我们介绍了一种利用Hoxb5报告系统分离长期造血干细胞（LT-HSCs）和短期造血干细胞（ST-HSCs）的逐步实验方案。
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本文内容
摘要
摘要
自我更新能力和多谱系分化潜能通常被认为是造血干细胞（HSCs）的定义性特征。然而，大量研究表明，HSC细胞室中存在功能异质性。近期的单细胞分析报道了在HSC细胞室中具有不同细胞命运的HSC克隆，这些克隆被称为偏向性HSC克隆。目前对导致这些异质性或可重复性差的结果背后的机制仍知之甚少，尤其是在通过传统免疫染色方法移植纯化的HSC组分时，其自我更新持续时间的相关机制尚不明确。因此，建立一种可重复的方法来分离长期HSC（LT-HSCs）和短期HSC（ST-HSCs）， 即根据其自我更新持续时间来定义这两类细胞，对于解决这一问题至关重要。通过无偏倚的多步骤筛选，我们鉴定出一个转录因子Hoxb5，它可能是小鼠造血系统中LT-HSCs的特异性标志物。基于这一发现，我们构建了Hoxb5报告基因小鼠品系，并成功分离出LT-HSCs和ST-HSCs。本文详细描述了利用Hoxb5报告系统分离LT-HSCs和ST-HSCs的实验方案。该分离方法将有助于研究人员更深入地理解HSC细胞室中自我更新机制及其异质性的生物学基础。
引言
造血干细胞（HSCs）具有自我更新能力和多向分化潜能，位于造血 hierarchy 的顶端1,2。1988年，Weissman 及其同事首次证明可通过流式细胞术分离小鼠 HSCs3。随后，有研究报道，通过一组细胞表面标志物组合定义的细胞亚群——Lineage−c-Kit+Sca-1+CD150+CD34−/loFlk2−——包含小鼠体内全部的 HSCs4,5,6,7,8。
免疫表型定义的（Lineage−c-Kit+Sca-1+CD150+CD34−/loFlk2−）造血干细胞（以下简称 ....
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方案
所有所述动物实验均已获得理化学研究所生物系统动力学研究中心的批准。
1. 受体小鼠的预处理
- 准备8至10周龄的雄性C57BL/6同源小鼠作为受体小鼠。受体小鼠的数量取决于实验方案。我们通常为每种条件准备10至20只小鼠。
- 给予小鼠添加恩诺沙星（170 mg/L）的无菌水喂养。由于经照射的受体小鼠极易感染，应尽可能保持笼具清洁。
注意：抗生素补充应在照射前24小时开始，并持续至移植后3周，以预防感染。
- 给予小鼠添加恩诺沙星（170 mg/L）的无菌水喂养。由于经照射的受体小鼠极易感染，应尽可能保持笼具清洁。
- 全身照射
- 全身照射可破坏受体小鼠的骨髓细胞，以确保供体细胞成功植入。将受体小鼠转移至照射专用笼中。在移植前12至16小时，以单次8.7 Gy剂量进行致死性全身照射。
注意：辐射剂量和时间可能因设备而异。致死性辐射剂量应根据研究者所使用的照射仪和小鼠品系进行确认。 - 全身照射后，将小鼠放回原有笼具中。
- 全身照射可破坏受体小鼠的骨髓细胞，以确保供体细胞成功植入。将受体小鼠转移至照射专用笼中。在移植前12至16小时，以单次8.7 Gy剂量进行致死性全身照射。
2. 供体骨髓细胞的收集
- 准备一只12周龄的雄性Hoxb5-tri-mCherry小鼠，通过暴露于CO2后进行颈椎脱位，或采用当地动物伦理委员会批准的方法处死小鼠。
注意：每....
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结果
此前，自我更新能力通常通过竞争性移植实验进行测定，其中认为只有当在受体外周血中观察到多谱系的供体细胞时，供体造血干细胞（HSCs）才保留了其自我更新能力17。此外，已有若干研究报告将长期造血干细胞（LT-HSCs）定义为在第二次骨髓移植后数月仍能持续产生外周血细胞的细胞10,18。因此，为了比较其自我更新能力，将从Hoxb5报告小鼠中分离的10个Hoxb5pos或Hoxb5neg初代造血干细胞（pHSCs）与2 × 105个全骨髓细胞共同移植至致死剂量 irradiated 的初级受体小鼠体内。随后，在初次移植16周后，将初级受体小鼠骨髓中分离的1 × 107个骨髓细胞移植至致死剂量 irradiated 的次级受体小鼠体内，以评估其长期自我更新能力（图1）。图2
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讨论
传统上，人们通过细胞表面标志物来分离造血干细胞（HSCs），以研究其功能，例如自我更新能力和多向分化潜能19,20,21。然而，基于免疫表型定义的HSC群体（Lineage−c-Kit+Sca-1+CD150+CD34−/loFlk2−）实际上包含两种不同的HSC亚群：长期造血干细胞（LT-HSCs）和短期造血干细胞（ST-HSCs）9,10。因此，目前尚未实现对真正意义上的HSC——即LT-HSCs——的特异性分析。因此，利用Hoxb5报告系统分离LT-HSCs的方法将极大促进对自我更新能力分子机制的探索。
本.......
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披露
作者声明本研究无任何利益冲突。
致谢
我们衷心感谢日本理化学研究所生物发育研究中心（RIKEN BDR）的Hiroshi Kiyonari在动物饲养及提供受体小鼠方面的帮助，同时也感谢神户大学的Hitomi Oga、Kayoko Nagasaka和Masaki Miyahashi在实验室管理方面的工作。作者们还非常感谢各方对本研究工作的持续支持。宫西正德获得了日本学术振兴会（JSPS）科研费补助金（JP17K07407 和 JP20H03268）、Mochida 医药研究纪念财团、日本生命科学基金会、武田科学振兴财团、安斯泰来代谢疾病研究财团以及日本医疗研究开发机构（AMED）PRIME项目（资助编号 JP18gm6110020）的支持。坂巻太郎获得了日本学术振兴会（JSPS）科研费补助金（JP21K20669 和 JP22K16334）的支持，并曾获得JSPS核心-核心计划及理化学研究所青年研究者项目的支持。西克之获得了日本学术振兴会（JSPS）科研费补助金（JP18J13408）的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 0.2 mL 8联管，凸盖 | SSIbio | 3230-00 | |
| 0.5M EDTA pH 8.0 | Iinvtrogen | AM9260G | |
| 100 µm 细胞筛 | Falcon | 352360 | |
| 30G 胰岛素注射器 | BD | 326668 | |
| 40 µm 细胞筛 | Falcon | 352340 | |
| 5 mL 圆底聚苯乙烯试管，带细胞筛 snap cap | FALCON | 352235 | |
| 7-AAD 活性染色液 | BioLegend | 420404 | |
| 96孔U型底板 | FALCON | 351177 | |
| Anti-APC-MicroBeads | Milteny biotec | 130-090-855 | |
| 带捕集瓶的抽吸装置 | Biosan | FTA-1 | |
| B220-Alexa Fluor 700 (RA3-6B2) | BioLegend | 103232 | |
| B220-Biotin (RA3-6B2) | BioLegend | 103204 | |
| B220-BV786 (RA3-6B2) | BD Biosciences | 563894 | |
| B6.CD45.1 同源小鼠 | Sankyo Labo Service | N/A | |
| Baytril 10% | BAYER | 341106546 | |
| BD FACS Aria II 特殊订购系统 | BD | N/A | |
| Brilliant 染色缓冲液 | BD | 566349 | |
| CD11b-Alexa Fluor 700 (M1/70) | BioLegend | 101222 | |
| CD11b-Biotin (M1/70) | BioLegend | 101204 | |
| CD11b-BUV395 (M1/70) | BD Biosciences | 563553 | |
| CD11b-BV711 (M1/70) | BD Biosciences | 563168 | |
| CD127-Alexa Fluor 700 (A7R34) | Invitrogen | 56-1271-82 | |
| CD150-BV421 (TC15-12F12.2) | BioLegend | 115943 | |
| CD16/CD32-Alexa Fluor 700 (93) | Invitrogen | 56-0161-82 | |
| CD34-Alexa Fluor 647 (RAM34) | BD Biosciences | 560230 | |
| CD34-FITC (RAM34) | Invitrogen | 11034185 | |
| CD3-Alexa Fluor 700 (17A2) | BioLegend | 100216 | |
| CD3ε -Biotin (145-2C11) | BioLegend | 100304 | |
| CD3ε -BV421 (145-2C11) | BioLegend | 100341 | |
| CD45.1/CD45.2 同源小鼠 | N/A | N/A | 本实验室繁育 |
| CD45.1-FITC (A20) | BD Biosciences | 553775 | |
| CD45.2-PE (104) | BD Biosciences | 560695 | |
| CD4-Alexa Fluor 700 (GK1.5) | BioLegend | 100430 | |
| CD4-Biotin (GK1.5) | BioLegend | 100404 | |
| CD8a-Alexa Fluor 700 (53-6.7) | BioLegend | 100730 | |
| CD8a-Biotin (53-6.7) | BioLegend | 100704 | |
| 15 ml 离心管 | NICHIRYO | 00-ETS-CT-15 | |
| 50 ml 离心管 | NICHIRYO | 00-ETS-CT-50 | |
| c-Kit-APC-eFluor780 (2B8) | Invitrogen | 47117182 | |
| D-PBS (-)，不含 Ca 和 Mg，液体 | Nacalai | 14249-24 | |
| 胎牛血清 | Thermo Fisher | 10270106 | |
| Flk2-PerCP-eFluor710 (A2F10) | eBioscience | 46135182 | |
| FlowJo 版本 10 | BD Biosciences | https://www.flowjo.com/solutions/flowjo | |
| Gmmacell 40 Exactor | Best theratronics | N/A | |
| Gr-1-Alexa Fluor 700 (RB6-8C5) | BioLegend | 108422 | |
| Gr-1-Biotin (RB6-8C5) | BioLegend | 108404 | |
| Hoxb5-tri-mCherry 小鼠（C57BL/6J 背景） | N/A | N/A | 本实验室繁育 |
| 大鼠血清来源 IgG，技术级，>=80% (SDS-PAGE)，缓冲水溶液 | Sigma-Aldrich | I8015-100MG | |
| 异氟烷 | Pfizer | 4987-114-13340-3 | |
| Kimwipes S200 | NIPPON PAPER CRECIA | 6-6689-01 | |
| LS 柱 | Milteny biotec | 130-042-401 | |
| 裂解缓冲液 | BD | 555899 | |
| MACS MultiStand | Milteny biotec | 130-042-303 | |
| 组织培养用多孔板（贴壁细胞用）6孔 | IWAKI | 3810-006 | |
| MidiMACS 分离器 | Milteny biotec | 130-042-302 | |
| 小鼠 Pie 笼 | Natsume Seisakusho | KN-331 | |
| 多功能冷冻离心机 | TOMY | EX-125 | |
| NARCOBIT-E (II) | Natsume Seisakusho | KN-1071-I | |
| NK-1.1-PerCP-Cy5.5 (PK136) | BioLegend | 108728 | |
| 青霉素-链霉素混合溶液 | nacalai | 26253-84 | |
| 瓷研钵 φ120mm 带研杵 | Asone | 6-549-03 | |
| Protein LoBind 1.5 mL 管 | Eppendorf | 22431081 | |
| Sca-I-BUV395 (D7) | BD Biosciences | 563990 | |
| 不锈钢手术刀片 | FastGene | FG-B2010 | |
| 链霉亲和素-BUV737 | BD Biosciences | 612775 | |
| SYTOX-red | Invitrogen | S34859 | |
| 小鼠尾静脉固定器（标准型） | Braintree | TV-150 STD | |
| TCRb-BV421 (H57-597) | BioLegend | 109230 | |
| Ter-119-Alexa Fluor 700 (TER-119) | BioLegend | 116220 | |
| Ter-119-Biotin (TER-119) | BioLegend | 116204 | |
| Terumo 5 ml 同轴鲁尔滑动注射器 | TERUMO | SS-05LZ | |
| Terumo 皮下注射针头 23G x 1 | TERUMO | NN-2325-R |
参考文献
- Weissman, I. L., Shizuru, J. A. The origins of the identification and isolation of hematopoietic stem cells, and their capability to induce donor-specific transplantation tolerance and treat autoimmune diseases. Blood. 112 (9), 3543-3553 (2008).
- Majeti, R., Park, C. Y., Weissman, I. L.
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