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方法文章

基于原子力显微镜悬臂的纳米压痕技术：在空气与液体环境中进行纳米尺度力学性能测量

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DOI：

10.3791/64497

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2022年12月2日

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1Micron School of Materials Science & Engineering, Boise State University, 2Department of Mechanical & Biomedical Engineering, Boise State University, 3Department of Physics, Boise State University, 4Energy and Environmental Science and Technology, Idaho National Laboratory, 5Science and Technology, Idaho National Laboratory, 6Harold Hamm School of Geology & Geological Engineering, University of North Dakota, 7Biomolecular Sciences Graduate Program, Boise State University, 8Center for Advanced Energy Studies

本文内容

摘要

量化原子力显微镜（AFM）探针尖端与样品表面之间的接触面积及施加的力，可实现纳米尺度力学性能的测定。本文讨论了在空气或液体环境中，对软质和硬质样品实施基于AFM悬臂梁的纳米压痕技术以测量弹性模量或其他纳米力学性能的最佳实践方法。

摘要

原子力显微镜（AFM）本质上是测量纳米尺度的AFM探针尖端与样品表面之间的相互作用。如果能够量化探针尖端施加的力及其与样品的接触面积，则有可能确定被测表面的纳米级力学性能（例如弹性模量或杨氏模量）。本文提供了开展基于AFM悬臂梁定量纳米压痕实验的详细步骤，并举例说明该技术如何应用于测定多种类型样品的弹性模量，范围从kPa到GPa，包括生理缓冲液中的活体间充质干细胞（MSCs）和细胞核、脱水后包埋在树脂中的火炬松横截面，以及不同成分的巴肯页岩。

此外，基于原子力显微镜（AFM）悬臂梁的纳米压痕技术被用于探测磷脂双分子层的破裂强度（即穿刺力）。本文讨论了该技术正确实施过程中涉及的重要实际因素，包括方法的选择与开发、探针的选取与校准、感兴趣区域的识别、样品的异质性、特征尺寸与长径比、针尖磨损、表面粗糙度，以及数据分析与测量统计。最后，展示了将AFM获得的纳米力学图谱与可提供元素组成附加信息的电子显微镜技术进行共定位分析的应用。

引言

理解材料的力学性能是工程领域中最基本且最重要的任务之一。对于块体材料性能的分析，已有多种方法可用于表征材料体系的力学性能，包括拉伸试验1、压缩试验2以及三点或四点弯曲（抗弯）试验3。尽管这些宏观尺度的测试能够提供有关块体材料性能的宝贵信息，但通常测试会进行至材料失效，因此属于破坏性测试。此外，这些方法缺乏足够的空间分辨率，无法精确研究当前许多备受关注的材料体系在微米和纳米尺度下的性能，例如薄膜材料、生物材料和纳米复合材料。为初步解决大规模力学测试存在的问题（主要是其破坏性），人们从矿物学中引入了显微硬度测试。硬度是指材料在特定条件下抵抗塑性变形的能力。通常，显微硬度测试使用一个刚性探针（通常由淬火钢或金刚石制成）压入材料表面，通过测量所产生的压痕深度和/或面积来确定材料的硬度。目前已发展出多种测试方法，包括维氏（Vickers）4、努氏（Knoop）5和布氏（Brinell）6硬度测试；这些方法均可反映材料在微米尺度下的硬度，但由于测试条件和定义不同，所得数据仅能在相同测试条件下进行比较。

仪器化纳米压痕技术的发展旨在改进所获得的相对数值 通过 各种显微硬度测试方法，提高力学性能分析的空间分辨率，并实现对薄膜的分析。重要的是，通过采用 Oliver 和 Pharr 首次开发的方法7弹性模量或杨氏模量 E样品材料的，可以被测定 通过 仪器化纳米压痕。此外，通过使用Berkovich三面锥体纳米压头探针（其理想尖端面积函数与Vickers四面锥体探针相匹配）8，可以在纳米尺度与更传统的微米尺度硬度测量之间进行直接比较。随着原子力显微镜（AFM）的日益普及，基于AFM悬臂梁的纳米压痕技术也开始受到关注，尤其适用于测量较软材料的力学性能。因此，如示意图所示 图1目前用于研究和量化纳米尺度力学性能的两种最常用技术是仪器化纳米压痕（图1A以及基于原子力显微镜悬臂的纳米压痕（图1B)9后者是本研究的重点。

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图 1：压痕仪与基于原子力显微镜悬臂梁的纳米压痕系统的比较。 示意图展示了典型的（A）压痕仪纳米压痕系统和（B）基于原子力显微镜悬臂梁的纳米压痕系统。该图改编自 Qian 等人51。缩写：AFM = atomic force microscopy（原子力显微镜）。 请点击此处查看此图的放大版本。

仪器化纳米压痕和基于原子力显微镜（AFM）悬臂梁的纳米压痕均采用刚性探针对目标样品表面施加形变，并实时监测相应的力与位移变化。通常，用户可设定所需的载荷（即力）或（Z轴压电陶瓷）位移曲线 通过 软件界面并由仪器直接控制，而另一参数则被测量。纳米压痕实验中最常获得的力学性能是弹性模量（E），也称为杨氏模量，其单位为压力单位。材料的弹性模量是一个与键合刚度相关的基本属性，定义为拉伸或压缩应力与σ，单位面积上的作用力）与轴向应变（ε，压痕轴向上弹性变形（即，可逆或临时变形）期间的正比变形量）在塑性变形开始之前（公式[1]):

figure-introduction-2    （1）

需要注意的是，由于许多材料（尤其是生物组织）实际上具有黏弹性，因此在实际情况中，（动态或复数）模量包含弹性（储能，同相）和黏性（损耗，异相）两个组分。在实际操作中，纳米压痕实验所测量的是约化模量 E*，其与感兴趣的样品真实模量 E 之间的关系如公式（2）所示：

figure-introduction-3    （2）

其中，Etip 和 νtip 分别为纳米压痕探针的弹性模量和泊松比，ν 为样品的估计泊松比。泊松比是横向应变与轴向应变的负比值，因此可表示样品在受到轴向应变（例如纳米压痕加载过程中）时横向伸长的程度，如公式（3）所示：

figure-introduction-4    (3)

从约化模量转换为实际模量是必要的，因为 a）压头尖端施加的部分轴向应变可能会转化为横向应变（即样品可能发生变形） 通过 与加载方向垂直的膨胀或收缩），以及 b) 压头尖端并非无限坚硬，因此对样品进行压入时会导致尖端发生一定程度（微小）的变形。需注意，在以下情况下 E尖端 >> E （即压头尖端远比样品坚硬，这在使用金刚石探针时通常成立）， 约化模量与实际样品模量之间的关系大大简化为 E ≈ E*(1 - v2）。尽管仪器化纳米压痕在力的精确表征和动态范围方面更具优势，但基于原子力显微镜悬臂梁的纳米压痕技术速度更快，力和位移灵敏度高出数个数量级，可实现更高分辨率的成像和更精确的压痕定位，并能同时探测纳米尺度的磁学和电学性质。9特别是，基于原子力显微镜（AFM）悬臂梁的纳米压痕技术在量化软材料（如聚合物、凝胶、脂质双层、细胞或其他生物材料）以及极薄（亚微米）样品的纳米尺度力学性能方面具有显著优势。µm薄膜（其中基底效应可能根据压痕深度而产生影响）10,11，以及悬浮二维（2D）材料12,13,14 例如石墨烯15,16，云母17，六方氮化硼（h-BN）18，或过渡金属二硫属化物（TMDCs；例如，MoS2)19这是由于其卓越的力（亚纳牛）和位移（亚纳米）灵敏度，这对于准确确定初始接触点并保持在弹性变形区域内至关重要。

在基于原子力显微镜（AFM）悬臂梁的纳米压痕技术中，通过一个经过校准的压电元件驱动AFM探针向样品表面位移（图1B），当探针接触样品表面时，由于受到阻力作用，柔性悬臂梁会发生弯曲。这种悬臂梁的弯曲或偏转通常通过将一束激光反射至悬臂梁背面并进入光电探测器（位置敏感探测器[PSD]）进行监测。结合已知的悬臂梁刚度（单位为nN/nm）和偏转灵敏度（单位为nm/V），可将测得的悬臂梁偏转信号（单位为V）转换为施加在样品上的作用力（单位为nN）。接触发生后，Z方向压电陶瓷的位移与悬臂梁偏转之间的差值即为样品的压入深度。结合探针针尖面积函数的知识，可进一步计算出针尖与样品之间的接触面积。随后，可通过合适的接触力学模型（参见讨论部分的数据分析）对所得力-距离或力-位移（F-D）曲线中接触段的斜率进行拟合，从而确定样品的纳米力学性能。尽管如上所述，基于AFM悬臂梁的纳米压痕技术相较于仪器化纳米压痕具有一些明显优势，但在实际应用中仍面临若干挑战，例如校准、针尖磨损和数据分析等问题，本文将对此进行讨论。另一潜在局限在于线弹性假设，即要求接触半径和压入深度远小于压头半径；然而，在使用纳米尺度AFM探针和/或表面粗糙度较大的样品时，这一条件可能难以满足。

传统上，纳米压痕技术仅限于单个位置或小范围网格压痕实验，即选择一个目标位置（如感兴趣区域[ROI]），以赫兹（Hz）量级的速率进行单次受控压痕、在同一位置间隔一定时间的多次压痕，或进行粗略的压痕网格实验。然而，近年来原子力显微镜（AFM）技术的进步使得通过基于高速力-距离曲线的成像模式（根据系统制造商的不同，该模式有多种商品化名称）可同时获取样品的力学性能与表面形貌信息。在此类模式中，力-距离曲线在负载控制下以千赫兹（kHz）速率采集，以针尖-样品间最大作用力作为成像设定值。此外，点选式方法也已发展成熟，允许先获取AFM表面形貌图像，随后在图像中特定感兴趣位置进行选择性纳米压痕，从而实现对纳米压痕位置的纳米级空间控制。尽管这些方法并非本研究的主要关注点，但特定选择 应用实例 代表性结果中展示了基于力-距离曲线成像和点对点悬臂梁式纳米压痕技术的应用，若所使用的原子力显微镜（AFM）平台具备相应功能，可将这些方法与下述实验方案结合使用。本文具体阐述了一种通用的AFM悬臂梁式纳米压痕技术在任何具备相应功能的AFM系统上的实际操作流程，并提供了四项应用实例（两项在空气中，两项在液体环境中），包括代表性结果以及对技术细节、挑战和关键注意事项的深入讨论。

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方案

注意：由于市面上可获得的原子力显微镜（AFM）种类繁多，且基于悬臂梁的纳米压痕技术所涉及的样品类型和应用范围广泛，因此以下实验方案在设计上具有一定的通用性，重点在于涵盖所有基于悬臂梁的纳米压痕实验所共有的基本步骤，而不依赖于特定仪器或制造商。鉴于此，作者假定读者已具备操作所选具体仪器进行基于悬臂梁纳米压痕实验的最基本知识。此外，除下文所述通用实验流程外，还提供了一份针对本研究中所用AFM仪器及软件（见材料表）的详细、分步的标准操作程序（SOP），专门用于液体环境中样品的悬臂梁基纳米压痕实验，作为补充材料提供。

1. 样品制备与仪器设置

  1. 以不改变目标区域机械性能为前提，对样品进行制备，尽量减少表面粗糙度（理想情况下为纳米级，约为预定压痕深度的1/10）并避免污染。
  2. 根据介质（即空气或液体）、预期模量、样品表面形貌及相关特征尺寸，选择适用于目标样品纳米压痕的合适原子力显微镜探针（参见 探针选择的考虑因素 在讨论部分）。将探针装入探针 holder（参见 材料表）并将探针支架连接到原子力显微镜扫描头。
  3. 在AFM软件中选择合适的纳米压痕模式，该模式应允许用户对各个斜坡（即力-位移曲线）进行独立控制。
    注：具体模式会因不同原子力显微镜制造商及具体仪器而异（参见随附的标准操作程序 补充材料 有关更多细节和具体示例）。
  4. 将激光对准探针悬臂的背面，位置与探针尖端相对，并射入位置敏感探测器（PSD）。
    注意：参见间充质干细胞 应用示例 关于在液体环境中进行激光校准和纳米压痕实验时的重要注意事项的更多细节，特别是避免漂浮的碎屑和/或气泡，这些物质可能散射或折射激光束。此外，可能还需要调整原子力显微镜（AFM）的光学系统，以补偿液体的折射率，并防止探针在接触样品表面时发生碰撞。
    1. 通过最大化总和电压，将激光光斑居中对准悬臂梁背面图2A).
    2. 通过调节X和Y方向（即水平和垂直方向）的偏转信号，使反射激光束在PSD上的光斑居中，尽可能接近零值（图 2A从而提供可产生与悬臂梁偏转成正比的输出电压的最大可检测偏转范围。
  5. 若对样品形貌、表面粗糙度和/或表面密度（如片状或颗粒状样品）不确定，应在进行任何纳米压痕实验之前，按照步骤1.1及讨论部分中的样品制备说明，先执行原子力显微镜（AFM）形貌扫描调查，以确认样品是否适用。

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图2位置敏感探测器监测器 (A) PSD 显示表明激光已正确对准，从探针悬臂的背面反射并照射到 PSD 的中心（由较大的总电压以及无垂直或水平偏转所证明），此时探针尚未接触样品表面（即探针未与样品接触）。B当悬臂发生偏转时（例如探针与样品接触时），垂直偏转电压会增加。缩写：PSD = 位置敏感探测器；VERT = 垂直；HORIZ = 水平；AMPL = 振幅；n/a = 不适用 请点击此处以查看此图的放大版本。

2. 探针校准

注意：使用基于悬臂梁的纳米压痕过程中采集的力-距离（F-D）曲线数据来量化样品力学性能时，需要三个参数：悬臂梁/PSD 系统的偏转灵敏度（DS）（nm/V 或 V/nm）、悬臂梁弹簧常数（nN/nm）以及探针接触面积，后者通常以有效探针尖端半径（nm）表示，该半径对应于给定压入深度（小于球形探针尖端半径）下的情况。

  1. 通过在极硬材料（如蓝宝石）上进行 ramp 操作，校准探针/原子力显微镜系统的 DS E = 345 GPa），以最大限度地减少样品的形变，从而使得在针尖-样品接触开始后压电陶瓷在Z方向的运动完全转化为悬臂的弯曲。
    注意：DS 校准必须在与计划的纳米压痕实验相同的条件下（即温度、介质等）进行，以准确反映实验期间系统的 DS。为达到最高精度，可能需要较长的（30 分钟）激光预热时间，以确保系统达到热平衡，并建立稳定的激光输出功率和光束指向稳定性。必须重新测量 DS 每个 每次重新调整激光时，即使使用相同的探针，也必须重新校准，因为探测灵敏度（DS）取决于激光在悬臂上的强度和位置，以及探针反射质量（即探针背面涂层的退化会影响DS）和位置敏感探测器（PSD）的灵敏度。20.
    1. 设置并执行 DS 标定压痕 在蓝宝石上进行测试，以实现与计划中样品压痕相近的探针偏转（以 V 或 nm 为单位），因为测得的位移是探针尖端偏转角度的函数，在大偏转时会呈现非线性。
    2. 确定 DS （单位为 nm/V），或 alternatively，光杠杆灵敏度的倒数（单位为 V/nm），通过力-距离曲线中初始接触点之后的接触阶段线性部分的斜率确定，如图所示。 图3A.
    3. 至少重复进行5次斜坡测试，记录每次的DS值，并取平均值以获得最高准确性。如果测量值的相对标准偏差（RSD）超过约1%，则需重新测量DS值，因为前几次力-距离（F-D）曲线可能由于初始粘附力的引入而不理想。
    4. 如果探针悬臂的 弹簧常数, k，未进行工厂校准（例如 通过 激光多普勒测振法（LDV），校准弹簧常数。
      注意：热调谐法适用于相对较软的悬臂梁 k < 10 N/m（参见 弹簧常数 讨论部分列出了替代方法及其描述，特别是针对刚性悬臂梁的替代方案 k > 10 N/m）。如图所示 图3B，C，热调谐通常集成在AFM控制软件中。
  2. 如果探针未附带出厂校准的针尖半径测量值（例如 通过 扫描电子显微镜（SEM）成像，测量有效针尖半径， R.
    注意：测量的两种常用方法为 尖端半径 （参见相应的讨论部分），但纳米级探针尖端最常用的方法是盲尖重建法（BTR），该方法利用一个粗糙度标准（参见 材料表) 上存在大量极其尖锐（亚纳米级）的结构，这些结构会有效成像探针尖端，而非由探针尖端对样品进行成像。
    1. 若采用 BTR 方法，应使用慢扫描速率对粗糙度（探针表征）样品进行成像（<0.5 Hz）和高反馈增益，以优化对极尖锐特征的追踪效果。根据预期的针尖半径选择图像尺寸和像素密度（分辨率）（例如，对 3 µm x 3 µm 该区域将具有约3 nm的横向分辨率。
    2. 使用原子力显微镜图像分析软件（参见 材料表) 对探针尖端进行建模，并估算其在预期样品压入深度下的末端半径和有效尖端直径，如图所示 图3D- F.
  3. 完成探针校准后，输入 DS， k，以及 R 仪器软件中的数值，如图所示 图 4A.
    1. 输入样品泊松比的估计值， ν，以实现将测得的约化模量转换为样品的实际模量9. 若采用基于针尖形状和压痕深度的圆锥或圆台接触力学模型，则还需输入针尖半角（图 4C).
      注：该模量对估算的泊松比中的微小误差或不确定性相对不敏感。一个估算值 ν 0.2–0.3 是许多材料的良好起点21.

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图3：探针校准。（A）偏转灵敏度测定。在蓝宝石基底（E = 345 GPa）上对一支标准轻敲模式探针（标称 k = 42 N/m；参见材料表）进行典型偏转灵敏度测量的结果，该探针背面镀有反射性铝层。图中显示了测得的逼近（蓝色曲线）和回撤（红色曲线）过程。通过拟合从“接触跳跃”到“转向点”之间的逼近曲线（如两条垂直虚红线之间的区域所示），确定测得的偏转灵敏度为59.16 nm/V。在回撤/撤出曲线中，脱离表面之前出现的负向偏转区域表明针尖与样品之间存在粘附作用。（B,C）热调谐。 两种不同探针的典型悬臂梁热噪声谱（蓝色曲线）及其相应的拟合曲线（红色曲线）。（B）用于基于力曲线的AFM成像的标准探针（参见材料表）的热调谐设置及拟合参数，其标称弹簧常数 k = 0.4 N/m 作为初始估计值。对悬臂梁热噪声谱进行拟合得到其基本共振频率 f0 = 79.8 kHz，与标称值 f0 = 70 kHz 相比具有合理良好的一致性。测得的Q因子为58.1。拟合优度（R2 = 0.99）基于拟合曲线与数据在两条垂直红色虚线之间的吻合程度。需注意，为获得准确结果，必须准确输入环境温度和偏转灵敏度。（C）用于在活细胞和分离细胞核上进行纳米力学测量的极软悬臂梁的热噪声谱及其相应拟合（即热调谐），计算得到的弹簧常数 k = 0.105 N/m。注意其显著更低的固有共振频率，约为2–3 kHz。（D–F） 盲法针尖重构。对一支金刚石针尖探针（标称R = 40 nm；参见材料表）进行典型盲法针尖重构流程的示例。（D）针尖表征样品的5 µm × 5 µm图像，该样品由一系列极尖锐（亚纳米级）的钛尖刺组成，用于成像AFM探针针尖。（E）探针针尖的重构模型结果（倒置的高度图像）。（F）盲法针尖重构的拟合结果，包括在距针尖顶端8 nm（即压入深度 << R）的用户选定高度处估算的末端半径R = 29 nm，以及有效针尖直径40 nm；该有效直径是通过将该高度处的针尖-样品接触面积换算为假设圆形轮廓下的等效直径而计算得到的（即 A = πr2 = π(d/2)2），可用于球形接触力学模型。缩写：AFM = 原子力显微镜；ETD = 有效针尖直径。请点击此处查看此图的放大版本。

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图 4：软件界面输入。（A）探针校准常数。 软件用户界面（参见材料表），用于输入测得的偏转灵敏度、弹簧常数和针尖半径，以实现定量纳米力学测量。探针和样品的泊松比对于根据基于悬臂的纳米压痕力-位移曲线计算样品的弹性模量或杨氏模量是必需的。（B）斜坡控制窗口。 用于设置基于悬臂的纳米压痕实验的软件用户界面（参见材料表），其参数组织为描述斜坡本身（即压入轮廓）、仪器触发（如力控制与位移控制）、后续力分析以及运动限值（通过缩小A/D转换器在控制Z轴压电陶瓷和读取PSD偏转信号时的工作范围，以提高测量灵敏度）。（C）若采用圆锥形、金字塔形或圆锥球形接触力学模型（例如Sneddon模型），则针尖半角（基于探针几何结构或直接测量）至关重要。请点击此处查看此图的放大版本。

3. 采集力-位移（F-D）数据

注意：此处提供的参数值（见图4B）可能因样品所用的力和压痕范围不同而有所变化。

  1. 在AFM探头下移动样品，并定位到目标区域。
    1. 监测垂直偏转信号（图2B）或进行一次较小的初始 ramp（约 50–200 nm）图4B）以确认针尖与样品已接触（参见 图 5A).
    2. 轻微向上调整原子力显微镜（AFM）探头位置（每次调整步长约为完整 ramp 大小的 50%），然后再次进行 ramp。重复此过程，直至探针与样品恰好脱离接触，表现为 ramp 曲线接近平坦图5B）以及悬臂的最小垂直偏转图 2A).
    3. 当无明显针尖-样品相互作用时（比较 图2A 和 图2B），将原子力显微镜（AFM）探头降低至相当于斜坡尺寸约50%–100%的距离，以确保在手动移动AFM探头时探针尖端不会撞击样品。再次进行斜坡扫描，并重复此过程，直至获得一条良好的曲线（图 5D）或类似曲线 图5C 可观察到。在后一种情况下，再进行一次微小的AFM探头下降调节，幅度约为斜坡尺寸的20%-50%，以实现良好的接触，并获得类似于图中所示的力曲线 图 5D.
  2. 调整斜坡参数（如下所述并如图所示） 图 4B）以优化仪器、探针和样品，并获得与图示相似的梯度曲线 图 5D.
    1. 根据样品特性（如厚度、预期模量、表面粗糙度）和所需的压痕深度，选择合适的斜坡尺寸（即一个斜坡周期内Z轴压电位移的总量）。
      注意：对于较硬的样品，样品形变较小（因此在给定的Z轴压电陶瓷移动下探针偏转更大），通常可采用比软样品更小的扫描斜坡尺寸。对于较硬的样品和悬臂梁，典型的斜坡尺寸可能为几十纳米，而对于较软的样品和悬臂梁，斜坡尺寸可能为数百纳米至数个微米 µm 大小；特定选择 应用实例 在代表性结果部分中展示。请注意，最小和最大可能的斜坡尺寸取决于仪器。
    2. 选择合适的斜坡速率（对于大多数样品，1 Hz 是一个良好的起始点）。
      注意：斜坡速率可能受限于控制和/或检测电子元件的速度/带宽。结合斜坡大小，斜坡速率决定了针尖速度。在压入软材料时，针尖速度尤为重要，因为黏弹性效应可能引起滞后伪影。9,22.
    3. 选择使用触发式（载荷控制）或非触发式（位移控制）斜坡。
      注意：在触发式斜坡中，系统将以用户定义的步长（基于斜坡大小、分辨率或数据点数量）接近样品，直至检测到预设的触发阈值（即设定力或悬臂梁偏转），此时系统将退回至原始位置并显示力-距离（F-D）曲线。在非触发式斜坡中，系统仅将Z轴压电陶瓷延伸用户定义的斜坡距离，并显示测得的F-D曲线。大多数应用场景下推荐使用触发式斜坡，但在研究不具有明显且易于识别接触点的软材料时，非触发式斜坡可能更为适用。
      1. 如果一个 触发式斜坡 选择后，设置 触发阈值 （用户定义的斜坡最大允许作用力或偏转量）以在样品中产生所需的压痕深度。
        注意：使用触发阈值意味着斜坡过程可能在达到指定的完整斜坡尺寸（Z压电延伸）之前终止（即探针可能开始回缩）。该值范围可从几个 nN 到几个 µN，取决于针尖-样品系统。
      2. 设置 斜坡位置 用于确定将使用Z压电陶瓷最大行程的哪一部分来执行斜坡扫描。确保 斜坡尺寸的总范围 不在最大Z压电范围之外开始或结束（参见代表性示例于 图6），否则力-距离曲线的一部分将不反映任何物理测量值（即Z压电陶瓷将完全伸展或收缩而不再移动）。
    4. 设置 样本数量/斜坡 （例如，512 个样本/斜坡），以实现所需的测量分辨率（即，力-距离曲线的点密度）。
      注意：最大采样点数/斜坡可能受限于软件（文件大小）或硬件条件（例如模数 [A/D] 转换速度，取决于斜坡速率）。也可限制允许的Z压电或偏转范围（参见参数中的限值设置） 图 4B以提高系统模数转换器（A/D converter）的有效分辨率。
    5. 设置 X轴旋转 通过在 Z 方向（垂直于悬臂）压入的同时，使探针在 X 方向（平行于悬臂）轻微移动，以降低样品与针尖所受的剪切力。X 旋转参数应设为探针夹持器相对于表面法线的偏移角度。12° 是典型的。
      注意：X轴旋转是必要的，因为悬臂在探针支架上的安装角度相对于样品表面略倾斜，以便入射激光束能够反射至位置敏感检测器（PSD）。此外，探针尖端的前角与后角可能彼此不同（即探针尖端可能具有不对称性）。更具体的信息可从各探针和原子力显微镜（AFM）制造商处获取。

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图5：在探针接触样品后优化针尖-样品间距，以获得良好的力曲线。 在液体环境（磷酸盐缓冲盐水）中，使用经校准的软质氮化硅悬臂梁（标称 k = 0.04 N/m），其末端带有5 µm半球形探针尖端（见材料表），对活体间充质干细胞核进行压痕测试时获得的典型力-位移曲线的连续示例。这些曲线是在探针接近细胞表面并优化压痕参数过程中获取的，其中探针接近过程以蓝色表示，撤回过程以红色表示。（A）在开始压痕前，探针已与样品接触，导致悬臂梁产生较大偏转和作用力，且无平坦的接触前基线。（B）在手动将探针移至离样品足够远的位置后，执行未触发的2 µm压痕，得到的力-位移曲线几乎呈平坦状态（即力几乎无变化）。在空气中，曲线会更加平坦；但在液体中，由于介质的黏度，在压痕过程中即使未接触表面，也可能引起探针悬臂梁轻微偏转，如图所示。（C）在开始压痕前将探针略微靠近表面，接近和撤回曲线在压痕转向点附近（即从接近转为撤回的过渡点）表现出力的轻微增加（斜率增大）。需注意的关键特征是接近（蓝色）与撤回（红色）曲线开始重叠（黑色圆圈所示区域），表明探针与表面发生了物理相互作用。（D）在优化压痕参数并将探针进一步接近细胞表面（约比情况C更近1 µm）后获得的理想力-位移曲线，使探针在压痕过程中约一半时间与细胞保持接触，从而产生足够的形变，以便对接近阶段曲线的接触部分进行拟合，并确定弹性模量。相对较长、平坦且低噪声的基线有助于拟合算法更准确地确定接触点。缩写：F-D = 力-位移。请点击此处查看该图的放大版本。

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图6：斜面尺寸与位置。 Z压电监测器显示斜坡范围（蓝色条）相对于Z压电总可用移动范围（绿色条）的程度。AZ压电位置接近其运动范围的中间位置，这可通过蓝色条大致位于绿色条中间，以及当前Z压电电压（-78.0 V）大致介于完全收缩（-212.2 V）和完全伸展（+102.2 V）的电压值之间来判断。BZ压电元件相对于 A，未施加偏置电压。CZ压电元件相对于 A 和 B. (DZ压电位置与之前相同 C 在 -156.0 V 时，但相对于 A-C 以充分利用Z轴压电陶瓷的全部运动范围。 € 斜坡尺寸对于当前的斜坡位置过大，导致Z向压电陶瓷已伸展至其范围的极限。这将导致力-位移曲线（F-D曲线）变为平线，因为系统无法进一步伸展Z向压电陶瓷。缩写：F-D = 力-位移。 请点击此处以查看此图的放大版本。

4. 力-距离曲线分析

  1. 选择合适的数据分析软件包。选择并加载待分析的数据。
    注意：许多原子力显微镜（AFM）制造商及AFM图像处理软件均内置支持力-距离（F-D）曲线分析功能。此外，使用专用的F-D曲线分析软件包（例如开源的AtomicJ软件包）可能具有更高的灵活性和更多功能，从而带来优势。23，尤其适用于大规模数据集的批量处理与统计分析，或复杂接触力学模型的实现。
  2. 输入校准值以用于 弹簧常数, DS，以及 探针尖端半径，以及 估计值 的 杨氏模量 和 泊松比 对于 探针尖端 （根据其材料组成）以及 泊松比 样本的
    注意：如果使用金刚石压头，其数值 E尖端 = 1140 GPa 和 ν提示 = 0.07 可被使用21,24,25,26对于标准硅探针， E提示 = 170 GPa 和 ν尖端 = 0.27 通常可以使用，尽管硅的杨氏模量随晶体取向的不同而变化27.
  3. 选择适合探针和样品的纳米压痕接触力学模型。
    注意：对于大多数常见的球形针尖模型（如 Hertz、Maugis、DMT、JKR），压入样品的深度必须小于针尖半径；否则，探针针尖的球形几何形状将转变为圆锥形或棱锥形图 4C）。对于圆锥形（例如，Sneddon28）和锥形模型中，尖端半角（即尖端侧壁与垂直于尖端末端的平分线之间的夹角； 图4C）必须已知，通常可从探针制造商处获得。有关接触力学模型的更多信息，请参见 数据分析 讨论部分。
  4. 运行拟合算法。检查力-距离（F-D）曲线的拟合情况；残差误差应较低，对应平均 R2 接近于1（例如，R）2 > 0.9）通常表明与所选模型的拟合度良好29,30. 可选择性地对单个曲线进行抽样检查，以目视评估曲线形态、模型拟合情况以及计算得到的接触点（例如，参见 图7 以及 数据分析 讨论部分的章节）

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结果

力-位移曲线
图7展示了在空气中对树脂包埋的湿地松样品进行纳米压痕实验所获得的典型近理想力-位移（F-D）曲线（图7A），以及在液体环境（磷酸盐缓冲盐水 [PBS]）中对间充质干细胞（MSC）细胞核进行实验所获得的曲线（图7B）。任何接触力学模型的应用都依赖于对初始针尖-样品接触点的准确且可靠的确定。因此，图7中F-D曲线在初始接触点前具有相对平坦、低噪声的基线，且接触段斜率平滑，非常适合用于分析以提取力学性能参数。插图中接近段曲线（蓝色轨迹）与相应拟合结果（绿色轨迹）之间良好的一致性也证明了这一点。

相反，用户在进行基于悬臂梁的纳米压痕实验时可能会遇到若干常见问题，从而导致获得非理想的力-位移（F-D）曲线。其中最常见的问题之一是在接触后立即出现探针尖端在开始斜坡加载前已与样品接触的情况（

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讨论

样品制备
对于在空气中进行的纳米压痕实验，常见的制备方法包括冷冻切片（例如组织样品）、研磨和/或抛光后进行超薄切片（例如树脂包埋的生物样品）、离子铣削或聚焦离子束制备（例如不适合抛光的半导体、多孔材料或混合硬度样品）、机械抛光或电化学抛光（例如金属合金），或薄膜沉积（例如原子层沉积、化学气相沉积、分子束外延）。目标是获得表面粗糙度极小的样品（理想情况下为纳米级，≤预期压痕深度的0.1倍）。使用上述许多方法制备的样品，可能需要随后用高纯度过滤溶剂（例如HPLC级）冲洗和/或超声处理，并用超高纯度（99.999%）氮气（N2）干燥，以去除颗粒碎屑。或者，可将片状材料（例如二维材料）或颗粒（例如纳米颗粒或微胶囊）通过旋涂或滴涂的方式从使用高纯度过滤溶剂配制的溶液中沉积到基底上。在这种情况下，目标是在样品任意随机区域的视野范围内，获得多个不重叠的片状物或颗粒，且表面密度适中。对于在液体中进行的纳米压痕测试（常用于需缓冲液维持活性的生物样品），必须将样品沉积或制备在具有光滑表面（纳米级表面粗糙度）的基底上（例如显微镜载玻片、培养皿或新剥离的绢云母云母）

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

所有原子力显微镜（AFM）实验均在博伊西州立大学表面科学实验室（SSL）完成。扫描电子显微镜（SEM）表征在博伊西州立大学材料表征中心（BSCMC）完成。本出版物中关于生物燃料原料的研究部分得到了美国能源部能效与可再生能源办公室生物能源技术办公室的支持，属于原料转化界面联盟（FCIC）项目，并由美国能源部爱达荷州运营办公室合同 DE-AC07-051ID14517 资助。细胞力学研究得到了美国国立卫生研究院（NIH）资助项目 AG059923、AR075803 和 P20GM109095，以及美国国家科学基金会（NSF）资助项目 1929188 和 2025505 的支持。模型脂双层系统的研究得到了美国国立卫生研究院（NIH）R01 EY030067 项目的资助。作者感谢 Elton Graugnard 博士提供了 图11 所示的合成图像。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
原子力显微镜Bruker维度图标使用 Nanoscope 控制软件，包括 PeakForce 定量纳米力学映射 (PF-QNM)、快速力体积 (FFV) 和点触式斜坡实验工作区
AtomicJ美国物理联合会https://doi.org/10.1063/1.4881683基于 Java 的开源免费力曲线分析软件包，具有灵活性和强大功能。支持多种接触力学模型，如赫兹（Hertz）、斯内登（Sneddon）、DMT、JKR、毛吉斯（Maugis）以及圆锥或棱锥模型（包括钝化和截断形式）。提供多种初始接触点估算方法供选择。支持数据的批量处理及后续统计分析（如平均值、标准差、直方图、拟合优度等）。文献引用为：P. Hermanowicz, M. Sarna, K. Burda, and H. Gabry<图片 替代文本="公式 1" 源文本：src="/files/ftp_upload/64497/64497eq05.jpg" 样式="margin: auto;"/>, “AtomicJ：一款用于力曲线分析的开源软件” 科学仪器评论 85：063703（2014），https://doi.org/10.1063/1.4881683
缓冲液（PBS）Fisher Chemical（NaCl），Sigma Aldrich（KCl），Fisher BioReagents（Na2HPO4 和 KH2PO4)S271 (>99% 纯度 NaCl），P9541（>99% 纯度 KCl)，BP332>99% 纯度 Na2HPO4），BP362（>99% 纯度 KH2PO4)磷酸盐缓冲液（PBS）在实验室中配制而成，其成分为137 mM NaCl、2.7 mM KCl、10 mM Na2HPO4，以及 1.8 mM KH2PO4 溶于超纯水中。试剂使用分析天平称量，玻璃器皿先用肥皂和水清洗，随后在使用前立即进行高压灭菌。
氯仿
金刚石尖端原子力显微镜探针布鲁克PDNISP预装的工厂校准立方角金刚石（E = 1140 GPa）尖端的原子力显微镜探针（标称 R = 40 nm）与不锈钢悬臂梁（标称 k = 225 N/m, f0 = 50 kHz）。弹簧常数在工厂测量（k = 256 N/m（探针编号：13435414）的探针，其校准数据（包括显示探针几何形状的原子力显微镜压痕图像）随探针一并提供。
金刚石超薄切片刀硅藻Ultra 35°2.1 毫米宽度。在使用金刚石刀片进行最终表面制备之前，先使用标准玻璃刀对样品表面进行初步粗切
环氧树脂Gorilla Glue26853-31-6环氧树脂与固化剂按1:1比例混合，取少量滴加于不锈钢样品载片（Ted Pella）上，粘附V1级白云母云母（Ted Pella），以制备用于磷脂膜制备的原子级平整表面。
乙醇
LR White树脂，中等纯度（已催化）电子显微镜科学公司14381500 mL 瓶，批号 #150629
间充质干细胞（MSCs）N/AN/A用于纳米力学研究的MSCs是从8至10周龄雄性C57BL/6小鼠中分离的原代细胞，具体方法见Goelzer, M. et al.的描述。 "Lamin A/C 对脂肪生成的机械抑制作用并非必需" 国际分子科学杂志 22：6580（2021）doi:10.3390/ijms22126580 以及 Peister, A. 等人 "不同近交系小鼠骨髓来源的成体干细胞（MSCs）在表面表位、增殖速率及分化潜能方面存在差异" 血液 103：1662-1668（2004），doi:10.1182/blood-2003-09-3070。
模量标准BrukerPFQNM-SMPKIT-12M使用过的HOPG（高定向热解石墨）E = 18 GPa）和PS（聚苯乙烯）E = 2.7 GPa）。还含有 2x PDMS（Tack 0， E = 2.5 MPa；初粘性 4， E = 3.5 MPa），PS-LDPE（E = 2.0/0.2 GPa)，熔融石英（E = 72.9 GPa），蓝宝石（E - 345 GPa）和针尖表征（钛粗糙度）样品。所有样品均预先安装在直径为12 mm的钢制圆盘（样品载片）上。
云母Ted Pella50-1212 mm 直径，V1 级白云母云母
Nanscope 分析布鲁克版本 2.0免费的原子力显微镜（AFM）图像处理与分析软件包，但专为布鲁克（Bruker）AFM 设计，具有专有性或使用限制；类似功能亦可通过其他免费、跨平台的 AFM 图像处理与分析软件包实现，例如 Gwyddion、WSxM 等。该软件内置力曲线分析功能，但在力曲线分析方面，AtomicJ 具有更高的灵活性和更全面的功能（例如提供更多内置的接触力学模型选择、力曲线拟合结果的统计分析等），并支持力曲线的批量处理。
磷脂：POPC、胆固醇（绵羊源）Avanti Polar LipidsPOPC：CAS # 26853-31-6，胆固醇：CAS # 57-88-5从供应商处获得溶于氯仿的POPC脂质（25 mg/mL），未经进一步纯化直接使用。同一家供应商提供的胆固醇粉末溶于氯仿（20 mg/mL）。 
探针支架（流体、脂质双层）布鲁克MTFML-V2特定于所使用的原子力显微镜；MTFML-V2 是用于在 MultiMode 原子力显微镜上进行液体环境中扫描的玻璃探针支架。
探针支架（流体，间充质干细胞）布鲁克FastScan Bio Z-扫描仪与 Dimension FastScan 探头（XY 柔性扫描器）配合使用。序列号 MXYPOM5-1B154。
探针支架（标准型，常温）BrukerDAFMCH特定于所使用的原子力显微镜型号；DAFMCH 是 Dimension Icon 原子力显微镜的标准接触模式与轻敲模式探针 holder，适用于纳米压痕（PF-QNM、FFV 和定点射击 ramping）
样品载具Ted Pella16218产品编号适用于直径为15 mm的不锈钢样品载片。直径为6 mm、10 mm、12 mm和20 mm的型号也可在以下网址获取：https://www.tedpella.com/AFM_html/AFM.aspx#anchor842459
蓝宝石衬底BrukerPFQNM-SMPKIT-12M极硬表面E = 345 GPa）用于测量探针的偏转灵敏度（确保所有偏转均来自探针本身，而非基底）。属于PF-QNM/模量标准套件的一部分。
扫描电子显微镜日立S-3400N-II位于博伊西州立大学。用于对除增材制造（AM）Ti-6Al-4V以外的所有样品进行共定位SEM/EDS分析。
硅原子力显微镜探针（标准）NuNanoScout 350标准轻敲模式硅探针，背面镀有反射铝层； k = 42 N/m（标称值）， f0 = 350 kHz。标称值 R = 5 nm。也可提供未涂层或带反射性金背涂层的探针。其他制造商也提供具有类似规格的探针（例如，Bruker TESPA-V2）。
硅制原子力显微镜探针（刚性）布鲁克RTESPA-525，RTESPA-525-30 带有反射性铝背侧涂层的旋转尖端蚀刻硅探针； k = 200 N/m（标称值）， f0 = 525 kHz。标称值 R = 8 nm（RTESPA-525） R = 30 nm（适用于 RTESPA-525-30）。每根 RTESPA-525-30 的弹簧常数均由工厂通过激光多普勒测振法单独测量，并随探针提供。
碳化硅砂纸（研磨圆盘）联合50-10005120目
氮化硅原子力显微镜探针（软质，大半径半球形针尖）BrukerMLCT-SPH-5UM，MLCT-SPH-5UM-DC也称为 MLCT-SPH-1UM-DC。新系列产品，由工厂校准（所有悬臂梁的探针半径和弹簧常数），大半径（R = 1 或 5 mm）半球形探针尖端（位于 23 mm 长圆柱形杆末端）。DC = 漂移补偿涂层。每根探针含 6 个悬臂梁（A–F）。标称弹簧常数：A， k = 0.07 N/m；B， k = 0.02 N/m；C， k = 0.01 N/m；D， k = 0.03 N/m；E， k = 0.1 N/m；F， k = 0.6 N/m。
氮化硅原子力显微镜探针（软质，中等尖锐针尖）BrukerDNP4 个悬臂/探针（A-d）。标称弹簧常数：A， k = 0.35 N/m；B， k = 0.12 N/m；C， k = 0.24 N/m；D， k = 0.06 N/m。标称曲率半径， R = 10 nm
氮化硅原子力显微镜探针（软质，尖锐针尖）布鲁克ScanAsyst-Air标称值：共振频率， f0 = 70 kHz；弹簧常数， k = 0.4 N/m；曲率半径， R = 2 纳米。专为基于力曲线的原子力显微成像设计。
超级胶水亨克尔Loctite 495基于氰基丙烯酸酯的瞬干胶。许多性能相近的产品均可轻易获得。
注射泵New Era泵系统NE1000US单通道注射泵系统，具备输注和抽吸功能
尖端表征标准BrukerPFQNM-SMPKIT-12M钛（Ti）粗糙度标准品。PF-QNM/模量标准品套件的组成部分。
超高纯度氮气（UHP N2), 99.999%NorcoSPG TUHPNI - T用于样品干燥的超高纯度（99.999%）氮气T型压缩气瓶
超薄切片机LeicaEM UC6配备玻璃刀片（标准型，用于初始样品制备）和金刚石刀片（用于最终制备）
超纯水赛默飞世尔科技Barnstead Nanopure Model 7146型号已停产，但有等效产品可供选择。可产生 ≥18.2 MΩ含1-5 ppb TOC（总有机碳），通过在线紫外监测获得的超纯水，包含0.2 µ微粒过滤器、离子交换柱和紫外氧化室。
变速研磨机BuehlerEcoMet 3000使用碳化硅砂纸进行手工抛光时采用。
主动式隔振台HerzanTS-140与Bruker MultiMode原子力显微镜联用。置于TMC 65-531减振台上。Bruker Dimension Icon原子力显微镜采用完全被动式减振系统（制造商提供定制声学罩、气浮台和花岗岩基座）。
被动式振动隔离台TMC65-53135" × 30" 配备可选空气阻尼（已禁用）的隔振台。与Bruker MultiMode原子力显微镜联用。Herzan TS-140 "表稳定性" 主动振动控制台位于上方。

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