由健康及视网膜疾病特异性人诱导性多能干细胞生成视网膜类器官

摘要

本方案描述了一种利用简化的培养条件，将人诱导多能干细胞（hiPSCs）高效分化为视泡样细胞簇并生成神经视网膜类器官的方法，该培养过程结合了贴壁培养和悬浮培养体系。在视网膜培养物中成熟的视泡结构内，还可分离出其他眼部细胞类型，如视网膜色素上皮细胞（RPE）和角膜上皮细胞。

摘要

多能干细胞可以生成复杂的组织类器官，这些类器官在 体外 疾病建模研究及再生治疗开发。本方案描述了一种更简单、稳健且分步明确的方法，用于在混合培养系统中生成视网膜类器官。该系统在视网膜分化的前4周采用贴壁单层培养，直至出现界限清晰、自组织形成的视泡前体细胞簇（EFPs）。随后，将每个EFP中呈环形、透光的类甜甜圈状神经视网膜岛状结构手动挑选出来，转移至非贴壁培养皿中，在视网膜分化培养基中进行悬浮培养1-2周，以生成多层结构的三维视杯（OC-1M）。这些未成熟的视网膜类器官含有PAX6⁺ 和 ChX10⁺ 增殖性多能视网膜前体细胞。前体细胞在类器官内呈线性自组装，表现为明显的放射状条纹。悬浮培养4周后，视网膜前体细胞经历有丝分裂后停滞并启动谱系分化，形成成熟视网膜类器官（OC-2M）。光感受器谱系定向的前体细胞发育于视网膜类器官的最外层。这些CRX⁺ 和RCVRN⁺ 光感受器细胞在形态上成熟，表现出类似内节的突起。该方法可用于利用人胚胎干细胞（hESCs）和诱导性多能干细胞（iPSCs）生成视网膜类器官。所有步骤和操作均得到清晰阐述与演示，以确保可重复性，并促进其在基础科学和转化研究中的广泛应用。

引言

视网膜是位于脊椎动物眼球后部的一种对光敏感的组织，通过一种称为光转导通路的生化现象将光信号转化为神经冲动。视网膜中的感光细胞产生的初始神经冲动被传递至其他视网膜中间神经元和视网膜神经节细胞（RGCs），并最终到达大脑的视觉皮层，从而实现图像感知和视觉反应。

根据世界卫生组织（WHO）估计，全球约有150万名儿童失明，其中100万位于亚洲。遗传性视网膜营养不良（IRD）是一种主要致盲性疾病，全球每4,000人中约有1人受其影响。^1,2,3，而发展中国家与年龄相关性黄斑变性（AMD）相关的盲症患病率介于0.6%至1.1%之间⁴. 视网膜遗传性疾病（IRDs）由300多个与视网膜发育和功能相关的基因遗传性缺陷引起⁵此类基因改变会导致视网膜正常功能受损，以及视网膜细胞（即光感受器细胞和视网膜色素上皮细胞（RPE））的逐渐退化，从而引起严重的视力丧失甚至失明。在涉及角膜、晶状体等其他致盲性疾病的治疗方面已取得巨大进展。然而，截至目前，视网膜营养不良和视神经萎缩尚无任何经证实有效的治疗方法。由于成年人大脑中的视网膜不含干细胞⁶，其他来源如胚胎干细胞（ESCs）和....

方案

所有涉及人诱导多能干细胞（hiPSCs）的实验均在无菌条件下进行，严格遵守标准实验室操作规范、伦理及生物安全指南，并获得机构伦理委员会（IEC）、机构干细胞研究委员会（IC-SCR）和机构生物安全委员会（IBSC）等监管机构的批准。

1. iPSC 培养及视网膜分化培养基与试剂的准备

1. iPSC 培养与维持培养基
   1. 在基底膜基质包被（见材料表）的培养板上，使用 Essential 8 培养基，在无饲养层条件下培养和维持正常的人诱导多能干细胞系²³ （hiPSC-F2-3F1）以及经 CRISPR 编辑的 RB1^-/- 人诱导多能干细胞系（LVIP15-RB1-CS3，该细胞系在人类 RB1 基因的第 18 外显子内存在双等位基因的 10 bp 移码缺失）。
      注：通过将基底膜基质替换为重组纤连蛋白（VTN-N）包被，可使本方案完全实现无异源成分。通过向 Essential 8 培养基中添加 50x Essential 8 补充剂（随 Essential 8 培养基试剂盒提供；见材料表）和 100 U/mL 青霉素-链霉素溶液，制备完全的 Essential 8 培养基。 alternatively，也可使用完全 mTeSR1 培养基培养 h....

结果

通过在不同时间点分阶段使用含有补充剂和生长因子的不同培养基组合对hiPSCs进行培养，可实现其向眼谱系的分化，具体方法如所述。 图1hiPSC 细胞培养物在Essential 8培养基（一种多能干细胞维持培养基）中维持培养。当细胞汇合度达到70%–80%时（图2A)，在第0天将培养基更换为含1 ng/mL bFGF、1 ng/mL Noggin和1% N2补充剂的分化诱导培养基（DIM）（参见步骤3.2）。N2补充剂具有神经诱导作用，而Noggin作为BMP信号通路抑制剂，可通过阻断中胚层和内胚层分化，对引导细胞向神经外胚层谱系分化发挥关键作用。在第1天^st, 2^nd3^rd 天起，Noggin 的浓度增加至 10 ng/mL（参见步骤 3.3 和 3.4）。从第 4^th 第几天，将DIM替换为视网膜分化培养基（RDM）（步骤3.5），培养物持续培养至多30天。RDM培养基中的B27含有多种附加补充成分，如多种抗氧化剂和D-半乳糖，可.......

讨论

hiPSCs 是研究器官和组织发育的有力工具 体外 通过将健康个体与疾病特异性的人诱导多能干细胞（hiPSCs）向视网膜谱系分化，模拟疾病表型，有助于深入理解不同类型遗传性视网膜营养不良的病理生理机制。目前已报道并采用多种方案用于 体外 将PSCs分化为视网膜细胞类型。大多数方法涉及使用含有复杂混合物的培养基，包括重组生长因子、添加剂、小分子和试剂，例如：N1、N2和B27添加剂；BMP和TGFβ信号通路阻断剂如Noggin、SB431542、LDN193189和Follistatin，或诱导剂如Activin A、Lefty和IDE1；经典Wnt信号通路阻断剂如DKK1、SFRP、IWP-2和IWR-1-endo，或诱导剂如CHIR99021、SB216763和CKI-7；FGF受体信号通路阻断剂如PD0325901和PD173074，或诱导剂如bFGF；Notch信号通路抑制剂如DAPT；其他信号分子如胰岛素样生长因子（IGF-1）；视黄酸；生长激素如三碘甲状腺原氨酸（T3）和氢化可的松；以及抗氧化剂和其他促存活因子如抗坏血酸、烟酰胺、牛磺酸、二十二碳六烯酸、1-硫代甘油等。这些成分在干细胞分化的.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.22 µm 注射器滤器	TPP	99722
15 mL 离心管	TPP	91015
50 mL 离心管	TPP	91050
6 孔板	TPP	92006
抗 Chx10 抗体；小鼠单克隆	Santa Cruz	SC365519	1:50 稀释
抗 CRX 抗体；兔单克隆	Abcam	ab140603	1:300 稀释
抗 MiTF 抗体，小鼠单克隆	Abcam	ab3201	1:250 稀释
抗 Recoverin 抗体；兔多克隆	Millipore	AB5585	1:300 稀释
B-27 添加剂（50 倍浓度），无血清	Thermo Fisher	17504044
碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）	Sigma Aldrich	F0291
Centrifuge 5810R 离心机	Eppendorf
Coplin 染色缸（50 mL）	Tarson
Corning Matrigel hESC 认证基质	Corning	354277
冻存管（CryoTubes）	Thermo Fisher	V7884
DMEM/F-12，含 GlutaMAX 添加剂（基础培养基）	Thermo Fisher	10565-018
DreamTaq DNA 聚合酶	Thermo Fisher	EP0709
Dulbecco’s 磷酸盐缓冲液	Thermo Fisher	14190144
Essential 8 培养基试剂盒	Thermo Fisher	A1517001
乙二胺四乙酸二钠盐二水合物（EDTA）	Sigma Aldrich	E5134
Falcon 非组织培养处理培养皿，60 mm	Corning	351007
胎牛血清，经认证，美国来源	Gibco	26140079
配备 Image Lab 软件的 GelDocXR+ 系统	BIO-RAD		琼脂糖凝胶成像系统
GlutaMAX 添加剂	Thermo Fisher	35050061
山羊抗小鼠 IgG（H+L），Alexa Fluor 488 标记	Invitrogen	A11001	1:300 稀释
山羊抗小鼠 IgG（H+L），Alexa Fluor 546 标记	Invitrogen	A11030	1:300 稀释
山羊抗兔 IgG（H+L），Alexa Fluo 546 标记	Invitrogen	A11035	1:300 稀释
山羊抗兔 IgG（H+L），Alexa Fluor 488 标记	Invitrogen	A11008	1:300 稀释
HistoCore MULTICUT 切片机	Leica		用于切片
KnockOut 血清替代物	Thermo Fisher	10828028
L-抗坏血酸	Sigma Aldrich	A92902
MEM 非必需氨基酸溶液（100 倍浓度）	Thermo Fisher	11140-050
N2 添加剂（100 倍浓度）	Thermo Fisher	17502048
NanoDrop 2000 核酸定量仪	Thermo Fisher		用于 RNA 定量
多聚甲醛	Qualigens	23995
巴斯德吸管，9 英寸，非无菌，未堵塞	Corning	7095D-9
青霉素-链霉素	Thermo Fisher	15140-122
重组抗 Otx2 抗体，兔单克隆	Abcam	ab183951	1:300 稀释
重组抗 PAX6 抗体；兔单克隆	Abcam	ab195045	1:300 稀释
重组抗 RPE65 抗体，兔单克隆	Abcam	ab231782	1:300 稀释
重组人 Noggin 蛋白	R&D Systems	6057-NG
SeaKem LE 琼脂糖	Lonza	50004
血清移液管，10 mL	TPP	94010
血清移液管，5 mL	TPP	94005
氯化钠	Sigma Aldrich	S7653
柠檬酸三钠二水合物	Sigma Aldrich	S4641
Starfrost（硅烷涂层）载玻片	Knittel
SuperScript III 第一链合成系统	Thermo Fisher	18080051
用于 RT-PCR 的 SuperScript III 第一链合成系统	Invitrogen	18080051
Triton X-100	Sigma Aldrich	T8787
TRIzol 试剂	Invitrogen	15596026
UltraPure 0.5 M EDTA，pH 8.0	Thermo Fisher	15575020
含 DAPI 的 VECTASHIELD 抗荧光淬灭封片剂	Vector laboratories	H-1200
玻连蛋白（Vitronectin）	Thermo Fisher	A27940
Y-27632 二盐酸盐（Rho 激酶抑制剂）	Sigma Aldrich	Y0503
Zeiss LSM 880 共聚焦显微镜	Zeiss		共聚焦显微镜