	在化合物库中
NQDI-1	Sigma	SML0185	化合物库中
Opera Phenix 高内涵分析设备	PerkinElmer
青霉素–链霉素	Biosera	LM-A4118	JIMT-1、EGFP 和 NK 培养基
库中	Pentoxyfilline	Sigma	P1784
磷酸盐缓冲盐水 （PBS）	Lonza	BE17-517Q	洗涤细胞
鬼臼毒素	化合物	库中	P4405
库中
的槲皮素 Sigma Q4951单宁酸	Sigma	T8406	在化合物库中
替莫唑胺	Sigma	T2577	化合物库中
台盼蓝 0.4% 溶液	细胞计数	Sigma	T8154
化合物	Sigma	V0400000	库
α-MEM	Sigma	M8042	在 NK 培养基中