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方法文章

从植物叶片组织和蓝细菌中分离质体小球脂滴

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DOI：

10.3791/64515

⸱

2022年10月6日

 ,  ,  , 
1Department of Biochemistry and Molecular Biology, Michigan State University, 2Plant Resilience Institute, Michigan State University

本文内容

摘要

本文介绍了一种快速高效分离多种光合生物相关质体小球脂滴的实验方案。成功制备分离的质体小球是开展蛋白质组学和脂质组学等深入分子研究之前至关重要的第一步。

摘要

质体小球脂滴是植物叶绿体和蓝细菌的一个动态亚区室。在光合生物中广泛存在，被认为在快速变化的环境条件下对类囊体膜的适应与重塑起核心作用。高纯度质体小球的分离能力极大地促进了通过蛋白质组学、脂质组学及其他方法对其开展研究。获得高纯度和高得率的质体小球后，即可对其脂质和蛋白质组成、酶活性以及蛋白质拓扑结构等分子特性进行分析。本文介绍了一种从植物叶片组织叶绿体中快速有效分离质体小球的实验方案，并提供了从玉米叶片、复苏植物Eragrostis nindensis的干燥叶组织以及蓝细菌Synechocystis sp. PCC 6803中分离质体小球及相关脂滴结构的方法学变体。该分离方法依赖于这些富含脂质颗粒的低密度特性，从而通过蔗糖密度浮选实现纯化。该方法将对来自多种物种的质体小球研究具有重要价值。

引言

目前对质体小球组成和功能的理解主要基于详细的蛋白质组学和脂质组学研究1,2,3,4,5。这些研究得益于一种快速且高效的方法，该方法利用质体小球极低的密度，通过蔗糖梯度实现有效分离。早期的质体小球分离方法曾在多种物种中成功应用，包括山毛榉（Fagus sylvatica）、苏格兰金雀花（Sarothamnus scoparius）、洋葱（Allium cepa）、菠菜（Spinacia oleracea）、三色堇（Viola tricolor）、辣椒（Capsicum annuum）和豌豆（Pisum sativum）6,7,8,9,10,11,12,13。随后，Ytterberg 等人提出了一种改进的分离方法，能够更高效且得率更高地分离叶绿体质体小球3,14。该方法最初用于研究拟南芥（Arabidopsis thaliana）叶片叶绿体中的质体小球，但我们已成功将其应用于其他单子叶和双子叶植物健康叶片组织的质体小球分离，包括玉米（Zea mays）、番茄（Solanum lycopersicum）、狼尾草（Eragrostis nindensis）、紫穗拂子茅（Brachypodium distachyon）和野生烟草（Nicotiana benthamiana；未发表结果）。此外，该分离方法还被成功应用于蓝藻（如 Synechocystis sp. PCC 6803 和 Anabaena sp. PCC 712015）以及复苏植物 E. nindensis 的干燥叶片组织中的质体小球分离。

健康叶片组织中叶绿体的质体小球与类囊体膜在物理上相连16尽管存在这种物理上的连续性，两个叶绿体亚区室仍保持着不同的脂质和蛋白质组成，尽管已有研究提出两者之间存在受调控的脂质和蛋白质交换机制2,4,17,18,19事实上，最近提出了一种有趣的半融合模型，用于解释中性脂质在叶绿体与细胞质之间的转运过程。19由于质体小球与类囊体在结构上具有物理连续性，因此采用健康叶片组织的分离方法首先收集到的是类囊体粗提物沉淀，随后通过超声处理将质体小球从类囊体上分离，这与用于分离细胞质脂滴的方法不同20通过蔗糖垫进行超速离心后，低密度的质体小球可上浮穿过蔗糖层，从而有效分离出类囊体、细胞核及其他高密度物质。相比之下，蓝细菌中的质体小球以及干燥叶片组织中的质体小球显然存在 体内 以游离形式存在。因此，其分离需直接在蔗糖梯度中进行漂浮。本文展示了从健康叶片组织中分离质体小球的方法，并进一步介绍了两种变体方法，可用于从干燥叶片组织或蓝细菌培养物中分离质体小球，从而极大拓展了质体小球研究的生理范围和进化背景。

分离的质体小球可进一步用于多种下游分析，以研究其分子特征。我们已利用来自 A. thaliana 叶片组织的分离质体小球，在不同环境条件或基因型下进行了深入的蛋白质组学和脂质组学分析，揭示了蛋白质和脂质组成在应对胁迫适应过程中的选择性修饰2,4,21,22。此外，已开展证明与分离质体小球相关的转磷酸化活性的体外激酶实验22，利用天然凝胶电泳研究了蛋白质组分的寡聚状态21，并实施了蛋白酶 shaving 实验23。

该方法的主要优势在于操作步骤相对快速。根据我们的经验，下述方案可在大约4小时内完全完成。已有文献报道了一种从叶片组织中分离质体小球的替代方法，该方法可同时分离其他叶绿体亚区室24。当需要或希望对质体小球与其他叶绿体亚区室进行定量比较时，这种替代方法具有明显优势。然而，该替代方法操作更为繁琐，且从相同量的叶片组织中获得的质体小球产量显著较低。当研究目标集中于质体小球时，本文所述的方法是最优选择。尽管如此，在样品制备过程中仍可收集总叶片和粗制类囊体等分试样，强烈建议同时保留这些样品，以便作为后续比较的参照样本。

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方案

1. 原始质体小球的分离

  1. 从未受胁迫的玉米叶片组织中粗提取质体小球
    1. 选取六株健康玉米幼苗，约3周大，接近V5生长阶段，每株鲜重约120 g。
    2. 剪去茎基部的所有叶片，迅速浸入冰浴中，并转移至冷室。
    3. 在绿色安全灯下操作，将玉米叶片从冰浴中取出，用剪刀剪成较小的片段（约 5 cm × 5 cm）。
    4. 轻轻但彻底地将一半剪碎的叶片组织在350 mL研磨缓冲液中用商用搅拌器研磨表1). 启动并停止搅拌机5至6次，以确保所有叶片被切碎。搅拌机速度不得超过7档。
    5. 将匀浆液通过置于大漏斗上的一层25 µm尼龙布过滤，收集至四个250 mL离心管中。随后，用剪碎的另一半叶片组织重复步骤1.1.4。
    6. 将滤液均匀分装至四个瓶子中，于1,840 x g下离心6分钟 g 在 4 °C 下。在离心前取出一份叶滤液 aliquot，留作代表性的全叶样品保存。
    7. 倒掉上清液，将沉淀物轻轻重悬于 12 mL 含有 0.2 M 蔗糖的 R 0.2 培养基中（表1通过轻轻晃动并用刷子轻柔地搅动重悬沉淀。每次重悬后，将悬液转移至下一个瓶子中，并重复重悬步骤。最后将所有悬液汇集到一个瓶子中。
    8. 将混合后的悬液分装至六个3 mL超速离心管中，每管最大体积为2.5 mL。
    9. 使用探头式超声仪，每个离心管超声处理4次，每次10秒，超声振幅为100%。操作时注意保持超声探头浸没在液面以下，并避免接触液体表面，以防止产生泡沫。
    10. 在每轮超声处理过程中，缓慢地将超声探头在悬浮液中上下移动。轮流处理四个试管，每次超声后立即将试管放回冰桶中，使样品冷却。
    11. 将超声处理后的粗制类囊体悬浮液在150,000 x g条件下离心 g 在4 °C下孵育30分钟。用注射器和22 G针头从蔗糖垫表面收集形成的粗制质体小球浮层（肉眼可见为黄色油状层），通过针头开口轻轻掠过蔗糖垫表面进行收集，每管回收约500 µL。将收集物转移至2.0 mL离心管中。
    12. 在超声处理并释放质体小球前、后分别收集粗制类囊体等分试样。继续进行步骤2.1。或者，将粗制质体小球在−80 °C保存，以备后续纯化。
  2. 从干燥样品中粗提质体小球 E. nindensis 叶片组织
    1. 获取一个花盆（每盆包含三株完全干燥的8至9周龄植株） E. nindensis （近40克组织）。
    2. 用剪刀从植株基部紧贴土壤上方剪除所有叶片组织，并立即将组织浸入冰浴中。将组织转移至冷室。
    3. 在绿色安全灯下操作，剪断 E. nindensis 用剪刀将叶片剪成较小的碎片（约5 cm × 5 cm）。
    4. 用100 mL研磨缓冲液轻轻但充分地研磨叶片表1在商用搅拌器中进行。多次启停搅拌器，以确保所有叶片都被切碎。搅拌器速度不得超过7档。
    5. 将匀浆液通过置于大漏斗上的一层25 µm尼龙布过滤至250 mL锥形瓶中。在离心前取出一份叶片滤液 aliquot，留作代表性的全叶样品保存。
    6. 加入适量蔗糖，使其终浓度为0.5 M，将溶液分装至250 mL离心管中。
      注意：与……相比，蔗糖浓度更高 Z. mays 该步骤用于确保在后续超声处理释放类囊体结合的质体小球之前，细胞质中的脂滴能够充分上浮。
    7. 将试管在 45,000 x g 在4 °C下孵育30分钟。质体小球与细胞质脂滴的混合物将清晰可见，表现为蔗糖垫表面或靠近表面处的黄色油状层。图1B用带有22 G针头的注射器，将针头开口贴近梯度液表面，吸取漂浮物质，并转移至离心管中。
    8. 收集游离的质体小球/脂滴混合物后，弃去剩余上清液。
    9. 将沉淀物用12 mL R 0.2培养基通过轻轻晃动并用刷子轻柔搅动重新悬浮，以分离与残留类囊体相连的质体小球。将悬浮液合并至一个瓶子中。继续进行步骤1.1.8。
  3. 从蓝细菌中粗提取质体小球
    1. 培养50 mL菌液 集胞藻属 sp. PCC 6803 培养至稳定期（约7-10天），并调节细胞密度至OD750 使用分光光度计测定其光密度至2.0。培养条件采用BG-11培养基，在光照强度为150 µmol photons/m²·s的培养箱中进行培养。2/s，2% CO232 °C，150 rpm 持续振荡培养。
    2. 为了去除多糖，通过在6,000 x g下离心50 mL培养液来洗涤细胞 g 4 °C下孵育45分钟，随后去除上清液。接着用50 mL缓冲液A将细胞洗涤两次。表1)。在离心前取出一份细胞匀浆 aliquot 并留置，作为代表性的全细胞样品保存
    3. 将洗涤后的沉淀重悬于25 mL缓冲液A中，使用法国压榨细胞破碎仪在1,100 psi条件下破碎细胞，重复3次（每次循环之间将样品置于冰上，以避免蛋白质变性），直至在白光下观察裂解液颜色由绿色变为红-蓝-绿色。使用预冷的破碎装置，并在低温室中进行此步骤。
    4. 将所得匀浆液分装至八个超速离心管中，每管体积不超过2.5 mL，共八管，每管加入400 µL的R培养基，小心覆盖形成阶梯梯度。
      注意：有关蔗糖梯度制备的详细描述，请参见 Yang 等人和 Kelekar 等人的文献25,26.
    5. 根据需要加入适量的R培养基以精确平衡离心管，随后在150,000 × g条件下离心30分钟 g 在4 °C下离心后，类囊体及其他较重的细胞器（包括任何聚羟基烷酸酯颗粒）将形成沉淀，而质体小球则会明显呈现为蔗糖梯度顶部或靠近顶部的一层黄色油状层。图1C).
    6. 用注射器和22G针头收集最终形成的漂浮状粗制质体小球，并转移至2 mL离心管中。如有必要，可用针尖将质体小球从超速离心管管壁上刮下。
    7. 继续进行步骤2.2。或者，将粗制质体小球在-80 °C保存，后续再进行纯化。

2. 纯化质体小球

  1. 植物组织处理
    1. 在2.5 mL超速离心管中制备蔗糖梯度：首先加入500 µL来自步骤1.1或步骤1.2的粗制质体小球，并与500 µL中等浓度R 0.7混合，使总体积达到1 mL；然后覆盖400 µL中等浓度R 0.2，再覆盖400 µL中等浓度R。
      注：有关蔗糖梯度制备的详细描述，请参见Yang等和Kelekar 等的研究25,26。
    2. 如有必要，通过向顶层添加过量的中等浓度R来精确平衡各离心管。然后在4 °C条件下以150,000 × g离心1.5小时。
    3. 用注射器和22G针头收集浮于上层的纯净质体小球层（图1A），转移至2 mL离心管中。如有需要，可用针尖将附着在离心管壁顶部的质体小球刮下。
    4. 将纯化的质体小球分装后，立即在液氮中速冻。可直接于-80 °C保存，或冻干成干粉储存。
  2. 蓝细菌处理
    1. 在四个2.5 mL超速离心管中制备蔗糖梯度：每管先加入500 µL来自步骤1.3的粗制质体小球，并与750 µL中等浓度R 0.7混合，然后覆盖750 µL中等浓度R 0.2。
      注：有关蔗糖梯度制备的详细描述，请参见Yang等和Kelekar 等的研究25,26。
    2. 在4 °C条件下以150,000 × g离心蔗糖梯度90分钟。用注射器和22 G针头从蔗糖梯度的上相收集纯净的质体小球（图1C），转移至1.5 mL离心管中。
    3. 将纯化的质体小球分装后，立即在液氮中速冻。可直接于−80 °C保存，或冻干成干粉储存。

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结果

完成方案第1步后，应能明显观察到大量质体小球/脂滴物质漂浮在蔗糖垫的顶层（或靠近顶层）(图1B-C)。在此阶段也可收集其他组分。例如，类囊体将形成沉淀，可用中等浓度R 0.2缓冲液重新悬浮，用于后续分析。经过后续离心后，纯化的质体小球将位于或靠近蔗糖梯度的表面，如图1A、C所示。在某些情况下（例如特定基因型品系或环境条件），质体小球会分离为两个不同的亚群，分布在梯度中的不同层：一层为位于梯度表面的低密度组分，另一层为密度较高的组分，沉降于最上两层梯度之间的界面处。尽管此前尚未对分离的各组分进行细致的比较分析，但这些亚群很可能代表不同大小的质体小球，其中直径较小（因而具有更高的表面积与体积比以及蛋白质与脂质比）的质体小球在梯度中沉降位置更低。

在不成功的尝试中，经过第一轮离心后，蔗糖垫表面可见的质体小球可能极少或完全不可见。未能成功分离出足够量的质体小球可能取决于多...

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讨论

为了尽量减少材料的生理/生化变化，并保护质体小球中富含的某些对光和热不稳定的预nyl-脂质色素，整个分离过程必须在4 °C条件下避光进行。如上所述，初始步骤需在冷室中使用发出绿光的安全灯下完成。后续在实验室中进行的步骤应在弱光条件下操作，并使用冰浴或冷藏离心。出于类似原因，在操作过程中加入新鲜的蛋白酶抑制剂（如果需要研究蛋白质的磷酸化调控，还需加入磷酸酶抑制剂）至关重要（表2 和 表3）。

尽管其他方法（例如，Dounce匀浆器、冻融循环）原则上也可用于从高等植物叶绿体的类囊体中释放质体小球，但超声处理被发现能提供最佳的得率和纯度，明显优于其他方法（未发表结果）。超声处理可能从类囊体片层或内质网产生人工囊泡；然而，这些囊泡蛋白质含量会非常高，因而密度较大，无法在蔗糖梯度中上浮。

在从蔗糖梯度中提取纯质体小球的上浮层时，应尽可能使用最少体积的中等R培养基进行提取。通过这种方式获得高浓度的质体小球，有助于减少后续实验所需的样品体积。使用注射器和22号针头是提取质体...

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披露

无任何利益冲突需要声明。

致谢

Lundquist 实验室的研究工作获得了美国国家科学基金会（NSF，项目号 MCB-2034631）和美国农业部（USDA，项目号 MICL08607）向 P.K.L. 提供的资助。作者感谢密歇根州立大学（MSU）的 Carrie Hiser 博士在蓝细菌质体小球分离方法开发过程中提供的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
AEBSF默克密理博P7626
Antipain·2HClBachemH-1765.0050BA
抑肽酶默克密理博A6106
抗坏血酸BDHBDH9242
BestatinSigma AldrichB8385
β-甘油磷酸二钠盐·5H₂O2OEMD Millipore35675
牛血清白蛋白普罗利安生物68700
抑肽酶Sigma AldrichC7268
Eragrostis nindensisN/AN/A
E-64默克密理博E3132
French 压力细胞（型号 FA-079）SLM/AmincoN/A
HEPESSigma AldrichH3375
亮抑蛋白酶肽Sigma AldrichL2884
氯化镁Sigma AldrichM8266
Multitron 摇床培养箱Infors HTN/A
Phospho-ramidon.2 NaSigma AldrichR7385
氢氧化钾Fisher ChemicalsM16050
还原型半胱氨酸MP Biochemicals101444
氟化钠Sigma AldrichS7920
原钒酸钠Sigma Aldrich450243
焦磷酸钠 · 10H2OSigma Aldrich3850
山梨醇Sigma AldrichS3889
蔗糖Sigma AldrichS9378
Sylvania 15 W 荧光 Gro-Lux 管状灯泡，18"沃尔玛N/A
集胞藻属stis sp. PCC 6803N/AN/A
Optima MAX-TL 超速离心机贝克曼库尔特A95761
Waring 均质器（1.2 L）VWR58977-227商用搅拌机
玉米（Zea mays）N/AN/A

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