从植物叶片组织和蓝细菌中分离质体小球脂滴

摘要

本文介绍了一种快速高效分离多种光合生物相关质体小球脂滴的实验方案。成功制备分离的质体小球是开展蛋白质组学和脂质组学等深入分子研究之前至关重要的第一步。

摘要

质体小球脂滴是植物叶绿体和蓝细菌的一个动态亚区室。在光合生物中广泛存在，被认为在快速变化的环境条件下对类囊体膜的适应与重塑起核心作用。高纯度质体小球的分离能力极大地促进了通过蛋白质组学、脂质组学及其他方法对其开展研究。获得高纯度和高得率的质体小球后，即可对其脂质和蛋白质组成、酶活性以及蛋白质拓扑结构等分子特性进行分析。本文介绍了一种从植物叶片组织叶绿体中快速有效分离质体小球的实验方案，并提供了从玉米叶片、复苏植物Eragrostis nindensis的干燥叶组织以及蓝细菌Synechocystis sp. PCC 6803中分离质体小球及相关脂滴结构的方法学变体。该分离方法依赖于这些富含脂质颗粒的低密度特性，从而通过蔗糖密度浮选实现纯化。该方法将对来自多种物种的质体小球研究具有重要价值。

引言

目前对质体小球组成和功能的理解主要基于详细的蛋白质组学和脂质组学研究^1,2,3,4,5。这些研究得益于一种快速且高效的方法，该方法利用质体小球极低的密度，通过蔗糖梯度实现有效分离。早期的质体小球分离方法曾在多种物种中成功应用，包括山毛榉（Fagus sylvatica）、苏格兰金雀花（Sarothamnus scoparius）、洋葱（Allium cepa）、菠菜（Spinacia oleracea）、三色堇（Viola tricolor）、辣椒（Capsicum annuum）和豌豆（Pisum sativum）^6,7,8,9,10,

方案

1. 原始质体小球的分离

1. 从未受胁迫的玉米叶片组织中粗提取质体小球
   1. 选取六株健康玉米幼苗，约3周大，接近V5生长阶段，每株鲜重约120 g。
   2. 剪去茎基部的所有叶片，迅速浸入冰浴中，并转移至冷室。
   3. 在绿色安全灯下操作，将玉米叶片从冰浴中取出，用剪刀剪成较小的片段（约 5 cm × 5 cm）。
   4. 轻轻但彻底地将一半剪碎的叶片组织在350 mL研磨缓冲液中用商用搅拌器研磨表1). 启动并停止搅拌机5至6次，以确保所有叶片被切碎。搅拌机速度不得超过7档。
   5. 将匀浆液通过置于大漏斗上的一层25 µm尼龙布过滤，收集至四个250 mL离心管中。随后，用剪碎的另一半叶片组织重复步骤1.1.4。
   6. 将滤液均匀分装至四个瓶子中，于1,840 x g下离心6分钟 g 在 4 °C 下。在离心前取出一份叶滤液 aliquot，留作代表性的全叶样品保存。
   7. 倒掉上清液，将沉淀物轻轻重悬于 12 mL 含有 0.2 M 蔗糖的 R 0.2 培养基中（表1通过轻轻晃动并用刷子轻柔地搅动重悬沉淀。每次重悬后，将悬液转移至下一个瓶子中，并重复重悬步骤。最后将所有悬液汇集到一个瓶子中。
   8. 将混合后的悬液分装至六个3 mL超速离心管中，每管最大体积为2.5 ....

结果

完成方案第1步后，应能明显观察到大量质体小球/脂滴物质漂浮在蔗糖垫的顶层（或靠近顶层）(图1B-C)。在此阶段也可收集其他组分。例如，类囊体将形成沉淀，可用中等浓度R 0.2缓冲液重新悬浮，用于后续分析。经过后续离心后，纯化的质体小球将位于或靠近蔗糖梯度的表面，如图1A、C所示。在某些情况下（例如特定基因型品系或环境条件），质体小球会分离为两个不同的亚群，分布在梯度中的不同层：一层为位于梯度表面的低密度组分，另一层为密度较高的组分，沉降于最上两层梯度之间的界面处。尽管此前尚未对分离的各组分进行细致的比较分析，但这些亚群很可能代表不同大小的质体小球，其中直径较小（因而具有更高的表面积与体积比以及蛋白质与脂质比）的质体小球在梯度中沉降位置更低。

在不成功的尝试中，经过第一轮离心后，蔗糖垫表面可见的质体小球可能极少或完全不可见。未能成功分离出足够量的质体小球可能取决于多.......

讨论

为了尽量减少材料的生理/生化变化，并保护质体小球中富含的某些对光和热不稳定的预nyl-脂质色素，整个分离过程必须在4 °C条件下避光进行。如上所述，初始步骤需在冷室中使用发出绿光的安全灯下完成。后续在实验室中进行的步骤应在弱光条件下操作，并使用冰浴或冷藏离心。出于类似原因，在操作过程中加入新鲜的蛋白酶抑制剂（如果需要研究蛋白质的磷酸化调控，还需加入磷酸酶抑制剂）至关重要（表2 和 表3）。

尽管其他方法（例如，Dounce匀浆器、冻融循环）原则上也可用于从高等植物叶绿体的类囊体中释放质体小球，但超声处理被发现能提供最佳的得率和纯度，明显优于其他方法（未发表结果）。超声处理可能从类囊体片层或内质网产生人工囊泡；然而，这些囊泡蛋白质含量会非常高，因而密度较大，无法在蔗糖梯度中上浮。

在从蔗糖梯度中提取纯质体小球的上浮层时，应尽可能使用最少体积的中等R培养基进行提取。通过这种方式获得高浓度的质体小球，有助于减少后续实验所需的样品体积。使用注射器和22号针头是提取质体.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
AEBSF	默克密理博	P7626
Antipain·2HCl	Bachem	H-1765.0050BA
抑肽酶	默克密理博	A6106
抗坏血酸	BDH	BDH9242
Bestatin	Sigma Aldrich	B8385
β-甘油磷酸二钠盐·5H₂O2O	EMD Millipore	35675
牛血清白蛋白	普罗利安生物	68700
抑肽酶	Sigma Aldrich	C7268
Eragrostis nindensis	N/A	N/A
E-64	默克密理博	E3132
French 压力细胞（型号 FA-079）	SLM/Aminco	N/A
HEPES	Sigma Aldrich	H3375
亮抑蛋白酶肽	Sigma Aldrich	L2884
氯化镁	Sigma Aldrich	M8266
Multitron 摇床培养箱	Infors HT	N/A
Phospho-ramidon.2 Na	Sigma Aldrich	R7385
氢氧化钾	Fisher Chemicals	M16050
还原型半胱氨酸	MP Biochemicals	101444
氟化钠	Sigma Aldrich	S7920
原钒酸钠	Sigma Aldrich	450243
焦磷酸钠 · 10H2O	Sigma Aldrich	3850
山梨醇	Sigma Aldrich	S3889
蔗糖	Sigma Aldrich	S9378
Sylvania 15 W 荧光 Gro-Lux 管状灯泡，18"	沃尔玛	N/A
集胞藻属stis sp. PCC 6803	N/A	N/A
Optima MAX-TL 超速离心机	贝克曼库尔特	A95761
Waring 均质器（1.2 L）	VWR	58977-227	商用搅拌机
玉米（Zea mays）	N/A	N/A