从植物叶片组织和蓝藻中分离出塑体球脂滴

Summary

提出了一种快速有效的方案，用于分离与各种光合生物相关的质球脂滴。成功制备分离的质体球是蛋白质组学和脂质组学分析等详细分子研究之前的关键第一步。

Abstract

塑性球脂滴是植物叶绿体和蓝藻的动态亚区室。它们在光合作用物种中无处不在，被认为在快速变化的环境条件下在类囊体膜的适应和重塑中起着核心作用。分离高纯度质体球的能力极大地促进了通过蛋白质组、脂质组和其他方法进行的研究。使用高纯度和高产量的质体球，可以研究它们的脂质和蛋白质组成、酶活性和蛋白质拓扑以及其他可能的分子特征。本文提出了一种从植物叶片组织叶绿体中分离质体球的快速有效的方案，并介绍了从玉米叶、复活植物的干燥叶组织 Eragrostis nindensis 和蓝藻集 胞藻 中分离质球和相关脂滴结构的方法学变化 PCC 6803。分离依赖于这些富含脂质的颗粒的低密度，这有助于通过蔗糖密度浮选纯化它们。这种方法将在研究来自不同物种的质体球方面证明是有价值的。

Introduction

目前对质体球组成和功能的理解是通过详细的蛋白质组学和脂质组学研究出现的¹，²，³，^4，5。这种研究得到了快速有效的分离方法的极大帮助，该方法依赖于其非常低的密度，使用蔗糖梯度进行有效分离。从山毛榉树（Fagus sylvatica），苏格兰扫帚（Sarothamnus scoparius），洋葱（葱属cepa），菠菜（Spinacia oleracea），三色堇（中提琴三色），胡椒（辣椒）和豌豆（Pisum sativum）等物种中实现了质体球分离的初始方法⁶，⁷，⁸，⁹，^10，11，^12，13.Ytterberg等人后来提出了一种以更有效和更好的产量方式分离叶绿体质体球的更新方法3^，14。虽然最初用于研究拟南芥叶叶绿体的质球，但我们已经成功地将这种更新的方法用于其他植物物种的健康叶组织，包括单子叶植物和双子叶植物，包括玉米（Zea mays）、番茄（Solanum lycopersicum）、爱情草（Eragrostis nindensis）、紫色假凤梨（Brachypodium distachyon）和野生烟草（Nicotiana benthamiana;未发表的结果）。此外，分离方法已成功适应蓝藻的质体球，包括集胞藻属PCC 6803和Anabaena sp. PCC 7120¹⁵，以及复活植物E. nindensis的干燥叶组织。

健康叶组织的叶绿体质体球与类囊体膜物理连接¹⁶。尽管有这种物理连续性，两个叶绿体亚区室保持不同的脂质和蛋白质组成，尽管^{已经提出了两个}区室之间脂质和蛋白质的调节交换2，^4，17，^18，19。事实上，最近提出了一个有趣的半融合模型，用于叶绿体和细胞质¹⁹之间中性脂质的运输。由于质体球和类囊体的物理连续性，健康叶组织的分离方法从收集颗粒粗类囊体制剂开始，随后对其进行超声处理以将质体球与类囊体分离，这与用于分离胞质脂滴的方法相反²⁰.然后在蔗糖垫上进行超速离心，然后将低密度质体球向上漂浮通过蔗糖，有效地将它们与类囊体、细胞核和其他高密度材料分离。相比之下，蓝藻中的质体球以及干燥的叶组织中的质体球显然以自由漂浮的形式存在于体内。因此，它们的分离涉及直接漂浮在蔗糖梯度上。本文演示了从健康叶片组织中分离的方法，并进一步展示了可用于从干燥的叶组织或蓝藻培养物中分离质体球的两种变体，极大地扩展了可以研究塑料球的生理广度和进化背景。

分离的质体球随后可用于任意数量的下游分析，以研究分子特征。我们使用从拟南芥叶组织中分离出的质体球在不同环境条件或基因型下进行广泛的蛋白质组学和脂质组学分析，证明了蛋白质和脂质组成的选择性修饰以适应压力²，⁴，^21，22。此外，已经进行了体外激酶测定，该测定已证明与分离的质体球相关的反式磷酸化活性²²，已使用天然凝胶电泳²¹研究了蛋白质组分的寡聚状态，并且已经进行了蛋白酶剃须测定²³。

这种方法的主要优点是程序的相对速度。根据我们的经验，下面概述的协议可以在大约4小时内完全完成。已经描述了从叶组织中分离质体球的替代方法，该方法允许同时分离其他叶绿体亚区室²⁴。当需要或需要与其他叶绿体亚区室进行定量比较时，这种替代方法提供了一些明显的优势。然而，这种替代方法也更加繁琐，并且将从相当数量的叶组织中提供显着降低的分离质体球的产量。当以质体球为重点研究时，此处概述的方法论是最佳选择。尽管如此，在样品制备过程中可以收集总叶和粗类囊体等分试样，强烈建议这样做，以便有参考样品进行后续比较。

Protocol

1.粗质体球分离

1. 从非胁迫玉米叶片组织中提取粗质体球
   1. 获得6株约3周龄且接近V5生长期的健康玉米幼苗，重约120克。
   2. 剪掉茎基部的所有叶子，迅速将它们浸泡在冰浴中，然后运送到冷藏室。
   3. 在绿色安全灯下工作，从冰浴中取出玉米叶，然后用剪刀将它们剪成小块（约 5 厘米 x 5 厘米）。
   4. 在商用搅拌机中，在350 mL研磨缓冲液中轻轻但彻底研磨一半的剪裁叶组织（表1）。启动-停止搅拌机5x-6x，以确保所有叶子都被切割。请勿在搅拌机上使用高于 7 级的浓度。
   5. 通过大漏斗上的一层 25 μm 尼龙布将匀浆过滤到四个 250 mL 离心瓶中。然后，对剪裁的叶组织的后半部分重复步骤1.1.4。
   6. 将滤液均匀地分配到四个瓶子之间，并在4°C下以1，840× g 离心6分钟。 取出等分试样的叶滤液，并在离心前将其放在一边，以作为代表性的总叶样品储存。
   7. 倒出所得上清液，轻轻重悬于含有0.2M蔗糖的12mL培养基R 0.2中（表1），方法是旋转并用刷子轻轻移动重悬。重悬每个颗粒后，将悬浮液带到下一个瓶子上并重复重悬液。将悬浮液汇集到一个瓶子中。
   8. 将混合悬浮液分布在六个 3 mL 超速离心管之间，每个管中的最大体积达到 2.5 mL。
   9. 使用100%振幅的尖端超声仪对每个管进行4次超声处理，每次10秒。小心保持超声器喇叭浸没并远离液体表面，以防止起泡。
   10. 在每轮中，在悬架内缓慢上下移动超声器喇叭。在四个试管之间交替，在每次超声处理后将每个试管放回冰桶中，以使样品冷却。
   11. 在4°C下以150，000× g 离心超声粗类囊体悬浮液30分钟。 使用注射器和 22 G 针头从蔗糖垫（容易看到为黄色油性垫）表面收获产生的粗质体球漂浮垫，方法是用针头开口掠过垫子的表面，从每个管中回收约 500 μL。放入 2.0 mL 管中。
   12. 在质体球超声处理和释放之前和之后收集粗类囊体的等分试样。继续执行步骤 2.1。或者，将粗质体球储存在-80°C并在以后纯化。
2. 从干燥的 茼蒿 叶组织中提取粗质体球
   1. 获得一盆（每盆三株单独的植物）完全干燥的8-9周龄 的E. nindensis （近40克组织）。
   2. 用剪刀从植物的底部剪掉土壤上方的所有叶组织，并立即将组织浸入冰浴中。将纸巾运送到冷藏室。
   3. 在绿色安全灯下工作，剪掉 E。 宁登斯用 剪刀将叶子切成小块（约 5 厘米 x 5 厘米）。
   4. 在商用搅拌机中用 100 mL 研磨缓冲液（表 1）轻轻但彻底地研磨叶子。多次启动-停止搅拌机，以确保切割所有叶子。请勿在搅拌机上使用高于 7 级的浓度。
   5. 通过大漏斗上的一层 25 μm 尼龙布将匀浆过滤到 250 mL 锥形烧瓶中。取出等分试样的叶滤液，并在离心前将其放在一边，以作为代表性的总叶样品储存。
   6. 加入适量的蔗糖，使其终浓度为0.5 M，并将溶液分配到250 mL离心管中。
      注意:与 Z. mays 制剂相比，蔗糖浓度更高，以确保在随后超声处理/释放类囊体结合的质体球之前浮选胞质脂液滴。
   7. 将试管在4°C下以45，000× g 离心30分钟。 质体球和胞质脂滴的混合物很容易在蔗糖垫表面或附近看到黄色的油性垫（图1B）。使用带有22G针头的注射器收集漂浮材料，方法是用针头的开口掠过垫子的表面，然后沉积到管中。
   8. 收集自由漂浮的塑料球/脂滴混合物后丢弃剩余的上清液。
   9. 为了分离与残留类囊体相连的质体球，通过旋转并通过刷子的轻柔运动重悬将沉淀重悬在 12 mL 培养基 R 0.2 中。将悬浮液汇集到一个瓶子中。继续执行步骤 1.1.8。
3. 从蓝藻中提取粗质体球
   1. 将 50 mL 集胞藻属 PCC 6803 培养物培养至固定期（约 7-10 天），并使用分光光度计将细胞密度调节至 OD₇₅₀ 的 2.0。对于培养条件，使用BG-11培养基并在培养箱中以150μmol光子/ m 2 / s，2%CO²，32°C的光强度生长，并以150rpm连续振荡。
   2. 为了去除多糖，通过在4°C下以6，000× g 离心50mL培养物45分钟并随后除去上清液来洗涤细胞。继续在50 mL缓冲液A中洗涤细胞两次（表1）。取出等分试样的细胞匀浆，并在离心前将其放在一边，以作为代表性的总细胞样品储存
   3. 将洗涤后的沉淀重悬于25 mL缓冲液A中，并使用法国压力池在1，100 psi下破碎细胞，重复该过程3次（在每个循环之间将样品放在冰上以避免蛋白质变性），直到裂解的颜色在白光下从绿色变为红蓝绿色。使用预冷的电池并在冷藏室中执行此步骤。
   4. 将所得匀浆分布在 8 个 3 mL 超速离心管中，每个管中填充至最大 2.5 mL，然后小心地用 400 μL 培养基 R 覆盖，产生阶跃梯度。
      注:有关蔗糖梯度制备的详细描述，请参阅Yang等人和Kelekar等人^25，26。
   5. 根据需要通过添加额外的培养基R来小心平衡管，并在4°C下以150，000× g 离心30分钟。 类囊体和其他较重的细胞器（包括任何聚羟基链烷酸酯小体）将沉淀，而质体球将很容易被视为蔗糖梯度顶部或附近的黄色油性垫（图1C）。
   6. 用注射器和 22G 针头收获所得的粗质体球漂浮垫，并沉积到 2 mL 管中。如有必要，用针尖从超速离心管壁的侧面刮下质体球。
   7. 继续执行步骤 2.2。或者，将粗质体球储存在-80°C并稍后纯化。

2. 收获纯质体球

1. 植物组织处理
   1. 在 2.5 mL 超速离心管中产生蔗糖梯度，首先将步骤 1.1 或步骤 1.2 中的 500 μL 粗质体球与 500 μL 培养基 R 0.7 混合，使其总体积为 1 mL，然后覆盖 400 μL 培养基 R 0.2，然后覆盖 400 μL 培养基 R。
      注:有关蔗糖梯度制备的详细描述，请参阅Yang等人和Kelekar等人^25，26。
   2. 根据需要，通过在顶层添加多余的介质R来小心平衡管子。然后在4°C下以150，000× g 离心1.5小时。
   3. 用注射器和22G针头收获所得的纯塑料球浮动垫（图1A），并沉积到2 mL管中。如有必要，用针尖从离心管壁顶部刮下质体球。
   4. 将纯质体球分装并在液氮中快速冷冻。直接储存在-80°C或冻干成干粉。
2. 蓝藻加工
   1. 在四个 2.5 mL 超速离心管中产生蔗糖梯度，首先与步骤 1.3 中的 500 μL 粗塑料球与 750 μL 培养基 R 0.7 混合，然后用 750 μL 培养基 R 0.2 叠加。
      注:有关蔗糖梯度制备的详细描述，请参阅Yang等人和Kelekar等人^25，26。
   2. 在4°C下以150，000× g 离心蔗糖梯度90分钟。 用注射器和22G针头从蔗糖梯度的顶部阶段收集纯质体球（图1C），并转移到1.5mL管中。
   3. 将纯质体球分装并在液氮中快速冷冻。直接储存在-80°C或冻干成干粉。

Results

完成协议的步骤1后，应该能够容易地看到相当数量的质体球/脂滴材料漂浮在蔗糖垫的顶层（或附近）（图1B-C）。在这个阶段也可以收集其他馏分。例如，类囊体将被沉淀，并可以用培养基R 0.2重新悬浮以进行后续分析。随后离心后，将在蔗糖梯度表面或附近获得纯化的质体球，如图1A，C所示。已经看到在某些情况下（例如，特定的基因型系或环境条件），质体球将分离为两个不同的亚群，在梯度的不同层上分离:梯度表面上的低密度部分和第二个更密集的部分，它沉淀在顶部两个梯度层之间的界面。虽然以前没有对分离部分进行过仔细的比较分析，但这些亚群似乎代表了不同大小的质体球，其中直径较小（因此表面积体积比和蛋白质脂质比较大）的质体球将在梯度中较低。

在不成功的尝试中，在第一轮离心后，人们会在蔗糖垫的表面上看到很少或没有可见的塑料球。未能成功分离出足够的质体球可能取决于可能需要优化的几个因素。特别是，...

Discussion

为了最大限度地减少材料的生理/生化变化并保护某些光不稳定和热不稳定的异戊烯基脂质色素，这些色素是塑料球的丰富成分，在4°C下进行隔离并避光至关重要。如上所述，初始步骤是在冷室的安全灯下使用绿色发光灯泡进行的。在实验室中进行的后续步骤是在昏暗的灯光下，并使用冰或冷藏离心。出于类似的原因，加入新鲜蛋白酶抑制剂（如果有兴趣研究蛋白质的磷酸化调节，则包括磷酸酶抑制剂）至关重要（表2 和 表3）。

虽然原则上可以使用其他方法（例如，Dounce均质机，冻融循环）从高等植物叶绿体中的类囊体中释放质体球，但已发现超声处理在提供最佳产量和纯度方面要优越得多（未发表的结果）。超声处理可能从类囊体薄片或内质网产生人工囊泡;然而，这些囊泡将非常富含蛋白质，因此致密，排除了它们在蔗糖梯度上的浮选。

当从蔗糖梯度中提取纯质体球的浮动垫时，将它们以尽可能少量的培养基R提取是有益的。以这种方式获取浓缩的质体球有助于通过最小化必要的样品体积来促进下游研究。使用注射器和22G针头是提取塑料球的...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
AEBSF	Milipore Sigma	P7626
抗痛药.2HCl	Bachem	H-1765.0050BA
抑肽酶	Milipore Sigma	A6106
抗坏血酸	BDH	BDH9242
Bestatin	Sigma Aldrich	B8385
β-甘油磷酸酯。2Na5H2O	EMD 米利波尔	35675
牛血清白蛋白	Proliant 生物	68700
凝乳抑素	Sigma Aldrich	C7268
Eragrostis nindensis	N/A	N/A
E-64	Milipore Sigma	E3132
法国压力池（型号 FA-079）	SLM/Aminco	N/A
HEPES	Sigma Aldrich	H3375
亮肽素	Sigma Aldrich	L2884
氯化镁	Sigma Aldrich	M8266
多子振荡培养箱	Infors HT	N/A
Phospho-ramidon.2 Na	Sigma Aldrich	R7385
氢氧化钾	Fisher Chemicals	M16050
还原半胱氨酸	MP 生化试剂	101444
氟化钠	Sigma Aldrich	S7920
邻钒酸钠	Sigma Aldrich	450243
焦磷酸钠和中点; 10H2O	Sigma Aldrich	3850
山梨糖醇	Sigma Aldrich	S3889
蔗糖	Sigma Aldrich	S9378
Sylvania 15 W 荧光灯 Gro-Lux 管状灯泡，18 英寸	沃尔玛	N/A
Synechocy/em>< sp. PCC 6803	N/A	N/A
Optima MAX-TL 超速离心机	贝克曼库尔特	A95761
Waring 搅拌机 （1.2 升）	VWR	58977-227	商用搅拌机
玉米	N/A	N/A