本研究描述了一种用于384孔板的高通量细胞内钙荧光检测方法，可用于在重组G蛋白偶联受体（GPCRs）上筛选小分子文库。该检测以牛蜱Rhipicephalus microplus的激肽受体为靶点，在CHO-K1细胞中表达。该方法利用同一批细胞，通过一种“双加样”检测方式同时鉴定激动剂和拮抗剂。
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摘要
摘要
G蛋白偶联受体（GPCRs）是最大的受体超家族，也是多种人类药物的作用靶点。制药行业利用针对GPCRs的随机小分子文库高通量筛选（HTS）进行靶向药物发现。本研究采用高通量筛选方法，旨在鉴定特异性作用于无脊椎动物神经肽G蛋白偶联受体的新型小分子配体，以作为研究致命性人类和动物病原体传播媒介生理功能的探针。
选择无脊椎动物特异性的缓激肽受体作为靶点，是因为它调控无脊椎动物中许多重要的生理过程，包括利尿、摄食和消化。此外，许多无脊椎动物G蛋白偶联受体（GPCR）的药理学特性尚未被充分表征甚至完全未知；因此，这些受体家族相对于其他后生动物（尤其是人类）中相关GPCR所表现出的差异性药理学特性，有助于增进对GPCR这一超家族结构-活性关系的理解。本研究建立了一种适用于384孔板细胞的高通量筛选（HTS）检测方法，用于发现牛蜱或称南方牛蜱Rhipicephalus microplus缓激肽受体的配体。该蜱类缓激肽受体在CHO-K1细胞中实现了稳定表达。
激肽受体在被内源性激肽类神经肽或其他小分子激动剂激活后，可触发Ca2+ 从钙库释放到细胞质中的钙离子。该钙荧光检测法结合一种 "双加法" 该方法可检测功能性激动剂和拮抗剂 "命中" 同一块检测板中的分子。每次检测均使用含有320种随机小分子的药物板进行。在高通量筛选（HTS）中，当终浓度为2 µM时，获得了可靠的Z'因子0.7，并鉴定出三个激动剂和两个拮抗剂命中分子。本文所述的钙荧光检测法可适用于筛选其他能够激活Ca²⁺信号通路的GPCR。2+ 信号级联
引言
G蛋白偶联受体（GPCRs）存在于从酵母到人类的多种生物中，是许多生物体内最大的受体超家族1。它们在调控动物几乎所有的生物学过程中发挥关键作用。节肢动物基因组中含有50至200个GPCR，使其成为最大的膜受体超家族2。根据序列相似性和功能，GPCRs被分为六大类：A至F类3。GPCRs可转导多种胞外信号，包括激素、神经肽、生物源性胺类、谷氨酸、质子、脂糖蛋白以及光子等信号4。GPCRs通过与异源三聚体G蛋白（Gα、Gβ和Gγ）偶联来传递下游信号。与Gαs或Gαi/o蛋白偶联的GPCRs分别通过激活或抑制腺苷酸环化酶来升高或降低细胞内3',5'-环磷酸腺苷（cAMP）水平。与Gαq/11偶联的GPCRs通过激活磷脂酶C（PLC）-肌醇-1,4,5-三磷酸（IP3）通路，诱导内质网钙库中的钙离子释放。与Gα12/13偶联的GPCRs可激活RhoGTP酶鸟苷酸交换因子5,6。超过50%的人类药物以及杀螨剂阿米特拉嗪均以GPCRs为靶点4。由于GPCRs能够转导如此多样化的信号，....
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方案
1. 细胞培养与维护
注意：Holmes 等人建立了一种稳定表达微小牛蜱（R. microplus）激肽受体的 CHO-K1 细胞系，命名为 BMLK316。该细胞系的构建细节见其他文献14。以下所有步骤均须在 II 级生物安全柜内的无菌条件下进行。
- 在选择性培养基（含10%胎牛血清[FBS]和800 µg/mL G418硫酸盐的F-12K培养基）中培养重组细胞系，以确保目标受体的表达。将稳定表达受体的细胞置于含1 mL冻存液（90% FBS和10%二甲基亚砜[DMSO]）的2 mL冻存管中，于−80 °C冰箱中保存。
注意：如需长期保存冻存细胞，应将其置于液氮中储存。 - 细胞培养前将所有培养基预热。在生物安全柜中，将13 mL预热的选择性培养基（含10% FBS和800 µg/mL G418硫酸盐的F-12K培养基）加入T-75培养瓶中，并置于生物安全柜内。在37 °C水浴中解冻一支冻存的BMLK3细胞（约1.5 × 106个细胞），时间约为2–3分钟。将解冻后的细胞转移至T-75培养瓶中。除非另有说明，否则将细胞置于37 °C、5% CO2的加湿培养箱中维持培养。
- 当细....
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结果
以一个内部药物筛选板（SAC2-34-6170），其中包含320种随机小分子化合物为例，用于演示本高通量筛选（HTS）实验。该HTS实验具有优异的检测质量，Z'因子为0.7（表1）。此Z'因子反映了检测质量，且不受被测化合物影响34。Z'因子大于或等于0.5表明阳性对照与阴性对照之间的相对荧光单位（RFU）具有良好的信号动态范围。Z'因子小于0.5的实验其信号动态范围次优，通常无法为阳性结果筛选提供有效信息，因此会被舍弃。阳性对照的响应（以相对荧光单位RFU测量，64个阳性对照响应的平均RFU，µc+ = 130,139）平均比阴性对照（64个阴性对照响应的平均RFU，µc- = 6,675）高出19倍。选择“激动剂阳性结果”的荧光阈值设定为归一化百分比激活度（NPA）最大比值 >50%。选择“拮抗剂阳性结果”的荧光阈值设定为观察到的抑制活性（Io）>50%。最终筛选出三个激动剂阳性分子和两个拮抗剂阳性分子：SACC-009023.......
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讨论
高通量筛选（HTS）的目标是通过大规模筛选大量小分子来鉴定出阳性分子。因此，本示例的结果仅代表一次常规HTS实验的一小部分。此外，所鉴定出的阳性分子还需在下游实验中进行验证，例如在同一重组细胞系以及仅携带空载体的CHO-K1细胞系中进行剂量依赖性检测，这些检测可同时开展以节省小分子样品。细胞毒性检测将有助于证明第二次加样时无反应并非由细胞死亡所致。还应开展其他生物活性检测，以验证化合物在分离组织中的活性。 体外，或通过向活体节肢动物施用或喂食小分子化合物。蜱虫激肽受体的小分子配体鉴定完整流程可参见先前发表的研究。31通过该筛选流程，共鉴定出36种蜱虫激肽受体拮抗剂。其中三种拮抗剂进一步在组织收缩抑制实验中进行了测试，结果显示其对蚊虫后肠具有抗肌活性，而蚊虫后肠中表达有同源的蚊虫激肽受体。31.
在进行高通量筛选（HTS）之前，应对每种表达G蛋白偶联受体（GPCR）的细胞系验证其适宜的实验条件。这些条件包括细胞密度（每孔10,000个细胞）、待筛选化合物的浓度（2 µM）.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作获得了美国农业部国家食品与农业研究所动物健康与福祉奖（资助号 2022-67015-36336，PVP [项目负责人]）以及德克萨斯农工大学动物科学系的竞争性资金支持。&M 得克萨斯农工大学农业生命研究昆虫媒介疾病资助计划（2022-2023 财年）对 P.V.P. 的资助。感谢得克萨斯农工大学农业与生命科学学院 A.W.E.S.O.M.E. 教师团队在稿件编辑过程中提供的帮助。 补充表 S2 包含来自德克萨斯农工大学James Sacchettini博士实验室内部随机小分子化合物库的数据&M 大学和德克萨斯农工大学&M 德州农工大学农业生命研究部
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 0.25% 胰蛋白酶-EDTA | Gibco Invitrogen | 15050-065 | 含酚红 |
| 0.4% 台盼蓝 | MilliporeSigma | T8154 | 液体，无菌 |
| 1.5 mL 微量离心管 | Thermo Fisher | AM12400 | 无RNase微离心管 |
| 5 mL 移液管 | Corning | 29443-045 | Corning Costar Stripette，单独包装 |
| 10 mL 移液管 | Corning | 29443-047 | Corning Costar Stripette，单独包装 |
| 15 mL 锥形管 | Falcon | 352196 | 无菌 |
| 20 µL 滤芯吸头 | USA Scientifc Inc. | P1121 | 无菌，带屏障 |
| 25 mL 移液管 | Corning | 29443-049 | Corning Costar Stripette，单独包装 |
| 50 mL 锥形管 | Corning | 430828 | 带刻度，无菌 |
| 150 mL 自动化兼容储液槽 | Integra Bioscience | 6317 | 无菌，单独包装，用于第1天细胞接种 |
| 150 mL 自动化兼容储液槽 | Integra Bioscience | 6318 | 无菌，叠放式，用于第2天加载染料 |
| 384/12.5 µL 低吸附吸头 | Integra Bioscience | 6405 | 长型，无菌滤芯 |
| 384/12.5 µL 吸头 | Integra Bioscience | 6404 | 长型，无菌滤芯 |
| 384孔板 | Greiner | 781091 | CELLSTAR，透明聚苯乙烯，µClear，黑色/平底 |
| 铝制板封膜 | Axygen Scientific | PCR-AS-200 | 聚酯基 |
| 铝箔包裹 | Walmart | ||
| II级生物安全柜 | NuAire | NU-540-300 | |
| 细胞计数仪 | Nexcelom | AutoT4 | |
| 细胞计数载玻片 | Nexcelom | SD-100 | 20 µL 样品室 |
| CO2 恒温培养箱（带湿度控制） | Thermo Fisher | Forma Series II | |
| 台灯 | SunvaleeyTEK | RS1000B | |
| 二甲基亚砜 | MilliporeSigma | 276855 | 无水，>99.9% |
| 药物板 | Corning | 3680 | |
| 杜尔贝科磷酸盐缓冲液 | Corning | 21-031-CV | DPBS，1×，不含钙和镁 |
| 乙醇 | Koptec | 2000 | |
| F-12K 培养基 | Corning | 45000-354 | （Kaighn改良型），含L-谷氨酰胺 |
| 胎牛血清 | Equitech-Bio | SFBU30 | |
| 荧光钙检测试剂盒 | ENZO Lifescience | ENZ-51017 | 10×96 次检测 |
| G418 硫酸盐 | Gibco Invitrogen | 10131-027 | 遗传霉素选择性抗生素，50 mg/mL |
| 亨氏缓冲液 | MilliporeSigma | 55037C | 改良HBSS，含钙、含镁，不含酚红 |
| HEPES 缓冲液 | Gibco Invitrogen | 15630-080 | 1 摩尔 |
| 高通量筛选数据存储平台 | CDD vault | https://www.collaborativedrug.com/ | |
| 液体处理系统 | Integra Bioscience | Viaflo | 384/12.5 µL |
| 板式离心机 | Thermo Fisher | Sorvall ST8 | |
| 酶标仪 | BMG technology | Clariostar | |
| 多聚赖氨酸 | MilliporeSigma | P6407 | |
| Rhimi-K-1 激动剂肽 | Genscript | 定制订单 | QFSPWGamide |
| T-75 培养瓶 | Falcon | 353136 |
参考文献
- Hanlon, C. D., Andrew, D. J. Outside-in signaling - A brief review of GPCR signaling with a focus on the Drosophila GPCR family. Journal of Cell Science. 128 (19), 3533-3542 (2015).
- Liu, N., Li, T., Wang, Y., Liu, S.
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重印与许可
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