本方案介绍了一种可靠的幼苗嫁接方法，无需任何前期经验或培训，且可在大多数分子生物学实验室中利用易获取的材料以极低的成本实施。
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本文内容
摘要
摘要
幼苗期嫁接已成为分子遗传学中研究植物根-茎关系的一种常用工具。由于模式植物拟南芥（Arabidopsis thaliana）幼苗体积微小且脆弱，对其进行早期幼苗嫁接在技术上具有挑战性且耗时较长。目前已发表的多种方法对此技术进行了描述，但其成功率、操作难度和相关成本各不相同。本文介绍了一种使用硅胶弹性体混合物自制可重复使用嫁接装置的简便方法，以及如何利用该装置进行幼苗嫁接。在本文发表时，每个可重复使用的嫁接装置仅需0.47美元的耗材成本即可制作完成。采用该方法，初学者可在不到3周的时间内完成首次成功的幼苗嫁接。这一高度便捷的流程将使植物分子遗传学实验室能够将幼苗嫁接常规纳入其实验操作体系。由于使用者可完全自主控制这些嫁接装置的制作与设计，如有需要，该技术也可轻松调整用于番茄或烟草等较大植物的嫁接。
引言
嫁接是一种古老的园艺技术，早在公元前500年就已成为一项成熟的农业实践1。该技术最初用于嫁接不同品种的农作物以提高产量，至今仍广泛应用于这一目的。在过去十年中，嫁接作为一种研究植物长距离信号传递的工具，受到了分子生物学家越来越多的关注2,3,4,5。尽管成年植株的嫁接相对容易，但在种子萌发后不久对幼苗进行嫁接则具有较大挑战性。然而，在研究植物发育、环境响应以及开花等过程中的长距离信号作用时，这种幼苗嫁接有时是必不可少的6,7,8。
Arabidopsis thaliana 因其体型相对较小、易于在实验室中培养等诸多原因，已成为植物生物学研究中的模式生物。然而，Arabidopsis 幼苗体型微小且脆弱，使得幼苗嫁接操作极具挑战性。在许多情况下，需经过大量实际操作训练才能成功完成幼苗嫁接。多年来，研究者已对方法学进行了诸多改进，明确了理想的生长条件，并开发出....
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方案
1. 设备准备
- 通过将硅胶弹性体溶液倒入方形培养皿（100 mm × 100 mm）中来制备硅胶嫁接装置。按照制造商的说明，准备15 mL弹性体溶液。
注意：硅胶弹性体试剂盒通常包含一种基于硅胶的液体和一种固化剂，混合后可使硅胶固化。 - 在方形培养皿中放置四段等间距的29 G金属丝，以准备培养皿（图1A）。确保金属丝与模具底部完全贴合。为充分拉直金属丝，可在坚硬均匀的表面上用重而平坦的物体（例如金属试管架）滚动金属丝。
注意： 捆扎线通常含有29 G金属丝，可用丙酮去除外部纸质涂层后使用。 - 将混合好的硅胶弹性体溶液倒在金属丝上方，并用培养皿盖覆盖。在室温下静置固化24–48小时。
- 使用洁净镊子将硅胶片从培养皿中取出，并转移至洁净的平坦表面。
- 从硅胶片中取出金属丝。用尖头镊子去除通道外侧残留的薄层硅胶，使通道一侧保持开放（图1A）。
- 使用洁净剪刀将硅胶片垂直于通道方向切成3 mm宽的条状。将每条硅胶条转移至铝箔袋中，并用高压灭菌胶带密封。
- 在121 °C下对硅胶条进行高压灭菌至少30分钟，保存备用。
2. 幼苗准备
- ....
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结果
通过测试嫁接条设计的多个方面，以确定所需技术熟练度最低的最优嫁接条件（表1）。所有嫁接实验均在含0.5%蔗糖的MS培养基上完成，该培养基此前已被报道为理想的嫁接培养基11,12。
在嫁接条带上直接发芽无法实现幼苗的最佳生长
在初代硅胶条设计中，通过在导线从硅胶片上移除后，保留条带通道背面的一层薄硅胶来形成封闭的通道。与直接在培养板上发芽、再将嫁接条覆盖于幼苗下胚轴上的方法不同，该方法是在将种子置入填充少量MS培养基的通道后，直接在条带上进行发芽。采用此技术时，约一半的幼苗在发芽过程中卡在通道内，无法正常伸长。包括未发芽和未伸长的幼苗在内，嫁接成功率仅为25%（n = 16）（表1）。为解决幼苗伸长失败的问题，调整了种子方向，使胚的子叶和胚根朝下进行发芽。采用该方法后，75%的种子成功发芽并伸长，嫁接效率略有提高（成功率为33%，n = 12）（
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讨论
总结与意义
嫁接界面的形成对于成功嫁接至关重要，这需要砧木与接穗之间直接且不受干扰的接触。拟南芥等小型植物的幼苗体型微小且脆弱，技术上难以满足这一要求。早期的拟南芥幼苗嫁接方法中开发了一种技术，即将接穗和砧木同时插入一段短的硅胶管套中，以支撑嫁接部位10。尽管该方法在防止两个嫁接部分分离方面非常有效，但将脆弱的接穗和砧木插入内径狭窄的管中并非易事。此外，随着植株生长，嫁接部位逐渐增粗，常常导致难以在不损伤嫁接幼苗的情况下移除窄径硅胶管。其他方法则采用替代技术以避免使用嫁接套管，同时防止幼苗在生长过程中移动，例如切除接穗的两片子叶，并将嫁接后的幼苗培养在倾斜的表面上9,11。虽然这些方法所需资源较少，但在实际试验中，这些方法导致接穗从砧木上显著移位，嫁接成功率低于报道值（两项研究中推荐条件下的平均成功率约为80%）。此外，这些方法均要求操作者在没有任何辅助装置的情况下精确对齐嫁接部位的接触界面，.......
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
感谢 Javier Brumos 在嫁接技术方面的初步培训与指导 拟南芥 幼苗
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 15 mL 离心管 | VWR International Inc | 10026-076 | |
| 乙腈（HPLC级） & ACS 认证溶剂）4 L | VWR | BJAH010-4 | |
| BactoAgar | Sigma | A1296-500g | |
| 道康宁 SYLGARD 184 透明硅胶封装剂 0.5 kg 套件 | 道 | 2646340 | |
| D-蔗糖（分子生物学级），1 kg | Fisher Scientific | BP220-1 | |
| Eppendorf Snap-Cap 微量离心管（1.5 mL），500个/包 | Fisher Scientific | 20901-551 / 05-402 | |
| Fisherbrand 高精度 #4 型手术刀柄 | Fisher Scientific | 12-000-164 | |
| Fisherbrand 无铅高压灭菌指示胶带 | Fisher Scientific | 15-901-111 | |
| Fisherbrand 方形培养皿 | Fisher Scientific | FB0875711A | |
| Leica Zoom 2000 体视显微镜 | 显微镜中心 | L-Z2000 | |
| 微孔胶带 | 3M | B0082A9FEM | |
| MS基本培养基 | Sigma | M5519-10L | |
| Parafilm | Genesee Scientific | 16-101 | |
| 氢氧化钾 | VWR International Inc | AA13451-36 | |
| Redi-earth 插扦与育苗基质 | Sun Gro Horticulture | SUN239274728CFLP | |
| Scotts Osmocote Plus | Hummert International | 7630600 | |
| 手术设计编号22碳素手术刀片 | Fisher Scientific | 22-079-697 | |
| Tween 20，500 mL | Fisher Scientific | BP337500 | |
| Dumont 5号镊子，Dumoxel，110毫米 | VWR | 102091-580 |
参考文献
- Mudge, K., Janick, J., Scofield, S., Goldschmidt, E. E. A history of grafting. Horticultural Reviews. 35, 437-493 (2009).
- Holbrook, N. M., Shashidhar, V. R., James, R. A., Munns, R. Stomatal control in tomato with ABA-deficient roots: Response of grafted plants to soil dry....
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