利用5-乙炔基-2'-脱氧尿苷掺入法测定酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的S期持续时间

摘要

我们描述了两种互补的实验方案，可准确测定S期持续时间 S. cerevisiae 使用EdU（一种胸苷类似物），其可被掺入 体内 并通过显微镜和流式细胞术利用点击化学进行检测。该方法可简便地表征DNA复制的持续时间，并发现突变体中被忽视的复制缺陷。

摘要

真核生物DNA复制是一个受到高度调控的过程，可确保细胞在染色体分离之前准确复制其遗传蓝图。由于DNA合成缺陷会导致染色体重排，监测DNA复制已成为理解基因组不稳定性基础的关键。酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）是研究细胞周期调控的经典模型，但一些关键的DNA复制参数，例如处于S期的细胞比例或S期持续时间，仍然难以确定。本实验方案利用短时间且无毒的5-乙炔基-2'-脱氧尿苷（EdU）脉冲标记，EdU是一种胸苷类似物，在经过基因工程改造表达TK-hENT1的酵母细胞中引入，随后通过点击化学反应进行检测，从而可在单细胞和群体水平上，利用显微镜和流式细胞术实现对DNA复制的高时空分辨率可视化与定量分析。该方法可识别酵母突变体在S期及细胞周期进程中的先前被忽视的缺陷，进而有助于鉴定对维持基因组稳定性至关重要的新因子。

引言

通过有丝分裂维持基因组稳定性，依赖于将一套完整且均等的染色体传递给两个子代细胞。这一过程依赖于在细胞周期各个阶段特定时间内精确完成一系列事件。在G₁期，多个复制起始许可因子（包括Cdc6¹）被招募，从而完成复制起始位点的许可。在S期，全基因组复制从多个活跃的复制起始位点启动，并由聚集在显微镜下可见的复制工厂（replication factories）中的复制机器执行²。在M期，复制完成的姐妹染色单体附着于有丝分裂纺锤体并实现双向取向，从而使其能够分离至有丝分裂细胞的两极³。各阶段的调控、正确完成及其持续时间对于维持基因组稳定性至关重要。事实上，任一阶段的过早退出均会导致基因组不稳定。例如，通过缺失芽殖酵母CDK抑制因子Sic1或过表达G₁期周期蛋白而引起的G₁期缩短，将影响后续S期的正常进行^4,5,6。因此，这些调控异常——无论是否伴随复制应激——会导致染色体断裂、重排以及错误分离^4,5,

方案

1. S. cerevisiae 细胞培养

注意：所用的酵母菌株列于表1中

注意：S期持续时间可通过不同方法进行监测。根据所要解决的问题，细胞可在G₁期阻滞之后以异步或同步方式培养。

1. 从异步生长的 S. cerevisiae 细胞中获取
   注意：该方法可用于测定异步生长细胞群体中处于 S 期的细胞百分比。通过测定倍增时间，可推算出 S 期（及其他时期）的持续时间。
   1. 将 S. cerevisiae 细胞接种于 10 mL 合成完全（SC）培养基中，起始细胞浓度较低（5 × 10⁴ 个细胞/mL），在 30 ˚C 下以 130 rpm 的转速振荡培养过夜。
      注意：细胞浓度使用细胞计数仪测定。为有效计算倍增时间，建议从仍处于对数生长期的过夜培养物中接种（即理想情况下浓度低于 2 × 10⁷ 个细胞/mL）。不建议在富含营养的培养基（YPD）中培养细胞，因为 EdU 检测效率较低。
   2. 次日，将细胞稀释至 20 mL 新鲜 SC 培养基中，终浓度为 5 × 10⁵ 个细胞/mL。
   3. 在 30 ˚C 下，将细胞置....

结果

为了确定S期持续时间，以及更广泛地确定G₁期和G₂ + M期的持续时间（方案步骤1.1），将S. cerevisiae W303野生型细胞（WT，表1）在SC培养基中异步培养7小时。每隔一小时监测细胞浓度，以确定倍增时间（图2B）。在该培养条件下，25 °C时计算得到的倍增时间为120分钟 ± 13分钟（表2）。当细胞处于对数生长期（2 × 10⁶–5 × 10⁶ 个细胞/mL）时，取一部分细胞用EdU（10 µM）脉冲标记5分钟，以区分处于S期的细胞，并确定处于G₁、S和G₂ + M期的细胞百分比。在双参数EdU-PI流式细胞术分析中观察到三个细胞群体（图1B）。通过对照实验确定EdU阴性与EdU阳性群体的分界，该对照实验中细胞未进行EdU脉冲标记，但仍进行了Click反应（

讨论

酵母是细胞周期研究的理想模式生物，但长期以来，由于其无法掺入外源核苷类似物（如用于标记DNA复制的BrdU），导致对其S期的表征受到阻碍。通过在酵母中高表达单纯疱疹病毒胸苷激酶（TK）并引入人源核苷转运蛋白（hENT），这一问题已基本得到解决^15,16。与BrdU相比，EdU具有更高的适用性，因其可通过小分子荧光叠氮化物与“点击化学”（Click chemistry）进行检测，适用于透化的酵母细胞，并可用于流式细胞术（FACS）分析，而抗BrdU抗体则难以实现这一点¹⁷。本文中，我们优化了TK-hENT1菌株中EdU标记与检测的实验条件，并证明利用该方案可通过FACS或显微镜定量检测此前难以发现的DNA复制缺陷。

在生物学研究中，使用可能干扰目标生物学机制的工具来研究该机制是一个常见问题。由于 EdU 具有已知的细胞毒性效应，我们筛选了在慢性暴露条件下对经基因改造的 TK-hENT1 菌株无毒的 EdU 浓度，发现 1.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
α-因子	Genescript	RP01002
牛血清白蛋白（BSA）	Euromedex	04-100--812-E
硫酸铜	Sigma	C1297
DAPI	Sigma	D9542
二磺酸-Cyanine5 叠氮化物（Cy5叠氮化物）	Interchim	FP-JV6320	可替代Alexa647-叠氮化物
Dy-530 叠氮化物	Dyomics	530-10
EdU（5-乙炔基-2’-脱氧尿苷）	Carbosynth	NE08701
无水乙醇	Carlo Erba reagents	P013A10D16	或等效产品
L-抗坏血酸	Sigma	A4544
碘化丙啶	Sigma	P4864
蛋白酶K	Euromedex	EU0090
RNase	SIGMA	R5000
Sytox Green	Invitrogen	S-7020
仪器
细胞计数仪	OLS	CASY
流式细胞仪	Agilent	NovoSampler Pro
摇床培养箱	Infors	444-4230	或等效产品
振荡水浴锅	Julabo	SW22	或等效产品
超声波破碎仪	Sonics	Vibra cell
宽场显微镜	Leica	THUNDER Imager	或等效产品