评估生物毒素对斑马鱼免疫细胞功能的影响

摘要

本方案描述了流式细胞术检测方法，可用于评估毒素暴露对斑马鱼白细胞不同亚群内吞功能的影响。在检测中使用特异性功能抑制剂，可区分发生改变的内吞机制。

摘要

多种生物毒素可能以有害浓度存在于水生环境中。蓝藻是一类多样化的原核微生物，可在水生环境中产生蓝藻毒素。这些生物毒素可能是肝毒素、皮肤毒素或神经毒素，可影响鱼类和哺乳动物。在高浓度下，这些化合物具有致命性；在非致死浓度下，它们则隐匿地发挥作用，影响免疫细胞功能。藻类产生的生物毒素包括微囊藻毒素和鱼腥藻毒素A。水生动物还可能摄食被肉毒梭菌（Clostridium botulinum）产生的肉毒神经毒素E型（BoNT/E）污染的物质，从而导致死亡或免疫功能下降。斑马鱼可用于研究毒素如何影响免疫细胞功能。在这些研究中，毒素暴露可在体内（in vivo）或体外（in vitro）进行。in vivo 研究先将斑马鱼暴露于毒素，然后分离细胞，该方法可揭示组织微环境对白细胞功能的影响。in vitro 研究则先分离细胞，再将细胞置于培养孔中进行毒素暴露。白细胞通过肾脏髓质提取后，经密度梯度离心获得。白细胞如何内化病原体由内吞机制决定。流式细胞术吞噬功能检测可用于判断毒素暴露是否改变了内吞机制。目前尚缺乏利用分离白细胞研究毒素导致免疫功能障碍机制的研究。本文所述方法将使实验室能够利用斑马鱼研究环境毒素降低免疫细胞内吞功能时所影响的相关机制。

引言

环境中存在多种生物毒素和免疫抑制剂。含有细菌毒素的藻类水华可出现在内陆水域，也可形成生物膜¹。蓝藻（蓝绿藻）天然存在于所有淡水生态系统中，近年来在淡水系统中的水华现象显著增加²。在特定条件下，蓝藻可产生对水生和陆生动物有害的毒素。这些毒素可能影响肝脏、皮肤和黏膜，和/或神经系统。蓝藻产生的两种化合物是微囊藻毒素和鱼腥藻毒素A。微囊藻毒素是一种环状七肽³。鱼腥藻毒素A是一种生物碱⁴。肉毒神经毒素E（BoNT/E）是另一种存在于水生系统中的毒素，由Clostridium botulinum产生，可被水生动物摄入⁵。

暴露于环境毒素会影响鱼类，同时也可能影响动物健康并增加疾病发生率⁶。了解这些毒素如何影响免疫细胞，对于评估接触这些物质所带来风险至关重要。斑马鱼是研究环境毒素对免疫细胞影响的理想模型⁷。建立一种利用流式细胞术和斑马鱼白细胞的研究方法具有重要意义。斑马鱼在生理上与人类具有相关性，该方法可广泛应用于从基础毒理学和免疫学到药物发现及发育生物学等多个研究领域。由于斑马鱼是水生生物，因此特别适用于研究水传播环境毒素的影响

方案

本方案已获得密西西比州立大学机构动物护理与使用委员会（MSU-IACUC）批准。本研究中使用的所有斑马鱼均来自一个纯合品系的种群。 rag1^-/- 密西西比州立大学（MSU）兽医学院无特定病原孵化场先前建立的突变型斑马鱼¹⁰野生型斑马鱼也在该孵化场中进行繁殖。在这些研究中，可进行毒素暴露实验。 体内 或 体外. 体内 研究中将斑马鱼暴露于毒素，随后分离白细胞，以揭示毒素与组织微环境之间的相互作用及其对白细胞功能的影响。 体外 研究将白细胞分离后，在培养孔中将细胞暴露于毒素。

1. 试剂与溶液的配制

1. 荧光激活细胞分选（FACS）缓冲液：（不含钙和镁的汉克斯平衡盐溶液（HBSS）+ 0.05% 牛血清白蛋白（BSA））（见材料表）。在细胞分离前新鲜配制。
2. 组织培养基（TCM）：使用添加谷氨酰胺和10%胎牛血清的RPMI-1640培养基（见材料表）。
3. 细胞松弛素D（CCD）：将市售产品（见材料表）用1 mL无水乙醇（200 proof）重悬，配制储备液。取20 μL储备液加入980 μL FACS缓冲液中，配制工作液，终浓度为2....

结果

内吞作用检测利用从密度梯度中分离的混合白细胞，并通过细胞大小和颗粒度对吞噬细胞和淋巴细胞进行圈选，以确定特定细胞机制是否因毒素暴露而发生改变。首先，根据细胞的大小和颗粒度对细胞进行圈选¹⁰。死亡、破碎或正在凋亡的细胞会显示在散点图的左下角，予以排除，不纳入吞噬作用分析。吞噬细胞圈选范围包括巨噬细胞、自然杀伤细胞（NK细胞）和粒细胞，而淋巴细胞圈选范围则包括淋巴细胞、具有吞噬功能的B细胞以及非特异性细胞毒细胞（NCCs）（图1）。

吞噬作用通过检测FITC标记颗粒的摄取来确定，使用蓝色激光在495 nm / 519 nm处读取荧光信号。通过扣除对照细胞和同型对照所发出的平均荧光强度（MFI），可消除背景自发荧光和非特异性结合荧光。每种抑制剂均应进行剂量-反应曲线实验，以确定其使用浓度。若经待测毒素处理的细胞在流式细胞术中的结果与经抑制剂处理的细胞结果相同，则表明该毒素产生类似效应，可能抑制了相同的内吞机制。若毒素与抑制剂的效应具有叠加性，则提示该毒素可能通过与抑制剂不同的机制抑.......

讨论

利用流式细胞术对斑马鱼白细胞进行分析，为深入研究免疫系统、评估环境毒素的影响以及推动毒理学研究提供了一种强大且多用途的方法。该方法能够快速有效地评估毒素对免疫细胞及免疫应答的作用。实验结果揭示了参与其中的体液因子，并提示了鱼类生理学和代谢过程与环境生物毒素之间的相互作用。本方案的总体流程如图4所示。

然而，这些方法也存在一定的局限性。与其他模式生物相比，制备用于流式细胞术的斑马鱼白细胞过程可能更为复杂。斑马鱼体型较小，限制了可用于分析的血液量以及白细胞的数量^9,10。这些操作需要将组织解离以获得单细胞悬液，而细胞活力可能影响结果的准确性。与小鼠等模型相比，可用于斑马鱼的免疫学工具种类较为有限，例如针对斑马鱼细胞标志物的特异性抗体就相对稀少。这一限制可能影响对斑马鱼白细胞进行深入分析的能力。此外，流式细胞术数据的解读需要专业知识，尤其是在处理复杂的免疫反应时。数据的误读可能导致错误的结论，特别是在环境毒素影响.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
10% 胎牛血清	Gibco	A3160501
14 mL 圆底离心管	BD Biosciences	352059
40 µm 细胞滤筛	Corning	07-201-430
5 mL 流式细胞术管	BD Biosciences	352235
50 mL 锥形离心管	Corning	14-959-49A
无水乙醇	Fisher	BP2818-500
自动细胞计数仪	Life Technologies Countess II FL		用于细胞活力研究
牛血清白蛋白（BSA）	Sigma	A3059
细胞松弛素 D（CCD）	Sigma	C8273-5MG
葡聚糖 40	Sigma	FD40-100MG
葡聚糖 70	Sigma	46945-100MG-F
Escherichia coli DH5α（或其他实验室常用细菌菌株）	New England Biolabs	C29871
乙二胺四乙酸（EDTA）	Sigma	ED4SS
流式分析软件	Novoacea 软件
流式细胞仪	Novocyte 3000
荧光素	Fluka BioChemica	46950
不含钙和镁的汉克斯平衡盐溶液	Sigma	H4891
Histopaque 1077	Sigma	10771-100ML
荧光黄	Sigma	L0259-25MG
甘露聚糖	Sigma	M7504-250MG
磷酸盐缓冲液	Sigma	P3813
含 GlutaMax 的 RPMI-1640 培养基	Gibco	61870036
统计学软件	SPSS
毒素
三卡因	Western Chemical Inc	NC0342409