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方法文章

由健康及视网膜疾病特异性人诱导性多能干细胞生成视网膜类器官

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DOI：

10.3791/64509

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2022年12月9日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Centre for Ocular Regeneration, Prof. Brien Holden Eye Research Centre, LV Prasad Eye Institute, 2Manipal Academy of Higher Education, 3Schepens Eye Research Institute, Massachusetts Eye and Ear, Harvard Medical School

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本方案描述了一种利用简化的培养条件，将人诱导多能干细胞（hiPSCs）高效分化为视泡样细胞簇并生成神经视网膜类器官的方法，该培养过程结合了贴壁培养和悬浮培养体系。在视网膜培养物中成熟的视泡结构内，还可分离出其他眼部细胞类型，如视网膜色素上皮细胞（RPE）和角膜上皮细胞。

摘要

多能干细胞可以生成复杂的组织类器官，这些类器官在 体外 疾病建模研究及再生治疗开发。本方案描述了一种更简单、稳健且分步明确的方法，用于在混合培养系统中生成视网膜类器官。该系统在视网膜分化的前4周采用贴壁单层培养，直至出现界限清晰、自组织形成的视泡前体细胞簇（EFPs）。随后，将每个EFP中呈环形、透光的类甜甜圈状神经视网膜岛状结构手动挑选出来，转移至非贴壁培养皿中，在视网膜分化培养基中进行悬浮培养1-2周，以生成多层结构的三维视杯（OC-1M）。这些未成熟的视网膜类器官含有PAX6+ 和 ChX10+ 增殖性多能视网膜前体细胞。前体细胞在类器官内呈线性自组装，表现为明显的放射状条纹。悬浮培养4周后，视网膜前体细胞经历有丝分裂后停滞并启动谱系分化，形成成熟视网膜类器官（OC-2M）。光感受器谱系定向的前体细胞发育于视网膜类器官的最外层。这些CRX+ 和RCVRN+ 光感受器细胞在形态上成熟，表现出类似内节的突起。该方法可用于利用人胚胎干细胞（hESCs）和诱导性多能干细胞（iPSCs）生成视网膜类器官。所有步骤和操作均得到清晰阐述与演示，以确保可重复性，并促进其在基础科学和转化研究中的广泛应用。

引言

视网膜是位于脊椎动物眼球后部的一种对光敏感的组织，通过一种称为光转导通路的生化现象将光信号转化为神经冲动。视网膜中的感光细胞产生的初始神经冲动被传递至其他视网膜中间神经元和视网膜神经节细胞（RGCs），并最终到达大脑的视觉皮层，从而实现图像感知和视觉反应。

根据世界卫生组织（WHO）估计，全球约有150万名儿童失明，其中100万位于亚洲。遗传性视网膜营养不良（IRD）是一种主要致盲性疾病，全球每4,000人中约有1人受其影响。1,2,3，而发展中国家与年龄相关性黄斑变性（AMD）相关的盲症患病率介于0.6%至1.1%之间4. 视网膜遗传性疾病（IRDs）由300多个与视网膜发育和功能相关的基因遗传性缺陷引起5此类基因改变会导致视网膜正常功能受损，以及视网膜细胞（即光感受器细胞和视网膜色素上皮细胞（RPE））的逐渐退化，从而引起严重的视力丧失甚至失明。在涉及角膜、晶状体等其他致盲性疾病的治疗方面已取得巨大进展。然而，截至目前，视网膜营养不良和视神经萎缩尚无任何经证实有效的治疗方法。由于成年人大脑中的视网膜不含干细胞6，其他来源如胚胎干细胞（ESCs）和患者来源的诱导多能干细胞（iPSCs）可提供无限量的目标细胞类型，在构建复杂组织类器官方面具有巨大潜力，可用于 体外 疾病建模研究及再生治疗开发7,8,9,10.

多年来的视网膜研究加深了人们对调控早期视网膜发育的分子事件的理解。目前大多数从多能干细胞（PSCs）生成视网膜细胞和三维类器官的方案均旨在重现这些发育过程 体外 通过在含有多种生长因子和小分子的复杂培养体系中逐步调控已知的生物学过程来培养细胞。由此生成的视网膜类器官包含主要的视网膜细胞类型：视网膜神经节细胞（RGCs）、中间神经元、光感受器细胞和视网膜色素上皮细胞（RPE）11,12,13,14,15,16,17,18,19尽管已成功尝试利用视网膜类器官建立遗传性视网膜疾病（IRDs）模型，但大多数实验方案仍面临重大挑战，主要体现在分化过程中需要复杂的生长因子和小分子化合物组合，且视网膜类器官生成效率相对较低。这些方案主要包括胚状体的形成，随后在不同发育阶段采用复杂的培养条件，逐步将其分化为视网膜谱系 体外 发育20,21,22.

本文报道了一种从健康对照和视网膜疾病特异性人诱导多能干细胞（hiPSCs）高效且稳健地生成复杂三维神经视网膜类器官的简化方法。该方案采用接近汇合的hiPSC培养物进行直接分化，无需形成拟胚体。同时，培养基成分得到简化，使该技术成本较低且可重复性强，便于新研究人员快速掌握。该方法采用一种混合培养系统：在视网膜分化的前4周采用贴壁单层培养，直至出现明显、自组织形成的视泡前体细胞簇（EFPs）。随后，手动挑选每个EFP中形成的环状神经视网膜岛状结构，并将其转入悬浮培养1至2周，以生成包含PAX6+和CHX10+增殖性神经视网膜前体细胞的多层三维视杯或类器官。将视网膜类器官在含100 µM牛磺酸的培养基中进一步延长培养4周后，可分化出RCVRN+和CRX+的光感受器前体细胞及具有初步内节样突起的成熟细胞。

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方案

所有涉及人诱导多能干细胞（hiPSCs）的实验均在无菌条件下进行，严格遵守标准实验室操作规范、伦理及生物安全指南，并获得机构伦理委员会（IEC）、机构干细胞研究委员会（IC-SCR）和机构生物安全委员会（IBSC）等监管机构的批准。

1. iPSC 培养及视网膜分化培养基与试剂的准备

  1. iPSC 培养与维持培养基
    1. 在基底膜基质包被（见材料表）的培养板上，使用 Essential 8 培养基，在无饲养层条件下培养和维持正常的人诱导多能干细胞系23 （hiPSC-F2-3F1）以及经 CRISPR 编辑的 RB1-/- 人诱导多能干细胞系（LVIP15-RB1-CS3，该细胞系在人类 RB1 基因的第 18 外显子内存在双等位基因的 10 bp 移码缺失）。
      注：通过将基底膜基质替换为重组纤连蛋白（VTN-N）包被，可使本方案完全实现无异源成分。通过向 Essential 8 培养基中添加 50x Essential 8 补充剂（随 Essential 8 培养基试剂盒提供；见材料表）和 100 U/mL 青霉素-链霉素溶液，制备完全的 Essential 8 培养基。 alternatively，也可使用完全 mTeSR1 培养基培养 hiPSCs。
  2. 细胞解离液（1x CDS）
    1. 为实现无酶解离和人 iPSCs 的传代，配制含有 0.5 mM EDTA（pH 8.0）和 30 mM NaCl 的 1x Dulbecco 磷酸盐缓冲液（DPBS）中的 CDS（见材料表）。
    2. 配制 100 mL 的 1x CDS：将 100 µL 的 0.5 M EDTA 和 1 mL 的 3 M NaCl 储存液加入 99 mL 的 1x DPBS 中，充分混匀，并使用 0.22 µm 滤器过滤除菌。
  3. 分化诱导培养基（DIM）
    1. 使用 DMEM-F12 基础培养基配制 DIM，添加 10% Knockout 血清替代物（KOSR）、1x 非必需氨基酸（NEAA）、2 mM GlutaMax、100 U/mL 青霉素-链霉素、200 µM L-抗坏血酸和 1% N2 补充剂（见材料表）。
  4. 视网膜分化培养基（RDM）
    1. 使用 DMEM-F12 基础培养基配制 RDM，添加 10% Knockout 血清（KOSR）、1x 非必需氨基酸（NEAA）、2 mM GlutaMax、100 U/mL 青霉素-链霉素、200 µM L-抗坏血酸和 2% B27 补充剂（含维生素 A）（见材料表）。
  5. 包被细胞外基质的细胞培养表面
    1. 将符合 hESC 标准的基底膜基质在冰桶中过夜解冻，最好置于 4–8 °C 冰箱内。将解冻后的 100x 基质原液（5 mL）按 1:5 比例稀释，加入 20 mL 冰冷的 DMEM-F12 基础培养基，轻轻旋转混匀，制备 20x 储存液。
      1. 使用预冷的移液器吸头和无菌微量离心管，在冰上分装成每份 0.5 mL。标记为 20x 储存液，并于 -80 °C 冰箱中冷冻保存，可保存长达 6 个月。
    2. 为包被细胞培养表面（培养皿或 6 孔板），将一份 20x 基质在冰上解冻，并用冰冷的 DMEM-F12 基础培养基按 1:20 比例稀释，制备 10 mL 的 1x 基质包被液，足以包被一个 100 mm 培养皿或一个 6 孔板（每孔 1.5 mL）。
      注：在操作基质溶液前，通过吸取冰冷且无菌的 DPBS 对移液器/吸头进行预冷。基质的解冻及所有操作均需在冰上进行，并使用预冷的移液器/吸头，以避免在室温下发生聚合和凝胶化。
    3. 向 6 孔板的每个孔中加入 1.5 mL 的 1x 基质包被液，轻轻旋转培养板以确保均匀包被，并将培养板置于 37 °C、5% CO2 培养箱中孵育。静置至少 1 小时，以确保基质在培养表面均匀包被。
    4. 接种细胞前，使用 5 mL 无菌移液管吸除包被液，并弃去废液。立即加入新鲜培养基（6 孔板每孔 2 mL），并以每孔 150,000–200,000 个细胞的密度接种细胞。操作过程中切勿让培养板干燥。
      注： alternatively，可使用终浓度为 0.5 µg/mL 的重组纤连蛋白（VTN-N）进行包被，以实现无异源成分的培养方案。

2. 建立人iPSC培养体系

  1. 人诱导多能干细胞（hiPSC）的解冻与复苏
    1. 用1倍膜基质溶液包被6孔板中的一个孔。在37 °C下孵育1小时，以使基质充分聚合并均匀覆盖培养表面。
    2. 孵育1小时后，吸除包被液，并在复苏细胞前加入1 mL预热的含10 µM Rho激酶抑制剂Y-27632（1 µL/mL的10 mM母液；参见材料表）的完全Essential 8培养基。
    3. 从液氮容器中取出一支hiPSC冻存管（1 × 106 个细胞/管），在37 °C水浴中快速轻轻摇动解冻。
      注意：不要完全解冻冻存管；记录传代次数，对冻存管表面进行消毒，并用含70%异丙醇的无尘棉签擦拭干燥。
    4. 使用无菌1 mL移液枪头，将冻存管内容物吸移至含有2 mL预热的不含Y-27632的完全Essential 8培养基的新鲜15 mL离心管中。在室温下以1,000 × g离心4分钟，弃去上清液。
    5. 将细胞沉淀重悬于1.0 mL含10 µM Y-27632的完全Essential 8培养基中。
    6. 将细胞悬液沿孔壁缓慢加入已包被基质的培养表面，避免扰动基质层。轻轻横向摇动培养板，确保细胞均匀分布。
    7. 将培养板置于37 °C、5% CO2培养箱中孵育，使细胞贴壁并开始增殖。
    8. 12–24小时后，更换耗尽的培养基，并用预热的不含Y-27632的完全Essential 8培养基继续培养。
    9. 每24小时更换一次培养基，当细胞融合度达到70%–80%时进行传代。
      注意：hiPSC培养通常采用1:6的传代比例，每隔3–4天定期传代一次。
  2. hiPSC的传代与铺板以启动视网膜谱系分化
    1. 吸除6孔板中融合度为70%–80%的人iPSC培养物中的耗尽培养基。
    2. 向每孔加入1 mL CDS（步骤1.2），在37 °C孵育5–7分钟，直至细胞变圆。小心吸除CDS，注意不要使细胞脱落，然后加入2 mL新鲜Essential 8培养基，用移液器轻轻吹打混匀。
    3. 将6孔板中一个孔的细胞悬液收集至15 mL离心管中，在室温下以1,000 × g离心4分钟，弃去上清液。
    4. 将细胞沉淀重悬于1.2 mL Essential 8培养基中，并将200 µL细胞悬液（1:6传代比例）分装至含有1.5 mL含10 µM Y-27632的iPSC培养基的基质包被6孔板的每个孔中 ，具体操作如步骤1.5所述。
    5. 12–24小时后，更换耗尽的培养基，并用预热的不含Y-27632的完全Essential 8培养基继续培养。
    6. 每24小时更换一次培养基，直至细胞融合度达到70%–80%。

3. 将人诱导多能干细胞分化为视泡及视网膜细胞系

注意：分化过程的示意图见图1。

  1. 当hiPSC培养物达到70%-80%融合度时，启动分化程序。
  2. 第0天，将hiPSC维持培养基更换为含1 ng/mL bFGF和1 ng/mL Noggin的DIM（步骤1.3）。每孔6孔板加入2.0 mL培养基，于37 °C、5% CO2培养箱中培养细胞。
    注意：逐步撤除bFGF可诱导PSC分化，而在初始阶段添加浓度递增的Noggin（多种BMP的抑制剂）可诱导外胚层谱系分化和神经化11,12 ，并阻断中胚层和内胚层的定向分化。也可用LDN193189替代Noggin。与先前报道的双SMAD抑制策略20,21不同，本方案无需添加Activin或SB-431542。
  3. 第1天，更换耗尽的培养基，加入含1 ng/mL bFGF和10 ng/mL Noggin的DIM。每孔6孔板加入2.0 mL培养基。于37 °C、5% CO2培养箱中孵育并维持细胞。
  4. 第2-3天，移除耗尽的培养基，加入仅含10 ng/mL Noggin的DIM。每孔6孔板加入2.0 mL培养基，并每24小时更换一次培养基。于37 °C、5% CO2培养箱中孵育并维持细胞。
    注意：使用前务必预先将培养基升温至30-37 °C。早期分化培养中可能出现较多漂浮细胞和死亡细胞。在此情况下，可用1x DPBS清洗培养物一次，然后加入视网膜分化培养基。可根据需要每周或按需对耗尽的培养基进行无菌检测。
  5. 第4天，移除耗尽的培养基，加入RDM（步骤1.4）。每孔6孔板加入2.0 mL培养基，并继续在37 °C、5% CO2培养箱中以RDM维持培养，每天更换新鲜培养基。
    注意： alternatively，PSCs也可从第1-3天起在非黏附性、圆底96孔板中以悬浮培养方式生长，细胞密度为5 x 103 细胞/100 µL/孔，在与DIM相同的培养条件下形成拟胚体（EBs）。第4天形成的结构良好的EBs可接种至包被基质的培养板中，加入RDM使其贴壁、增殖并进一步分化，具体操作如下所述。
  6. 约在第14-18天，在显微镜下以10倍物镜观察培养物，检测出现类似神经玫瑰花环样结构的早期眼场前体细胞区域（图2B）。
  7. 约在第21-28天（3-4周），在显微镜下以4倍和10倍物镜观察培养物，检测自组织形成的、界限清晰的EFPs，其特征为中心区域存在圆形三维神经视网膜结构，周围环绕连续延伸的神经上皮和眼表上皮（图2C,D）。
    ​注意：在正常hiPSC视网膜分化培养的6孔板每孔中，可观察到约20-30个EFPs。该数量可能因其他疾病特异性hiPSC系的遗传背景及其视网膜谱系分化潜能不同而有所差异。

4. 视网膜类器官的收获

  1. 使用火焰拉制玻璃巴斯德吸管以手动挑选视网膜杯
    注意：眼区挑选应使用已灭菌的玻璃巴斯德吸管。
    1. 打开本生灯。取一支无菌巴斯德吸管，一手握住吸管基部，另一手握住毛细管尖端。将毛细管尖端中部附近区域置于火焰中进行灼烧灭菌，并边加热边旋转，直至玻璃变软。随后移开火焰，迅速向外拉伸，形成带有封闭管腔的细长毛细管尖端。
    2. 将细尖端水平持于火焰前方，迅速向外通过火焰，以形成光滑的钩状或L形毛细管尖端。
    3. 使用毛细管钩的光滑外侧弧面区域作为精细铲子，轻柔地抬起并分离出完整的神经视网膜杯状结构，使其脱离EFP细胞簇。
      注意：玻璃毛细管钩的平滑角度既不会对细胞造成损伤，也不会在培养表面产生划痕。这种简单的工具还可有效用于将单个hiPSC集落按网格模式分割，并在克隆扩增过程中以小细胞团的形式传代。
  2. 培养和维持视杯以生成三维视网膜类器官
    1. 在第25至30天，于准备收获神经视网膜杯前，向低吸附60 mm培养皿中加入4.0 mL预热的视网膜分化培养基。
    2. 在体视显微镜下以0.63倍至4.5倍的放大倍数操作，观察并手动挑选形态良好的神经视网膜杯状结构，每个EFP单独处理。
      注意：色素化的视网膜色素上皮（RPE）细胞向外生长的形态有助于轻松识别眼样结构（EFPs）以及位于中央的神经视网膜杯状结构。视网膜杯呈现为环形、透光的三维结构，形似甜甜圈，具有清晰的放射状条纹，由线性排列并自组装的视网膜干细胞形成；相比之下，中枢神经系统神经元或神经嵴细胞则形成紧密堆积的球形或不规则簇状结构。23.
    3. 使用火焰拉制的巴斯德移液管钩轻轻推动并挖取单个EFP中的中央神经视网膜岛。
    4. 将1 mL移液器调节至吸取100 µL，使用带有宽口的1 mL微孔吸头吸取并转移漂浮的视网膜类器官至步骤4.2.1中准备好的新鲜低吸附培养皿中。
      注意：使用孔径更小的吸头和更高的吸力可能导致视网膜杯发生剪切，影响其完整性。视网膜杯的直径约为1-2 mm。
    5. 将视网膜类器官置于RDM中以非贴壁悬浮培养方式维持，并在37 °C、5% CO₂条件下孵育2 培养箱
    6. 第30–45天：轻轻倾斜培养皿，更换培养基，每日一次，让视网膜类器官沉降约30秒。采用半量换液法，移除一半体积的用过的培养基，并加入等体积的新鲜培养基。
      注意：避免反复吸液和转移，以防对视网膜杯造成损伤。经过1-2周的悬浮培养后，视网膜杯体积略有增大（1-3 mm），并发育为自组织形成的三维视网膜类器官（OC-1M），其中包含呈线性排列的早期神经视网膜前体细胞，表达PAX6和CHX10。图3Bi).
    7. 第45–60天：将视网膜类器官继续培养4天 含100 µM 牛磺酸的RDM中培养数周（参见 材料表以支持神经视网膜前体细胞的更好存活和谱系分化，以及成熟视网膜细胞类型（OC-2M）的发育。
      注意：从EFPs中挑选出的视网膜或视杯约有70%–80%保持完整，维持其层状结构，并在悬浮培养4周（OC-2M）后发育为成熟的视网膜类器官。
    8. 检查悬浮培养4周后成熟的视网膜类器官，是否在外层细胞层出现RCVRN+和CRX+的光感受器前体细胞及具有初步内节样突起的成熟细胞，从而重现正常的视网膜发育与成熟过程 体外 (图 3Bii).
      注意：去除神经视网膜杯后，分化培养物可在RDM中持续维持。围绕神经视网膜的近端上皮外延生长区域含有视网膜色素上皮（RPE）细胞前体，这些前体可进一步扩展并成熟，形成具有典型鹅卵石样形态的色素化RPE单层细胞图4。远端外生物主要由眼表上皮构成，该上皮参与晶状体和角膜的形成上皮组织 可以从EFP外植体的不同区域收获目的细胞类型，并进一步富集以建立纯化培养物。

5. 视网膜类器官的表征

  1. 形态学与分子表征
    1. 在相差显微镜下以4倍和10倍放大倍数观察贴壁的EFPs和悬浮的视网膜类器官，并记录其形态和尺寸。
    2. 收集约20个处于不同成熟阶段的视网膜类器官（步骤4.2.3–4.2.6），使用宽口1,000 µL吸头转移至1.5 mL微量离心管中。待类器官沉降至管底后，吸除培养基。用1× PBS洗涤类器官。
    3. 除去多余的 PBS，加入 1.0 mL TRIzol 试剂（参见 材料表). 室温孵育5分钟。使用管状研杵匀浆组织，并用1.0 mL移液器吹打混悬。
    4. 按照试剂生产商提供的说明，采用标准的RNA提取与纯化试剂方法制备总RNA（参见 材料表).
    5. 在琼脂糖凝胶上检测RNA质量，并使用NanoDrop分光光度计进行定量（参见 材料表).
    6. 使用逆转录酶，按照制造商说明书将1-2 µg总RNA反转录为cDNA（参见 材料表）。参见 表1 有关基因特异性引物列表，请参见。
    7. 简而言之，按前述方法配制总体积为10 µL的RNA引物混合液 表 2 在65 °C下于热循环仪中孵育该离心管5分钟。将离心管从热循环仪转移至冰上，孵育2分钟。
    8. 同时，使用前述试剂配制主混合液2 表3将此混合液加入步骤5.1.7中制备的RNA引物混合管中，轻轻混匀。
    9. 将样品在50 °C孵育50分钟，然后在85 °C孵育5分钟，最后置于4 °C以终止反应。
    10. 以合成的cDNA为模板进行PCR反应，检测神经视网膜前体细胞和成熟视网膜细胞标志物的表达。
    11. 使用看家基因（如 hE1fα 或 GAPDH）通过半定量 PCR 对各样本的总 cDNA 模板进行标准化，这些样本包括 F2-UD（hiPSC-F2-3F1；未分化细胞）、OC-1M（悬浮培养中培养1周的视杯）和 OC-2M（悬浮培养中培养4周的视杯）。
    12. 准备半定量 PCR 的主混合液，如前所述 表 4，并将待扩增的检测样本管放入热循环仪中。PCR 扩增条件详见于 表5.
  2. 组织学与免疫组织化学
    1. 将视杯收集至2.0 mL微量离心管中，并吸除多余培养基（步骤4.2.3–4.2.6）。用1× PBS冲洗类器官，随后将其洗涤并悬浮于500 µL 4%多聚甲醛中，在室温下固定过夜。
    2. 次日，用去离子水清洗杯具。将杯具置于95%乙醇中浸泡（换液三次，每次15–20分钟），随后置于100%乙醇中（换液三次，每次15–20分钟），再用无水乙醇与二甲苯等体积混合液处理15分钟，接着置于二甲苯中（换液两次，每次15分钟），最后置于石蜡中（换液三次，每次15分钟）。按照标准程序包埋组织以制备石蜡块，冷却并使其完全凝固。
    3. 使用切片机制备薄切片（厚度约4-5 µm），并将切片置于硅烷涂层的显微镜载玻片上（参见 材料表）按照标准组织学操作流程进行。
    4. 脱蜡时，将切片置于加热板上于 70 °C 加热 15–20 分钟。待石蜡熔化后，用二甲苯洗涤切片（换液三次，每次 3–4 分钟），以彻底去除石蜡。
      注意：石蜡去除不完全会导致切片染色不良或不均，并产生大量背景噪声。
    5. 使用不同浓度的乙醇（100%、90% 和 80%）对切片进行复水，每种浓度各 3 分钟。用蒸馏水冲洗切片，随后进行抗原修复。
    6. 开始抗原修复前，将柠檬酸盐缓冲液（pH 6.0）置于Coplin染色缸中预热（参见 材料表使用微波炉加热至95-100 °C。
    7. 将切片浸入预热的柠檬酸盐缓冲液中，置于微波炉内加热15分钟。从微波炉中取出玻片缸，室温下冷却。
    8. 使用甲醇与过氧化氢的1:1混合液孵育5分钟，以阻断内源性过氧化物酶活性，随后用1×PBS洗涤切片3次。
    9. 使用0.5% Triton-X 100处理切片15分钟以进行通透。用1×PBS洗涤载玻片三次。
    10. 用含10%胎牛血清（FBS）的1×PBS孵育切片1小时，以阻断一抗的非特异性结合。
    11. 在室温下孵育切片与一抗1小时，或在4°C过夜。用1×PBS洗涤载玻片三次，每次3-5分钟，以去除未结合的抗体。
    12. 加入合适的荧光染料标记的二抗，孵育45分钟。用1×PBS洗涤切片3次，每次3-5分钟。
      注意：抗体及其相应的稀释比例已在下文提及 材料表使用PAX6和CHX10对视网膜类器官切片进行免疫标记，以检测早期神经视网膜前体细胞；使用Recoverin和CRX进行免疫标记，以检测已定向分化的视网膜前体细胞及光感受器前体细胞。类似地，通过二维单层培养细胞的免疫细胞化学染色，使用抗PAX6和抗MITF抗体检测视网膜色素上皮（RPE）前体细胞，使用抗CRALBP和抗RPE65抗体检测色素化的成熟RPE细胞。
    13. 用 DAPI 或 PI 对切片进行复染，并使用抗荧光淬灭封片剂将切片封于载玻片上（参见 材料表).
    14. 使用荧光显微镜或共聚焦激光扫描显微镜对视网膜类器官和视网膜色素上皮（RPE）培养物的免疫标记切片进行成像和记录，以观察表达不同视网膜标志物的各个细胞层。

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结果

通过在不同时间点分阶段使用含有补充剂和生长因子的不同培养基组合对hiPSCs进行培养，可实现其向眼谱系的分化，具体方法如所述。 图1hiPSC 细胞培养物在Essential 8培养基（一种多能干细胞维持培养基）中维持培养。当细胞汇合度达到70%–80%时（图2A)，在第0天将培养基更换为含1 ng/mL bFGF、1 ng/mL Noggin和1% N2补充剂的分化诱导培养基（DIM）（参见步骤3.2）。N2补充剂具有神经诱导作用，而Noggin作为BMP信号通路抑制剂，可通过阻断中胚层和内胚层分化，对引导细胞向神经外胚层谱系分化发挥关键作用。在第1天st, 2nd3rd 天起，Noggin 的浓度增加至 10 ng/mL（参见步骤 3.3 和 3.4）。从第 4th 第几天，将DIM替换为视网膜分化培养基（RDM）（步骤3.5），培养物持续培养至多30天。RDM培养基中的B27含有多种附加补充成分，如多种抗氧化剂和D-半乳糖，可...

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讨论

hiPSCs 是研究器官和组织发育的有力工具 体外 通过将健康个体与疾病特异性的人诱导多能干细胞（hiPSCs）向视网膜谱系分化，模拟疾病表型，有助于深入理解不同类型遗传性视网膜营养不良的病理生理机制。目前已报道并采用多种方案用于 体外 将PSCs分化为视网膜细胞类型。大多数方法涉及使用含有复杂混合物的培养基，包括重组生长因子、添加剂、小分子和试剂，例如：N1、N2和B27添加剂；BMP和TGFβ信号通路阻断剂如Noggin、SB431542、LDN193189和Follistatin，或诱导剂如Activin A、Lefty和IDE1；经典Wnt信号通路阻断剂如DKK1、SFRP、IWP-2和IWR-1-endo，或诱导剂如CHIR99021、SB216763和CKI-7；FGF受体信号通路阻断剂如PD0325901和PD173074，或诱导剂如bFGF；Notch信号通路抑制剂如DAPT；其他信号分子如胰岛素样生长因子（IGF-1）；视黄酸；生长激素如三碘甲状腺原氨酸（T3）和氢化可的松；以及抗氧化剂和其他促存活因子如抗坏血酸、烟酰胺、牛磺酸、二十二碳六烯酸、1-硫代甘油等。这些成分在干细胞分化的...

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披露

所有作者均无利益冲突或财务披露。

致谢

作者感谢海得拉巴LV普拉萨德眼科研究所的遗传学家Chitra Kannabiran博士、视网膜顾问Subhadra Jalali博士、眼整形外科医生Milind Naik博士以及眼肿瘤学家Swathi Kaliki博士在建立正常及患者特异性iPSC细胞系过程中提供的科学与技术支持。作者感谢R&印度政府科学与工程研究委员会、科学技术部（IM）（SB/SO/HS/177/2013）、生物技术部（IM）（BT/PR32404/MED/30/2136/2019）提供的资助，以及印度医学研究理事会（S.M.，D.P.）、大学 Grants 委员会（T.A.）和科学与工业研究理事会（V.K.P.）提供的高级研究奖学金。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
0.22 µm 注射器滤器TPP99722 
15 mL 离心管TPP91015
50 mL 离心管TPP91050
6 孔板TPP92006
抗 Chx10 抗体；小鼠单克隆Santa CruzSC3655191:50 稀释
抗 CRX 抗体；兔单克隆Abcamab1406031:300 稀释
抗 MiTF 抗体，小鼠单克隆Abcamab32011:250 稀释
抗 Recoverin 抗体；兔多克隆     MilliporeAB55851:300 稀释
B-27 添加剂（50 倍浓度），无血清Thermo Fisher17504044
碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）Sigma AldrichF0291
Centrifuge 5810R 离心机Eppendorf
Coplin 染色缸（50 mL）Tarson
Corning Matrigel hESC 认证基质Corning354277
冻存管（CryoTubes）Thermo FisherV7884
DMEM/F-12，含 GlutaMAX 添加剂（基础培养基）Thermo Fisher10565-018
DreamTaq DNA 聚合酶Thermo FisherEP0709
Dulbecco’s 磷酸盐缓冲液Thermo Fisher14190144
Essential 8 培养基试剂盒Thermo FisherA1517001
乙二胺四乙酸二钠盐二水合物（EDTA）Sigma AldrichE5134
Falcon 非组织培养处理培养皿，60 mm Corning351007
胎牛血清，经认证，美国来源   Gibco26140079
配备 Image Lab 软件的 GelDocXR+ 系统BIO-RAD琼脂糖凝胶成像系统 
GlutaMAX 添加剂Thermo Fisher35050061
山羊抗小鼠 IgG（H+L），Alexa Fluor 488 标记InvitrogenA110011:300 稀释
山羊抗小鼠 IgG（H+L），Alexa Fluor 546 标记InvitrogenA110301:300 稀释
山羊抗兔 IgG（H+L），Alexa Fluo 546 标记InvitrogenA110351:300 稀释
山羊抗兔 IgG（H+L），Alexa Fluor 488 标记InvitrogenA110081:300 稀释
HistoCore MULTICUT 切片机Leica用于切片
KnockOut 血清替代物Thermo Fisher10828028
L-抗坏血酸Sigma AldrichA92902
MEM 非必需氨基酸溶液（100 倍浓度）Thermo Fisher11140-050
N2 添加剂（100 倍浓度）Thermo Fisher17502048
NanoDrop 2000 核酸定量仪Thermo Fisher用于 RNA 定量
多聚甲醛Qualigens23995
巴斯德吸管，9 英寸，非无菌，未堵塞Corning7095D-9
青霉素-链霉素 Thermo Fisher15140-122
重组抗 Otx2 抗体，兔单克隆Abcamab1839511:300 稀释
重组抗 PAX6 抗体；兔单克隆Abcamab1950451:300 稀释
重组抗 RPE65 抗体，兔单克隆Abcamab2317821:300 稀释
重组人 Noggin 蛋白R&D Systems6057-NG
SeaKem LE 琼脂糖Lonza50004
血清移液管，10 mLTPP94010
血清移液管，5 mLTPP94005
氯化钠Sigma AldrichS7653
柠檬酸三钠二水合物Sigma AldrichS4641
Starfrost（硅烷涂层）载玻片Knittel
SuperScript III 第一链合成系统Thermo Fisher18080051
用于 RT-PCR 的 SuperScript III 第一链合成系统Invitrogen18080051
Triton X-100Sigma AldrichT8787
TRIzol 试剂Invitrogen15596026
UltraPure 0.5 M EDTA，pH 8.0Thermo Fisher15575020
含 DAPI 的 VECTASHIELD 抗荧光淬灭封片剂 Vector laboratoriesH-1200 
玻连蛋白（Vitronectin）Thermo FisherA27940
Y-27632 二盐酸盐（Rho 激酶抑制剂）Sigma AldrichY0503
Zeiss LSM 880 共聚焦显微镜Zeiss共聚焦显微镜

参考文献

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