量化原子力显微镜（AFM）探针尖端与样品表面之间的接触面积及施加的力，可实现纳米尺度力学性能的测定。本文讨论了在空气或液体环境中，对软质和硬质样品实施基于AFM悬臂梁的纳米压痕技术以测量弹性模量或其他纳米力学性能的最佳实践方法。
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本文内容
摘要
摘要
原子力显微镜（AFM）本质上是测量纳米尺度的AFM探针尖端与样品表面之间的相互作用。如果能够量化探针尖端施加的力及其与样品的接触面积，则有可能确定被测表面的纳米级力学性能（例如弹性模量或杨氏模量）。本文提供了开展基于AFM悬臂梁定量纳米压痕实验的详细步骤，并举例说明该技术如何应用于测定多种类型样品的弹性模量，范围从kPa到GPa，包括生理缓冲液中的活体间充质干细胞（MSCs）和细胞核、脱水后包埋在树脂中的火炬松横截面，以及不同成分的巴肯页岩。
此外，基于原子力显微镜（AFM）悬臂梁的纳米压痕技术被用于探测磷脂双分子层的破裂强度（即穿刺力）。本文讨论了该技术正确实施过程中涉及的重要实际因素，包括方法的选择与开发、探针的选取与校准、感兴趣区域的识别、样品的异质性、特征尺寸与长径比、针尖磨损、表面粗糙度，以及数据分析与测量统计。最后，展示了将AFM获得的纳米力学图谱与可提供元素组成附加信息的电子显微镜技术进行共定位分析的应用。
引言
理解材料的力学性能是工程领域中最基本且最重要的任务之一。对于块体材料性能的分析，已有多种方法可用于表征材料体系的力学性能，包括拉伸试验1、压缩试验2以及三点或四点弯曲（抗弯）试验3。尽管这些宏观尺度的测试能够提供有关块体材料性能的宝贵信息，但通常测试会进行至材料失效，因此属于破坏性测试。此外，这些方法缺乏足够的空间分辨率，无法精确研究当前许多备受关注的材料体系在微米和纳米尺度下的性能，例如薄膜材料、生物材料和纳米复合材料。为初步解决大规模力学测试存在的问题（主要是其破坏性），人们从矿物学中引入了显微硬度测试。硬度是指材料在特定条件下抵抗塑性变形的能力。通常，显微硬度测试使用一个刚性探针（通常由淬火钢或金刚石制成）压入材料表面，通过测量所产生的压痕深度和/或面积来确定材料的硬度。目前已发展出多种测试方法，包括维氏（Vickers）4、努氏（Knoop）5和布氏（Brinell）6硬度测试；这些方法均可反映材料在微米尺度下的硬度，但由于测试条件和定义不同，所得数据仅能在相同测试条件下进行比较。
仪器化纳米压痕技术的发展旨在改进所获得的相对数值 通过 各种显微硬度测试方法，提高力学....
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方案
注意：由于市面上可获得的原子力显微镜（AFM）种类繁多，且基于悬臂梁的纳米压痕技术所涉及的样品类型和应用范围广泛，因此以下实验方案在设计上具有一定的通用性，重点在于涵盖所有基于悬臂梁的纳米压痕实验所共有的基本步骤，而不依赖于特定仪器或制造商。鉴于此，作者假定读者已具备操作所选具体仪器进行基于悬臂梁纳米压痕实验的最基本知识。此外，除下文所述通用实验流程外，还提供了一份针对本研究中所用AFM仪器及软件（见材料表）的详细、分步的标准操作程序（SOP），专门用于液体环境中样品的悬臂梁基纳米压痕实验，作为补充材料提供。
1. 样品制备与仪器设置
- 以不改变目标区域机械性能为前提，对样品进行制备，尽量减少表面粗糙度（理想情况下为纳米级，约为预定压痕深度的1/10）并避免污染。
- 根据介质（即空气或液体）、预期模量、样品表面形貌及相关特征尺寸，选择适用于目标样品纳米压痕的合适原子力显微镜探针（参见 探针选择的考虑因素 在讨论部分）。将探针装入探针 holder（参见 材料表）并将探针支架连接到原子力显微镜扫描头。
- 在AFM软件中选择合适的纳米压痕模式，该模式应允许用户对各个斜坡（即力-位移曲线）进行独立控制。
注：具体模式会因不同原子力显微镜制造商及....
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结果
力-位移曲线
图7展示了在空气中对树脂包埋的湿地松样品进行纳米压痕实验所获得的典型近理想力-位移（F-D）曲线（图7A），以及在液体环境（磷酸盐缓冲盐水 [PBS]）中对间充质干细胞（MSC）细胞核进行实验所获得的曲线（图7B）。任何接触力学模型的应用都依赖于对初始针尖-样品接触点的准确且可靠的确定。因此，图7中F-D曲线在初始接触点前具有相对平坦、低噪声的基线，且接触段斜率平滑，非常适合用于分析以提取力学性能参数。插图中接近段曲线（蓝色轨迹）与相应拟合结果（绿色轨迹）之间良好的一致性也证明了这一点。
相反，用户在进行基于悬臂梁的纳米压痕实验时可能会遇到若干常见问题，从而导致获得非理想的力-位移（F-D）曲线。其中最常见的问题之一是在接触后立即出现探针尖端在开始斜坡加载前已与样品接触的情况（
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讨论
样品制备
对于在空气中进行的纳米压痕实验，常见的制备方法包括冷冻切片（例如组织样品）、研磨和/或抛光后进行超薄切片（例如树脂包埋的生物样品）、离子铣削或聚焦离子束制备（例如不适合抛光的半导体、多孔材料或混合硬度样品）、机械抛光或电化学抛光（例如金属合金），或薄膜沉积（例如原子层沉积、化学气相沉积、分子束外延）。目标是获得表面粗糙度极小的样品（理想情况下为纳米级，≤预期压痕深度的0.1倍）。使用上述许多方法制备的样品，可能需要随后用高纯度过滤溶剂（例如HPLC级）冲洗和/或超声处理，并用超高纯度（99.999%）氮气（N2）干燥，以去除颗粒碎屑。或者，可将片状材料（例如二维材料）或颗粒（例如纳米颗粒或微胶囊）通过旋涂或滴涂的方式从使用高纯度过滤溶剂配制的溶液中沉积到基底上。在这种情况下，目标是在样品任意随机区域的视野范围内，获得多个不重叠的片状物或颗粒，且表面密度适中。对于在液体中进行的纳米压痕测试（常用于需缓冲液维持活性的生物样品），必须将样品沉积或制备在具有光滑表面（纳米级表面粗糙度）的基底上（例如显微镜载玻片、培养皿或新剥离的绢云母云母）
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
所有原子力显微镜（AFM）实验均在博伊西州立大学表面科学实验室（SSL）完成。扫描电子显微镜（SEM）表征在博伊西州立大学材料表征中心（BSCMC）完成。本出版物中关于生物燃料原料的研究部分得到了美国能源部能效与可再生能源办公室生物能源技术办公室的支持，属于原料转化界面联盟（FCIC）项目，并由美国能源部爱达荷州运营办公室合同 DE-AC07-051ID14517 资助。细胞力学研究得到了美国国立卫生研究院（NIH）资助项目 AG059923、AR075803 和 P20GM109095，以及美国国家科学基金会（NSF）资助项目 1929188 和 2025505 的支持。模型脂双层系统的研究得到了美国国立卫生研究院（NIH）R01 EY030067 项目的资助。作者感谢 Elton Graugnard 博士提供了 图11 所示的合成图像。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 原子力显微镜 | Bruker | 维度图标 | 使用 Nanoscope 控制软件，包括 PeakForce 定量纳米力学映射 (PF-QNM)、快速力体积 (FFV) 和点触式斜坡实验工作区 |
| AtomicJ | 美国物理联合会 | https://doi.org/10.1063/1.4881683 | 基于 Java 的开源免费力曲线分析软件包，具有灵活性和强大功能。支持多种接触力学模型，如赫兹（Hertz）、斯内登（Sneddon）、DMT、JKR、毛吉斯（Maugis）以及圆锥或棱锥模型（包括钝化和截断形式）。提供多种初始接触点估算方法供选择。支持数据的批量处理及后续统计分析（如平均值、标准差、直方图、拟合优度等）。文献引用为：P. Hermanowicz, M. Sarna, K. Burda, and H. Gabry<图片 替代文本="公式 1" 源文本：src="/files/ftp_upload/64497/64497eq05.jpg" 样式="margin: auto;"/>, “AtomicJ：一款用于力曲线分析的开源软件” 科学仪器评论 85：063703（2014），https://doi.org/10.1063/1.4881683 |
| 缓冲液（PBS） | Fisher Chemical（NaCl），Sigma Aldrich（KCl），Fisher BioReagents（Na2HPO4 和 KH2PO4) | S271 (>99% 纯度 NaCl），P9541（>99% 纯度 KCl)，BP332>99% 纯度 Na2HPO4），BP362（>99% 纯度 KH2PO4) | 磷酸盐缓冲液（PBS）在实验室中配制而成，其成分为137 mM NaCl、2.7 mM KCl、10 mM Na2HPO4，以及 1.8 mM KH2PO4 溶于超纯水中。试剂使用分析天平称量，玻璃器皿先用肥皂和水清洗，随后在使用前立即进行高压灭菌。 |
| 氯仿 | |||
| 金刚石尖端原子力显微镜探针 | 布鲁克 | PDNISP | 预装的工厂校准立方角金刚石（E = 1140 GPa）尖端的原子力显微镜探针（标称 R = 40 nm）与不锈钢悬臂梁（标称 k = 225 N/m, f0 = 50 kHz）。弹簧常数在工厂测量（k = 256 N/m（探针编号：13435414）的探针，其校准数据（包括显示探针几何形状的原子力显微镜压痕图像）随探针一并提供。 |
| 金刚石超薄切片刀 | 硅藻 | Ultra 35° | 2.1 毫米宽度。在使用金刚石刀片进行最终表面制备之前，先使用标准玻璃刀对样品表面进行初步粗切 |
| 环氧树脂 | Gorilla Glue | 26853-31-6 | 环氧树脂与固化剂按1:1比例混合，取少量滴加于不锈钢样品载片（Ted Pella）上，粘附V1级白云母云母（Ted Pella），以制备用于磷脂膜制备的原子级平整表面。 |
| 乙醇 | |||
| LR White树脂，中等纯度（已催化） | 电子显微镜科学公司 | 14381 | 500 mL 瓶，批号 #150629 |
| 间充质干细胞（MSCs） | N/A | N/A | 用于纳米力学研究的MSCs是从8至10周龄雄性C57BL/6小鼠中分离的原代细胞，具体方法见Goelzer, M. et al.的描述。 "Lamin A/C 对脂肪生成的机械抑制作用并非必需" 国际分子科学杂志 22：6580（2021）doi:10.3390/ijms22126580 以及 Peister, A. 等人 "不同近交系小鼠骨髓来源的成体干细胞（MSCs）在表面表位、增殖速率及分化潜能方面存在差异" 血液 103：1662-1668（2004），doi:10.1182/blood-2003-09-3070。 |
| 模量标准 | Bruker | PFQNM-SMPKIT-12M | 使用过的HOPG（高定向热解石墨）E = 18 GPa）和PS（聚苯乙烯）E = 2.7 GPa）。还含有 2x PDMS（Tack 0， E = 2.5 MPa；初粘性 4， E = 3.5 MPa），PS-LDPE（E = 2.0/0.2 GPa)，熔融石英（E = 72.9 GPa），蓝宝石（E - 345 GPa）和针尖表征（钛粗糙度）样品。所有样品均预先安装在直径为12 mm的钢制圆盘（样品载片）上。 |
| 云母 | Ted Pella | 50-12 | 12 mm 直径，V1 级白云母云母 |
| Nanscope 分析 | 布鲁克 | 版本 2.0 | 免费的原子力显微镜（AFM）图像处理与分析软件包，但专为布鲁克（Bruker）AFM 设计，具有专有性或使用限制；类似功能亦可通过其他免费、跨平台的 AFM 图像处理与分析软件包实现，例如 Gwyddion、WSxM 等。该软件内置力曲线分析功能，但在力曲线分析方面，AtomicJ 具有更高的灵活性和更全面的功能（例如提供更多内置的接触力学模型选择、力曲线拟合结果的统计分析等），并支持力曲线的批量处理。 |
| 磷脂：POPC、胆固醇（绵羊源） | Avanti Polar Lipids | POPC：CAS # 26853-31-6，胆固醇：CAS # 57-88-5 | 从供应商处获得溶于氯仿的POPC脂质（25 mg/mL），未经进一步纯化直接使用。同一家供应商提供的胆固醇粉末溶于氯仿（20 mg/mL）。 |
| 探针支架（流体、脂质双层） | 布鲁克 | MTFML-V2 | 特定于所使用的原子力显微镜；MTFML-V2 是用于在 MultiMode 原子力显微镜上进行液体环境中扫描的玻璃探针支架。 |
| 探针支架（流体，间充质干细胞） | 布鲁克 | FastScan Bio Z-扫描仪 | 与 Dimension FastScan 探头（XY 柔性扫描器）配合使用。序列号 MXYPOM5-1B154。 |
| 探针支架（标准型，常温） | Bruker | DAFMCH | 特定于所使用的原子力显微镜型号；DAFMCH 是 Dimension Icon 原子力显微镜的标准接触模式与轻敲模式探针 holder，适用于纳米压痕（PF-QNM、FFV 和定点射击 ramping） |
| 样品载具 | Ted Pella | 16218 | 产品编号适用于直径为15 mm的不锈钢样品载片。直径为6 mm、10 mm、12 mm和20 mm的型号也可在以下网址获取：https://www.tedpella.com/AFM_html/AFM.aspx#anchor842459 |
| 蓝宝石衬底 | Bruker | PFQNM-SMPKIT-12M | 极硬表面E = 345 GPa）用于测量探针的偏转灵敏度（确保所有偏转均来自探针本身，而非基底）。属于PF-QNM/模量标准套件的一部分。 |
| 扫描电子显微镜 | 日立 | S-3400N-II | 位于博伊西州立大学。用于对除增材制造（AM）Ti-6Al-4V以外的所有样品进行共定位SEM/EDS分析。 |
| 硅原子力显微镜探针（标准） | NuNano | Scout 350 | 标准轻敲模式硅探针，背面镀有反射铝层； k = 42 N/m（标称值）， f0 = 350 kHz。标称值 R = 5 nm。也可提供未涂层或带反射性金背涂层的探针。其他制造商也提供具有类似规格的探针（例如，Bruker TESPA-V2）。 |
| 硅制原子力显微镜探针（刚性） | 布鲁克 | RTESPA-525，RTESPA-525-30 | 带有反射性铝背侧涂层的旋转尖端蚀刻硅探针； k = 200 N/m（标称值）， f0 = 525 kHz。标称值 R = 8 nm（RTESPA-525） R = 30 nm（适用于 RTESPA-525-30）。每根 RTESPA-525-30 的弹簧常数均由工厂通过激光多普勒测振法单独测量，并随探针提供。 |
| 碳化硅砂纸（研磨圆盘） | 联合 | 50-10005 | 120目 |
| 氮化硅原子力显微镜探针（软质，大半径半球形针尖） | Bruker | MLCT-SPH-5UM，MLCT-SPH-5UM-DC | 也称为 MLCT-SPH-1UM-DC。新系列产品，由工厂校准（所有悬臂梁的探针半径和弹簧常数），大半径（R = 1 或 5 mm）半球形探针尖端（位于 23 mm 长圆柱形杆末端）。DC = 漂移补偿涂层。每根探针含 6 个悬臂梁（A–F）。标称弹簧常数：A， k = 0.07 N/m；B， k = 0.02 N/m；C， k = 0.01 N/m；D， k = 0.03 N/m；E， k = 0.1 N/m；F， k = 0.6 N/m。 |
| 氮化硅原子力显微镜探针（软质，中等尖锐针尖） | Bruker | DNP | 4 个悬臂/探针（A-d）。标称弹簧常数：A， k = 0.35 N/m；B， k = 0.12 N/m；C， k = 0.24 N/m；D， k = 0.06 N/m。标称曲率半径， R = 10 nm |
| 氮化硅原子力显微镜探针（软质，尖锐针尖） | 布鲁克 | ScanAsyst-Air | 标称值：共振频率， f0 = 70 kHz；弹簧常数， k = 0.4 N/m；曲率半径， R = 2 纳米。专为基于力曲线的原子力显微成像设计。 |
| 超级胶水 | 亨克尔 | Loctite 495 | 基于氰基丙烯酸酯的瞬干胶。许多性能相近的产品均可轻易获得。 |
| 注射泵 | New Era泵系统 | NE1000US | 单通道注射泵系统，具备输注和抽吸功能 |
| 尖端表征标准 | Bruker | PFQNM-SMPKIT-12M | 钛（Ti）粗糙度标准品。PF-QNM/模量标准品套件的组成部分。 |
| 超高纯度氮气（UHP N2), 99.999% | Norco | SPG TUHPNI - T | 用于样品干燥的超高纯度（99.999%）氮气T型压缩气瓶 |
| 超薄切片机 | Leica | EM UC6 | 配备玻璃刀片（标准型，用于初始样品制备）和金刚石刀片（用于最终制备） |
| 超纯水 | 赛默飞世尔科技 | Barnstead Nanopure Model 7146 | 型号已停产，但有等效产品可供选择。可产生 ≥18.2 MΩ含1-5 ppb TOC（总有机碳），通过在线紫外监测获得的超纯水，包含0.2 µ微粒过滤器、离子交换柱和紫外氧化室。 |
| 变速研磨机 | Buehler | EcoMet 3000 | 使用碳化硅砂纸进行手工抛光时采用。 |
| 主动式隔振台 | Herzan | TS-140 | 与Bruker MultiMode原子力显微镜联用。置于TMC 65-531减振台上。Bruker Dimension Icon原子力显微镜采用完全被动式减振系统（制造商提供定制声学罩、气浮台和花岗岩基座）。 |
| 被动式振动隔离台 | TMC | 65-531 | 35" × 30" 配备可选空气阻尼（已禁用）的隔振台。与Bruker MultiMode原子力显微镜联用。Herzan TS-140 "表稳定性" 主动振动控制台位于上方。 |
参考文献
- Hart, E. W. Theory of the tensile test. Acta Metallurgica. 15 (2), 351-355 (1967).
- Fell, J. T., Newton, J. M. Determination of tablet strength by the diametral-compression test. Journal of Pharmaceutical Sciences. 59 (5), 688-691 (1970).
- Babiak, M., Gaff, M.,....
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