一种源自肝癌组织的小细胞外囊泡富集方法

摘要

本文介绍了一种通过优化的差速超速离心法从小鼠肝癌组织中富集小细胞外囊泡的方法。

摘要

来源于组织的小细胞外囊泡（sEVs）能够反映来源细胞的功能状态以及组织间质空间的特征。高效富集这些sEVs是研究其生物学功能的重要前提，也是开发临床检测技术和治疗载体技术的关键。由于通常存在严重污染，从组织中分离sEVs较为困难。本研究提供了一种从肝癌组织中快速富集高质量sEVs的方法。该方法包括四个步骤：使用消化酶（胶原酶D和DNase Ι）孵育组织，经70 µm细胞筛过滤，差速超速离心，以及通过0.22 µm膜滤器过滤。由于对差速超速离心步骤进行了优化，并增加了过滤步骤，该方法获得的sEVs纯度高于经典差速超速离心法。本研究为组织来源sEVs的研究提供了重要的方法学基础和支撑数据。

引言

小细胞外囊泡（sEVs）直径约为30 nm至150 nm，由多种细胞分泌¹。它们可通过向各种器官、组织、细胞及细胞内部位转运脂质、蛋白质、DNA和RNA等重要生物分子，与组织细胞进行通讯，并调控局部或远端微环境，从而改变受体细胞的行为^2,3。因此，在研究sEVs于疾病发生和发展过程中的生物学行为时，特异性sEVs的分离与纯化是必不可少的前提。差速超速离心法被视为金标准，常用于从sEVs正常存在的组织中分离sEVs⁴。该技术可去除组织碎片、细胞碎片、大囊泡及凋亡小体，仅保留sEVs。

研究表明，胶原酶D和DNase I不会影响细胞或囊泡的分子特性，这两种酶的特性均有助于细胞外基质中囊泡的释放⁵。这些酶已被用于从人类转移性黑色素瘤组织、结肠癌组织以及结肠黏膜组织中提取小细胞外囊泡（sEVs）^5,6,7。然而，这些方法中胶原酶D和DNase I的浓度及消化时间存在差异，导致结论不一致。为避免其他sEV亚型的共沉淀，研究人员通过过滤和/或差速....

方案

人肝癌组织来自赣南医科大学第一附属医院诊断为肝恶性肿瘤的患者。所有患者均签署了知情同意书，人组织样本的收集已获得赣南医科大学第一附属医院伦理委员会的批准。有关本实验方案中使用的所有材料、设备和软件的详细信息，请参见材料表。

1. 准备

1. 将转移脱色摇床放入培养箱中，并将温度设置为 37 °C。所有其他所需设备见图1。
2. 用 75% 酒精喷洒手术刀和镊子进行清洁。
3. 通过量取 6 mg 胶原酶 D（4 mg/mL）和 24 µL DNase Ι（80 U/mL），加入 1.5 mL RPMI-1640 基础培养基中，配制消化液。轻轻倒置混匀，直至添加剂完全溶解。
4. 预先用 1×磷酸盐缓冲液（PBS）润湿 70 µm 和 0.22 µm 细胞筛。
5. 将一个 100 mm 无菌细胞培养皿置于冰盒上，用于解冻后放置肝组织。
6. 在肝细胞癌组织分离后的 15 分钟内，用 PBS 冲洗组织块表面的血液，将组织转移至无菌冻存管中，并在 −80 °C 保存，直至实验开始，保存时间不超过 2 周。

2. 组织解离

1. 从 −80 °C 冰....

结果

来自人肝癌组织的小细胞外囊泡（sEVs）在肝癌患者的诊断、治疗和预后中发挥着关键作用。本方法利用常见的实验室仪器，从肝癌组织中分离和纯化sEVs，可为sEVs的研究提供方法学支持。图2展示了从肝癌组织中富集sEVs的整体流程。通过组织切割和酶解消化，组织间质中的sEVs被充分释放。随后，消化液经70 µm滤膜过滤，以去除较大的组织碎片。此外，通过差速离心步骤（分别在500 × g、3,000 × g 和 12,000 × g 条件下）去除较小的组织残渣、细胞碎片、大囊泡以及凋亡小体（图3A-C）。

为了获得高纯度的小细胞外囊泡（sEVs），先后进行两次差速离心步骤（3,000 × g 和 12,000 × g），每次离心3分钟，重复操作直至去除表面白色物质。收集的上清液在100,000 × g

讨论

本方案描述了一种从肝癌组织中可重复提取小细胞外囊泡（sEVs）的方法。通过精细的组织分离、消化酶处理、差速超速离心以及0.22 µm滤膜过滤与纯化，可获得高质量的sEVs。在进行下游分析时，确保sEVs的高纯度极为重要。在差速离心过程中，上清液表面会出现一层白色物质（成分未知）。由于该层物质会污染sEVs，我们通过多次离心（3,000 × g 和 12,000 × g）并结合0.22 µm滤膜过滤，尽可能将其去除（补充表S1）。由于该白色层的干扰，在吸取上清液时存在损失sEVs的风险。因此，必须谨慎进行多次离心操作，并在不接触白色物质的前提下，尽可能小心地收集上清液。

该方案可纯化高质量的肝脏组织来源sEVs，但也存在一些局限性。在这些实验中，组织块的体积通常约为300–500 mg。从极小的组织块中分离出的sEVs数量过少，难以支持后续研究。考虑到消化液体积对组织来源sEVs产量的影响，过大的组织块应分割为若干部分进行提取，或增加消化酶的用量，以确保充分获取组织来源的sEVs。此外，sEVs的分离方法需根据组织.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.22 µm 膜过滤装置	Millex	SLGPR33RB
1 mL 无菌注射器	Hubei Xianming Medical Instrument Company	YL01329
2% 醋酸铀	Electron Microscopy Sciences	22400-2
4.7 mL 离心管	Beckman Coulter	361621
6孔细胞培养板	LABSELECT	11110
50 mL 烧杯	Tianjin Kangyiheng Experimental Instrument Sales Company	CF2100800
70 µm 细胞筛	Biosharp	BS-70-XBS
100 mm 细胞培养皿	CELL TER	CS016-0128
600 µL 离心管	Axygen	MCT060C
BCA 蛋白定量试剂盒	Thermo Fisher	RJ240544
Beckman Coulter Optima-Max-TL	Beckman	A95761
BioRad Mini trans-blot 转膜仪	Bio-Rad	1703930
BioRad Mini-Protean 电泳仪	Bio-Rad	1645050
CD63 抗体	Abcam	ab134045
CD9 抗体	Abcam	ab263019
Centrifuge 5430R 离心机	Eppendorf	5428HQ527333
清洗液	NanoFCM	C1801
胶原酶 D	Roche	11088866001
铜网	Henan Zhongjingkeyi Technology Company	DJZCM-15-N1
干式恒温器	Hangzhou allsheng instruments company	AS-01030-00
FITC 标记抗人 CD9 抗体	Elabscience	E-AB-F1086C
甘氨酸	Solarbio	G8200
辣根过氧化物酶（HRP）偶联山羊抗小鼠二抗	Proteintech	SA00001-1
辣根过氧化物酶（HRP）偶联山羊抗兔二抗	Proteintech	SA00001-2
甲醇	Shanghai Zhenxing Chemical Company
纳米颗粒流式细胞仪	NanoFCM INC	FNAN30E20112368
磷酸酶抑制剂（PhosSTOP）	Roche	4906845001
磷酸盐缓冲液（PBS）	Servicebio	G4202
聚偏二氟乙烯膜	Solarbio	ISEQ00010
质控微球	NanoFCM	QS2502
RPMI-1640 基础培养基	Biological Industries	C11875500BT
手术刀	Guangzhou Kehua Trading Company	NN-0623-1
二氧化硅纳米球	NanoFCM	S16M-Exo
转移脱色摇床 TS-8	Kylin-Bell	E0018
透射电子显微镜	Thermo Scientific	Talos L120C
Tris	Solarbio	T8060
TSG101 抗体	Proteintech	28283-1-AP
镊子	Guangzhou Lige Technology Company	LG01-105-4X