活细胞成像技术在完整样本中的应用 离体 使用新型3D打印支架的球形体培养

摘要

本研究描述了一种利用3D打印支架实现去核眼球高分辨率活细胞成像的新型实验方案。通过该方案，可观察角膜上皮损伤后去核眼球中细胞钙信号活动 离体 眼球可在实时下被观察到。

摘要

角膜上皮伤口愈合是一种由上皮细胞表面表达的嘌呤能受体激活所启动的迁移过程。受体激活引发钙离子动员事件，并在细胞间传播，这对于启动细胞向伤口区域移动、促进高效伤口愈合至关重要。Trinkaus-Randall 实验室已建立一种成像方法，用于观察角膜伤口愈合反应 离体 小鼠眼球的实时成像。该方法包括按照既定方案实施安乐死的小鼠中完整摘除眼球，并立即用钙离子指示剂染料孵育眼球。在此阶段可施加一种复染剂，以标记细胞的其他结构特征，辅助成像并显示细胞解剖标志。本方案已成功结合多种不同的活细胞染料用于复染，包括SiR-肌动蛋白（SiR actin）用于标记肌动蛋白，以及深红细胞膜染料（deep red plasma membrane stain）用于标记细胞膜。为研究伤口反应，使用25 G针头损伤角膜上皮，随后将眼球置于3D打印的固定装置中。该3D打印装置的尺寸经过校准，可在整个实验过程中确保眼球的稳定固定，并可根据不同大小的眼球进行调整。利用共聚焦显微镜，对伤口反应进行随时间推移的多深度连续活细胞成像。本方案可使用共聚焦显微镜配备的20倍空气物镜获得高分辨率、适合发表的图像。其他物镜也可用于本方案。该方法显著提升了活细胞成像的质量 离体 小鼠眼球，并可识别神经和上皮组织。

引言

角膜
角膜是覆盖在眼球前表面的一层透明、无血管的结构，具有屈光作用，可使光线聚焦以实现视觉功能，同时保护眼球内部免受损伤。由于角膜直接暴露于外界环境，因此容易受到机械性损伤（如划伤）和感染的影响。在其他方面健康的患者中，角膜损伤通常可在1-3天内愈合。然而，对于患有角膜缘干细胞缺乏症或II型糖尿病等基础疾病的患者，角膜伤口的愈合过程可能显著延长¹。由于角膜富含神经，这些难以愈合的角膜溃疡和复发性角膜上皮脱落会引发剧烈疼痛，极大降低患者的生活质量¹。

细胞信号传导
当原本健康的角膜受到损伤时，伤口周围细胞中的钙信号事件会先于细胞迁移发生，并促使这些细胞移入伤口区域，从而在无瘢痕风险的情况下闭合损伤^2,3这些信号事件已在角膜上皮细胞培养模型中通过活细胞成像得到充分表征。²初步实验表明，与糖尿病细胞相比，非糖尿病细胞在损伤后表现出显著增强的钙信号传导。然而，对细胞信号转导事件的表征仍需进一步研究。 离体 眼球的制备已被证明是一项技术挑战。

活细胞成像
以往的研究已成功记录了角膜创伤愈合的体外细胞培养模型中的钙信号事件^4,5,6。开发一种用于在离体组织中获取这些信号事件高质量图像的方法具有重要意义，因为它能够在更复杂且更接近真实的生命系统中研究这些事件。以往的方法包括将角膜解剖后，固定于紫外光诱导的聚乙二醇（PEG）凝胶中^7,8,9。在活体组织实验中，固定是一个关键但具有挑战性的步骤，因为组织在整个实验过程中必须保持活性和充分水合状态。此外，固定过程不得对组织造成损伤。尽管PEG溶液能够实现组织固定，但所获得图像的分辨率和质量并不稳定。因此，研究人员开发了3D打印支架，用于固定完整的眼球，以在降低组织损伤风险的同时获得更高质量的图像。

该方法
一种独特的3D打印支架被开发用于固定完整的 离体 用于活细胞成像的眼球固定装置。该固定装置可防止来自两个主要来源的损伤：它能够在无需解剖角膜的情况下对去核眼球进行成像，并避免样品暴露于紫外光下。由于消除了这些损伤因素，所获得的图像能更准确地反映实验中划痕损伤后的细胞反应。此外，该3D打印固定装置根据小鼠眼球的精确尺寸进行校准，相比聚乙二醇（PEG）溶液固定法，能实现更佳的贴合效果，从而在较低倍物镜下即可获得更高质量的图像，原因在于组织移动显著减少。固定装置顶部附带的覆盖条可确保眼球在整个实验过程中保持静止，并在添加培养基以维持组织水合状态和活性时防止眼球发生位移。该装置可根据精确尺寸进行打印的特性，还使我们能够针对因年龄或疾病状态不同而导致眼球尺寸差异的小鼠，制作出最适配的固定装置。该技术亦可进一步推广，用于根据不同物种眼球的尺寸开发相应的成像固定装置。

方案

涉及动物受试者的实验程序已获得眼科护理与视觉研究动物使用协会（Association for Research in Vision and Ophthalmology）以及波士顿大学IACUC方案（201800302）的批准。

1. 设计3D打印支架和覆盖条

1. 根据小鼠眼球的平均直径设计3D打印支架和覆盖条，并进行3D打印（图1A，B）。
2. 支架内壁的直径应略大于眼球的平均直径，以适应不同个体小鼠的尺寸差异。支架高度约为眼球直径的一半，确保在使用3D打印的覆盖条固定时，眼球能够紧密贴合。
3. 覆盖条的长度应与支架外径一致，宽度为支架直径的1/4至1/2。覆盖条的尺寸设计应便于实验过程中对固定在支架内的眼球进行加湿操作，并在实验结束时方便摘除眼球。
4. 打印支架和覆盖条。

2. 样本采集

1. 采用符合机构指南的既定方案处死小鼠（本研究使用9至12周龄及27周龄的雄性C57BL/6小鼠）。在本方案中，先使用二氧化碳实施安乐死，随后进行断头。
2. 取下小鼠头部并立即置于冰上，以保持组织活性。使用解剖工具摘除眼球，操作过程中避免组织损伤。
3. 用镊子将眼球突出。用解剖剪在镊子夹持位置稍下方剪断视神经。
   注意：为确保安全，后续步骤应在超净工作台内进行。
4. 将眼球置于含2 mL培养基的p35细胞培养皿中，在37 °C、5% CO₂、低光照条件下孵育1小时，培养基中加入钙离子指示剂和/或细胞膜染料。确保眼球完全浸没于染色液中，以实现均匀染色。
   1. 本实验所用钙离子指示剂为Fluo4-AM（1:100）²，细胞膜复染染料为深红色质膜染料（1:10,000）²，终浓度含1% (v/v) DMSO和0.1% (w/v) 普流罗尼克酸（pluronic acid），溶于2 mL无血清角质形成细胞培养基（KSFM）中，并添加以下生长补充物：25 µg/mL牛垂体提取物、0.02 nM表皮生长因子、0.3 mM CaCl₂，以及青霉素-链霉素（分别为100单位/mL和100 µg/mL）。
      ​注意：孵育条件和时间可根据所用钙离子指示剂、组织类型和样本体积进行调整。使用普流罗尼克酸时需谨慎，因其可增加组织通透性。本方案使用10%普流罗尼克酸。实验表明，较低浓度无效，而较高浓度可能损伤组织。

3. 样品支架的制备

1. 使用未使用过的胶水将支架粘附到干净的玻璃底盖玻片上。本方案中使用的胶水来自一次性容器，以确保无菌，每次均使用新的未开封容器。
2. 用70%乙醇清洗支架。将胶水涂在支架上，并将支架粘附到玻璃底盖玻片上。确保支架内区域无胶水残留，因为胶水可能产生荧光，干扰成像。
3. 等待胶水固化，确认支架牢固地固定在盖玻片上。
   注意：本研究中使用的实验材料为P35细胞培养板，其带有玻璃底盖玻片。可根据实验需求替换为其他玻璃底载玻片和/或培养板。

4. 眼球的损伤处理

1. 使用无菌滴管将眼球从染色液中取出，注意避免损伤目标区域的组织。用无菌磷酸盐缓冲液在室温下清洗眼球 5 分钟，以去除多余的染料，并将眼球置于运输介质中，送往显微镜进行观察。
2. 使用无菌 25 G 针头在目标区域对眼球进行造伤。
   1. 使用无菌滴管从眼球后部夹取并固定眼球，以保持眼球稳定，防止其滚动，从而确保造伤的一致性。在此操作方式下，视神经将位于滴管喷嘴内部，角膜则朝向外侧。
   2. 对于划痕损伤，轻轻将无菌 25 G 针头在暴露的角膜表面划过；对于穿刺损伤，轻轻将针头垂直压入角膜中央区域。注意确保伤口未穿透角膜。
      ​注意：如果实验无需损伤反应或损伤环境，可跳过此步骤。既往研究表明，采用该方法对小鼠角膜造成的划痕和穿刺损伤在直径和深度上均具有一致性¹⁰。不同眼球间伤口尺寸的一致性已通过目标区域分析得到验证。

5. 样品在样品台上的放置

1. 将角膜或角膜缘区域放置在支架内区的盖玻片上，并使用3D打印的盖子固定（图1C-H）。
2. 确认眼球位置正确，且感兴趣区域与玻璃盖玻片接触。一旦将眼球放入支架中，切勿尝试取出，以免造成组织损伤。
3. 使用胶水将3D打印的盖子粘附到支架上，确保固定牢固。注意盖子的横杆应粘附在支架上，而非眼球上。
   ​注意：成像区域朝下放置，因为本方案适用于倒置显微镜。若需适配直立显微镜，可使用内径较小的支架并移除盖子横杆，但会导致眼球稳定性降低。

6. 样品成像

1. 打开显微镜和环境培养箱，并确认培养箱已加湿。将环境培养箱设置为 35 °C 和 5% CO₂，并在整个实验过程中维持该条件。
   注意：建议使用配备环境培养箱的显微镜进行本操作，以防止样品脱水并维持眼球组织在最佳温度条件下，但此设备并非必需。
2. 将盖玻片、支架及稳定的眼球组织置于环境培养箱内的显微镜载物台上，采用活细胞成像技术进行观察⁹。
3. 向盖玻片上额外添加培养基，以防止脱水并维持组织活性。确保孔内有足够的培养基覆盖支架中的眼球组织。根据成像持续时间，在实验过程中按需补充新鲜培养基。
4. 采用活细胞成像技术和相关实验方案开始实验。使用较低的激光功率设置，以保护组织并避免长时间实验中造成组织损伤。选择适合长工作距离的物镜。本研究中使用的实验条件采用 20 倍物镜。
   注意：激光功率与增益、实验持续时间、成像位置和成像平面等参数均需根据具体实验条件进行调整。以往文献已成功报道对完整眼球组织进行持续 1 至 4 小时的成像实验¹⁰。
5. 以首选文件格式记录并保存数据。显微镜所用软件生成 .czi 格式文件用于数据记录。
6. 实验结束后，按照所在机构的标准操作规程处理眼球组织样本。

结果

该方案已持续用于获得可发表质量的数据和图像¹⁰。所获得的图像与以往方法相比具有显著改进（图2）。利用3D打印支架，可对角膜各层进行成像，并可在不同z平面观察钙离子动员情况（图3）。该方法已用于比较年轻和老年小鼠角膜伤口处顶端与基底细胞层之间的细胞间信号传导¹⁰。

改进后的稳定性还使得眼球成像时间显著延长，远超以往可能实现的时长。这使得对细胞迁移进入伤口床的研究得以比以往延长数小时。借助这一延长的时间线，可在角膜损伤后观察到年轻小鼠与老年小鼠在伤口愈合反应中细胞行为的显著差异¹⁰。在本实验方案中，每5分钟采集一次数据，持续4小时。使用该固定装置时，在整个实验过程中，x、y或z轴方向均未观察到明显的漂移（图4，视频1）。

讨论

本方案描述了一种 一种活细胞成像技术，利用3D打印支架固定和稳定完整的动物眼球。该技术旨在克服以往活细胞成像方案中存在的若干显著缺陷 离体 角膜组织。该方案为完整眼球的活细胞成像提供了多种优势。它显著减少了可能干扰实验性划痕伤口愈合反应的非必要组织损伤，包括因解剖操作和暴露于紫外光所导致的神经和上皮损伤。此外，该方案通过固定组织的方式，使培养基能够定期添加而不干扰实验进程，从而维持组织的水合状态和活性。通过调整眼球在支架中的方向，该方案可实现对眼球不同区域的成像。结合共聚焦显微镜使用，该方法可对眼球的不同层面进行成像，从而观察组织结构间的相互作用。该方案具有高度通用性，可适用于小鼠及其他物种不同大小的眼球。支架和盖片可轻松从成像孔中取出，经灭菌后重复使用。3D打印方案高效且节省时间，便于一次性批量制备多个支架。若需保存样本并在日后再次成像，眼球可在支架内进行固定。固定后的组织在固定后数周内仍可保留深红色质膜染料及Fluo4-AM染色信号，这些信号可在针对特定蛋白(s)染色时作为标记物使用。

既往方案要求解剖眼球，随后使用紫外光激活的聚乙二醇（PEG）凝胶...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1.75 蓝色聚乳酸（PLA）塑料	Creality (中国深圳)	N/A	支架材料
35 mm 培养皿，No. 1.5 盖玻片，玻璃直径 14 mm，聚-D-赖氨酸包被	MatTek Corporation (Ashland, MA)	P35GC-1.5-14-C	用于成像的培养小室。
Autodesk Fusion 360 软件	Autodesk (San Rafael, CA)	N/A	用于打印支架的软件
BD 25 G 7/8 无菌一次性针头，100 根/盒	Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA)	305124	用于实验性眼球损伤造模
CellMask DeepRed	Invitrogen (Carlsbad, CA)	C10046	细胞膜反染染料。钙离子指示剂。使用浓度为 1:10,000，终浓度为 1% (v/v) DMSO 和 0.1% (w/v) 普流罗尼克酸
Complete Home 超强胶水	Walgreens (Deerfield, IL)	N/A	用于将支架固定在成像培养皿上
Ender 3 Pro 3D 打印机	Creality (中国深圳)	N/A	用于打印支架
FIJI/ImageJ	ImageJ (Bethesda, MD)	许可证编号：GPL2	用于通过感兴趣区域分析，验证不同独立眼球之间伤口深度和直径的一致性
Fluo-4	Invitrogen (Carlsbad, CA)	F14201	钙离子指示剂。使用浓度为 1:100，终浓度为 1% (v/v) DMSO 和 0.1% (w/v) 普流罗尼克酸
角质形成细胞无血清培养基	Gibco (Waltham, MA)	17005042	添加了 25 mg/mL 牛垂体提取物、0.02 nM EGF、0.3 mM CaCl2 以及青霉素-链霉素（分别为 100 单位/mL，100 µg/mL）的培养基
磷酸盐缓冲液（PBS）	Corning, Medlabtech (Manassas, VA)	21-040-CV	用于成像前清洗角膜上多余的染料
蔡司 AiryScan 共聚焦 880 显微镜	Zeiss (Thornwood, NY)	N/A	使用 20 倍物镜