方法文章

一种源自肝癌组织的小细胞外囊泡富集方法

DOI：

10.3791/64499

⸱

2023年2月3日

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1The First School of Clinical Medicine, Gannan Medical University, 2Laboratory Medicine, First Affiliated Hospital of Gannan Medical University

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本文介绍了一种通过优化的差速超速离心法从小鼠肝癌组织中富集小细胞外囊泡的方法。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

来源于组织的小细胞外囊泡（sEVs）能够反映来源细胞的功能状态以及组织间质空间的特征。高效富集这些sEVs是研究其生物学功能的重要前提，也是开发临床检测技术和治疗载体技术的关键。由于通常存在严重污染，从组织中分离sEVs较为困难。本研究提供了一种从肝癌组织中快速富集高质量sEVs的方法。该方法包括四个步骤：使用消化酶（胶原酶D和DNase Ι）孵育组织，经70 µm细胞筛过滤，差速超速离心，以及通过0.22 µm膜滤器过滤。由于对差速超速离心步骤进行了优化，并增加了过滤步骤，该方法获得的sEVs纯度高于经典差速超速离心法。本研究为组织来源sEVs的研究提供了重要的方法学基础和支撑数据。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

小细胞外囊泡（sEVs）直径约为30 nm至150 nm，由多种细胞分泌1。它们可通过向各种器官、组织、细胞及细胞内部位转运脂质、蛋白质、DNA和RNA等重要生物分子，与组织细胞进行通讯，并调控局部或远端微环境，从而改变受体细胞的行为2,3。因此，在研究sEVs于疾病发生和发展过程中的生物学行为时，特异性sEVs的分离与纯化是必不可少的前提。差速超速离心法被视为金标准，常用于从sEVs正常存在的组织中分离sEVs4。该技术可去除组织碎片、细胞碎片、大囊泡及凋亡小体，仅保留sEVs。

研究表明，胶原酶D和DNase I不会影响细胞或囊泡的分子特性，这两种酶的特性均有助于细胞外基质中囊泡的释放5。这些酶已被用于从人类转移性黑色素瘤组织、结肠癌组织以及结肠黏膜组织中提取小细胞外囊泡（sEVs）5,6,7。然而，这些方法中胶原酶D和DNase I的浓度及消化时间存在差异，导致结论不一致。为避免其他sEV亚型的共沉淀，研究人员通过过滤和/或差速离心去除了较大尺寸的细胞外囊泡（直径为0.1 µm或0.2 µm）8。根据组织来源的不同，可能需要采用不同的分离与纯化方法9,10。

采用传统的差速超速离心法从肝组织中提取小细胞外囊泡（sEVs）时，上清液表面会形成一层白色物质，但无法确定其性质。在之前的一项研究11中发现，这层白色物质会影响sEVs的纯度。尽管采用传统方法分离的样本其颗粒数量和蛋白浓度高于本方法，但变异系数较大，可能是因为大量污染物导致实验结果重复性较差。通过去垢剂处理（即检测颗粒在1% Triton X-100中的溶解性）发现，本方法获得的sEVs纯度更高。因此，我们采用该方法分离和纯化来源于结直肠癌组织的sEVs，用于蛋白质组学研究。

目前，关于肝癌中sEVs的研究主要集中于血清、血浆以及细胞培养上清液12,13,14。然而，来源于肝癌组织的sEVs能够更准确地反映肝癌的生理病理状态及其周围微环境，并有效避免其他EVs的降解和污染15,16。本方法通过差速超速离心技术，可提高sEVs的得率并获得高质量的样本，为肝癌的深入研究提供了重要基础。该方法首先通过锐性分离获取肝癌组织，随后使用胶原酶D和DNase I进行组织解离。接着，通过过滤和差速超速离心进一步去除细胞碎片、大囊泡及凋亡小体。最终实现sEVs的分离与纯化，以供后续研究使用。

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方案

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人肝癌组织来自赣南医科大学第一附属医院诊断为肝恶性肿瘤的患者。所有患者均签署了知情同意书，人组织样本的收集已获得赣南医科大学第一附属医院伦理委员会的批准。有关本实验方案中使用的所有材料、设备和软件的详细信息，请参见材料表。

1. 准备

  1. 将转移脱色摇床放入培养箱中，并将温度设置为 37 °C。所有其他所需设备见图1。
  2. 用 75% 酒精喷洒手术刀和镊子进行清洁。
  3. 通过量取 6 mg 胶原酶 D（4 mg/mL）和 24 µL DNase Ι（80 U/mL），加入 1.5 mL RPMI-1640 基础培养基中，配制消化液。轻轻倒置混匀，直至添加剂完全溶解。
  4. 预先用 1×磷酸盐缓冲液（PBS）润湿 70 µm 和 0.22 µm 细胞筛。
  5. 将一个 100 mm 无菌细胞培养皿置于冰盒上，用于解冻后放置肝组织。
  6. 在肝细胞癌组织分离后的 15 分钟内，用 PBS 冲洗组织块表面的血液，将组织转移至无菌冻存管中，并在 −80 °C 保存，直至实验开始，保存时间不超过 2 周。

2. 组织解离

  1. 从 −80 °C 冰箱中取出组织样本，将约 400 mg 组织切成 2 mm × 2 mm × 2 mm 的碎片，放入置于冰盒上的 10 cm 细胞培养皿中。
  2. 将组织转移至含有 1.5 mL 消化液的 6 孔板中，然后将板置于转移式脱色摇床（20 rpm/min）上，在 37 °C 下孵育 20 分钟，以实现肝癌组织的完全解离并释放 sEVs。
  3. 从孵育器中取出 6 孔板并置于冰盒上。加入 80 µL 磷酸酶抑制剂和 200 µL 完全蛋白酶抑制剂溶液，以终止消化反应。
  4. 将消化液转移至 70 µm 细胞筛中，缓慢过滤以去除任何大块组织碎片。收集滤液并置于 2 mL 离心管中。

3. 差速超速离心

注意：所有离心步骤均需在 4 °C 下进行。

  1. 将滤液在 500 × g 10 分钟后收集上清液至新的 2 mL 离心管中。大部分细小的组织碎片即可被去除。
  2. 离心上清液，3,000 × g 孵育20分钟以去除细胞碎片。小心地将上清液转移至新的离心管中，直至移液器吸头即将接触到表面的白色物质为止。
  3. 将剩余液体在3,000 × g离心3分钟，然后吸除上清液以利于囊泡的收集。为确保小细胞外囊泡（sEVs）的纯度，注意勿吸出白色物质。
  4. 将收集的上清液在12,000 × g 孵育20分钟，将900 µL上清液转移至4.7 mL超速离心管中。将剩余液体在12,000 × g 3 分钟后收集并混合两个上清液至同一超速离心管中，用 PBS 完全充满该管。
  5. 将上清液在 100,000 × g 60分钟。弃去上清液，用PBS填充超速离心管以重悬沉淀，再于100,000 × g条件下离心。 g 孵育60分钟。用50 µL PBS重悬沉淀。
  6. 使用1 mL无菌注射器吸取sEV悬液，经0.22 µm膜过滤器过滤。将滤液收集至600 µL离心管中，于−80 °C保存，以备后续分析。

4. 富集质量的评估

  1. 在透射电子显微镜下观察sEVs的形态。
    1. 取10 µL sEV样品滴加到铜网上，室温孵育10分钟，用无菌蒸馏水清洗，并用吸水纸吸去多余液体。
    2. 向铜网上滴加10 µL 2%醋酸铀溶液进行负染1分钟，用滤纸吸去铜网表面液体，并在白炽灯下干燥2分钟。
    3. 在透射电子显微镜下观察铜网，于80 kV条件下成像。
  2. 使用纳米颗粒流式细胞仪测定sEVs的粒径分布和纯度。
    1. 启动仪器前，准备含有以下液体的离心管：200 µL质控品、200 µL二氧化硅纳米球、2 × 200 µL超纯水、2 × 200 µL清洗液以及200 µL PBS。
      注意：在检测sEV样品前，必须对仪器进行质量控制，并测试粒径标准品（需在相同检测条件下，利用不同直径[68–155 nm]的多种纳米微球生成标准曲线，以计算粒径分布）。质控微球和二氧化硅纳米球用超纯水稀释100倍，总体积为200 µL。
    2. 检查清洗液体积（>10 mL），并注意鞘液与废液液面之间的高度差（20–30 cm）。
    3. 关闭仪器主电源；20秒后开启计算机，等待蜂鸣声提示仪器已正确连接，随后运行软件。
    4. 点击Start Up以开启相机、激光器和气泵。
    5. 点击Sheath Flow-Start Up，并将超纯水置于加样平台。4分钟后（仪器倒计时结束），点击Sample-Boosting | Sample-Unload。
    6. 30秒后，将空白管置于加样平台，点击Sample-Boosting | Sample-Unload。然后将装有超纯水的离心管置于加样平台，同时点击Sample-Boosting | Sheath Flow-Purge。
    7. 点击Manual Operation，将粒子浓度管置于加样平台，点击Sample-Boosting持续1分钟，并同时在"SAMP. Inf."中选择250 nm Std FL SiNPs质控。
    8. 点击Sample-Sampling，并通过点击SPCM开启检测器。
      注意：此时可观察到实时信号波形。
    9. 点击Auto Sampling，在Sampling SET中输入1.0，将压力固定为1 KPa。点击toolbar，选择Large Signal。
    10. 调节激光的水平位置，将激光设为2 µm；然后点击L或R，确保信号强且均匀。
    11. 点击Time to Record以采集数据，完成后数据将自动跳转至Buffer。随后将数据保存为Naf文件，并点击Sample-Unload。
    12. 将清洗液管置于加样平台，点击Sample-Boosting，1分钟后点击Sample-Unload。使用超纯水冲洗毛细管尖端残留的清洗液。
    13. 将粒径标准品管置于加样平台，点击Sample-Boosting持续1分钟。
    14. 在"SAMP. Inf"中选择68-155 nm Std FL SiNPs质控，点击Sample-Sampling。然后点击toolbar，选择Small Signal。
    15. 点击Time to Record以采集数据，完成后数据将自动跳转至Buffer。随后将数据保存为Naf文件，并点击Sample-Unload。
    16. 将清洗液管置于加样平台，点击Sample-Boosting，1分钟后点击Sample-Unload。使用超纯水冲洗毛细管尖端残留的清洗液。
    17. 将PBS管置于加样平台，点击Sample-Boosting持续1分钟。
    18. 在"SAMP. Inf"中选择68-155 nm Std FL SiNPs质控，点击Sample-Sampling。然后点击toolbar，选择Small Signal。
    19. 点击Time to Record以采集数据，完成后数据将自动跳转至Buffer。将数据保存为Naf文件，并点击Sample-Unload。
    20. 将清洗液管置于加样平台，点击Sample-Boosting，1分钟后点击Sample-Unload。使用超纯水冲洗毛细管尖端残留的清洗液。
    21. 按照步骤4.2.17–4.2.20所述检查样品信息；将PBS（步骤4.2.17）替换为sEV样品，并分析数据。
  3. 通过蛋白质印迹法进一步鉴定sEVs。
    1. 根据BCA蛋白定量试剂盒说明书，测定sEVs和组织的蛋白浓度。
    2. 根据定量结果计算sEVs的上样体积（例如每孔5 µg蛋白），按1:4比例加入上样缓冲液，并涡旋混匀。
    3. 在100 °C金属浴（干式恒温器）中变性10分钟后，于12%聚丙烯酰胺凝胶中以60 V电泳80分钟分离蛋白。
    4. 使用转膜缓冲液（25 mM Tris，192 mM 甘氨酸，20%甲醇），在220 mA电流下将凝胶中的蛋白转移至0.22 µm聚偏二氟乙烯（PVDF）膜，持续2小时。
    5. 用含5%脱脂奶粉的Tris缓冲盐水吐温（TBST）溶液室温封闭1小时，随后与一抗（兔单克隆抗人CD9抗体、兔单克隆抗人CD63抗体、兔单克隆抗人TSG101抗体、鼠单克隆抗人GM130抗体）在4 °C孵育过夜。一抗用5%脱脂奶粉按1:1,000比例稀释。
    6. 用TBST洗涤三次后，室温下与辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗孵育1小时。
    7. 使用ECL化学发光底物检测HRP标记的抗体，随后采集并分析图像。

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结果

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来自人肝癌组织的小细胞外囊泡（sEVs）在肝癌患者的诊断、治疗和预后中发挥着关键作用。该方法利用常见的实验室仪器从肝癌组织中分离和纯化sEVs，可为sEVs的研究提供方法学支持。图2展示了从肝癌组织中富集sEVs的整体流程。通过组织切割和酶解消化，组织间质中的sEVs得以充分释放。随后，消化液经70 µm滤膜过滤，以去除较大的组织碎片。此外，通过差速离心步骤（分别在500 × g、3,000 × g和12,000 × g条件下）去除较小的组织残渣、细胞碎片、大囊泡以及凋亡小体（图3A-C）。

为获得高纯度的小细胞外囊泡（sEVs），需进行两次差速离心步骤（分别在 3,000 × g 和 12,000 × g 条件下离心 3 分钟），重复操作直至去除表面白色物质。收集上清液后，在 100,000 × g...

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讨论

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本方案描述了一种从肝癌组织中可重复提取小细胞外囊泡（sEVs）的方法。通过精细的组织分离、消化酶处理、差速超速离心以及0.22 µm滤膜过滤与纯化，可获得高质量的sEVs。在进行下游分析时，确保sEVs的高纯度极为重要。在差速离心过程中，上清液表面会出现一层白色物质（成分未知）。由于该层物质会污染sEVs，我们通过多次离心（3,000 × g 和 12,000 × g）并结合0.22 µm滤膜过滤，尽可能将其去除（补充表S1）。由于该白色层的干扰，在吸取上清液时存在损失sEVs的风险。因此，必须谨慎进行多次离心操作，并在不接触白色物质的前提下，尽可能小心地收集上清液。

该方案可纯化高质量的肝脏组织来源sEVs，但也存在一些局限性。在这些实验中，组织块的体积通常约为300–500 mg。从极小的组织块中分离出的sEVs数量过少，难以支持后续研究。考虑到消化液体积对组织来源sEVs产量的影响，过大的组织块应分割为若干部分进行提取，或增加消化酶的用量，以确保充分获取组织来源的sEVs。此外，sEVs的分离方法需根据组织...

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披露

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作者声明无利益冲突。

致谢

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作者感谢赣南医科大学第一附属医院对本工作的支持。 本工作受到国家自然科学基金（项目编号 82260422）的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
0.22 µm 膜过滤装置MillexSLGPR33RB
1 mL 无菌注射器Hubei Xianming Medical Instrument CompanyYL01329
2% 醋酸铀Electron Microscopy Sciences22400-2
4.7 mL 离心管Beckman Coulter361621
6孔细胞培养板LABSELECT11110
50 mL 烧杯Tianjin Kangyiheng Experimental Instrument Sales CompanyCF2100800
70 µm 细胞筛BiosharpBS-70-XBS
100 mm 细胞培养皿CELL TERCS016-0128
600 µL 离心管AxygenMCT060C
BCA 蛋白定量试剂盒Thermo FisherRJ240544
Beckman Coulter Optima-Max-TLBeckman A95761
BioRad Mini trans-blot 转膜仪Bio-Rad1703930
BioRad Mini-Protean 电泳仪Bio-Rad1645050
CD63 抗体Abcamab134045
CD9 抗体Abcamab263019
Centrifuge 5430R 离心机Eppendorf5428HQ527333
清洗液NanoFCMC1801
胶原酶 DRoche11088866001
铜网Henan Zhongjingkeyi Technology CompanyDJZCM-15-N1
干式恒温器Hangzhou allsheng instruments companyAS-01030-00
FITC 标记抗人 CD9 抗体ElabscienceE-AB-F1086C
甘氨酸SolarbioG8200
辣根过氧化物酶（HRP）偶联山羊抗小鼠二抗 ProteintechSA00001-1
辣根过氧化物酶（HRP）偶联山羊抗兔二抗 ProteintechSA00001-2
甲醇Shanghai Zhenxing Chemical Company
纳米颗粒流式细胞仪NanoFCM INCFNAN30E20112368
磷酸酶抑制剂（PhosSTOP）Roche4906845001
磷酸盐缓冲液（PBS）ServicebioG4202
聚偏二氟乙烯膜SolarbioISEQ00010
质控微球NanoFCMQS2502
RPMI-1640 基础培养基Biological Industries C11875500BT
手术刀Guangzhou Kehua Trading CompanyNN-0623-1
二氧化硅纳米球NanoFCMS16M-Exo
转移脱色摇床 TS-8Kylin-BellE0018
透射电子显微镜Thermo ScientificTalos L120C
TrisSolarbioT8060
TSG101 抗体Proteintech28283-1-AP
镊子Guangzhou Lige Technology CompanyLG01-105-4X

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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