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方法文章

可扩展、灵活且低成本的幼苗嫁接技术

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DOI：

10.3791/64519

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2023年1月6日

 , 
1Department of Plant and Microbial Biology, North Carolina State University, 2Plants for Human Health Institute, North Carolina State University

本文内容

摘要

本方案介绍了一种可靠的幼苗嫁接方法，无需任何前期经验或培训，且可在大多数分子生物学实验室中利用易获取的材料以极低的成本实施。

摘要

幼苗期嫁接已成为分子遗传学中研究植物根-茎关系的一种常用工具。由于模式植物拟南芥（Arabidopsis thaliana）幼苗体积微小且脆弱，对其进行早期幼苗嫁接在技术上具有挑战性且耗时较长。目前已发表的多种方法对此技术进行了描述，但其成功率、操作难度和相关成本各不相同。本文介绍了一种使用硅胶弹性体混合物自制可重复使用嫁接装置的简便方法，以及如何利用该装置进行幼苗嫁接。在本文发表时，每个可重复使用的嫁接装置仅需0.47美元的耗材成本即可制作完成。采用该方法，初学者可在不到3周的时间内完成首次成功的幼苗嫁接。这一高度便捷的流程将使植物分子遗传学实验室能够将幼苗嫁接常规纳入其实验操作体系。由于使用者可完全自主控制这些嫁接装置的制作与设计，如有需要，该技术也可轻松调整用于番茄或烟草等较大植物的嫁接。

引言

嫁接是一种古老的园艺技术，早在公元前500年就已成为一项成熟的农业实践1。该技术最初用于嫁接不同品种的农作物以提高产量，至今仍广泛应用于这一目的。在过去十年中，嫁接作为一种研究植物长距离信号传递的工具，受到了分子生物学家越来越多的关注2,3,4,5。尽管成年植株的嫁接相对容易，但在种子萌发后不久对幼苗进行嫁接则具有较大挑战性。然而，在研究植物发育、环境响应以及开花等过程中的长距离信号作用时，这种幼苗嫁接有时是必不可少的6,7,8。

Arabidopsis thaliana 因其体型相对较小、易于在实验室中培养等诸多原因，已成为植物生物学研究中的模式生物。然而，Arabidopsis 幼苗体型微小且脆弱，使得幼苗嫁接操作极具挑战性。在许多情况下，需经过大量实际操作训练才能成功完成幼苗嫁接。多年来，研究者已对方法学进行了诸多改进，明确了理想的生长条件，并开发出新的技术以提高幼苗嫁接的成功率9,10,11。最近引入的一种工具是 Arabidopsis 幼苗嫁接芯片，该芯片可使即使缺乏经验的操作者也能达到可接受的嫁接成功率12。尽管这一进展显著降低了幼苗嫁接的技术门槛，但该芯片设备成本较高，若需并行开展大量嫁接实验，其费用将迅速变得难以承受。

此外，该装置仅可用于下胚轴尺寸与野生型幼苗相似的Arabidopsis幼苗。尽管Arabidopsis是植物分子遗传学领域的关键物种，但近年来已有研究在其他物种中开展幼苗嫁接实验。例如大豆与菜豆的嫁接、烟草与番茄的嫁接，以及油菜与Arabidopsis的嫁接，并随后对两种组织进行小RNA取样分析13,14。因此，一种易于大多数实验室开展、且无需重大技术改动即可轻松适用于多种植物物种的嫁接方法具有重要需求。

本方案详细介绍了一种利用自制简易嫁接装置的方法，该装置可完全定制嫁接通道的直径和长度，以适配大多数植物物种的任何幼苗形态。这些装置的制备成本极低且易于规模化生产，所需组件仅包括硅胶弹性体、合适尺寸的导线或管材、高精度刀片以及用作模具的容器。按照本方案所述的嫁接操作步骤，用户可实现45%的嫁接成活率（n = 105），与此前报道的嫁接结果相当10,12。

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方案

1. 设备准备

  1. 通过将硅胶弹性体溶液倒入方形培养皿（100 mm × 100 mm）中来制备硅胶嫁接装置。按照制造商的说明，准备15 mL弹性体溶液。
    注意：硅胶弹性体试剂盒通常包含一种基于硅胶的液体和一种固化剂，混合后可使硅胶固化。
  2. 在方形培养皿中放置四段等间距的29 G金属丝，以准备培养皿（图1A）。确保金属丝与模具底部完全贴合。为充分拉直金属丝，可在坚硬均匀的表面上用重而平坦的物体（例如金属试管架）滚动金属丝。
    注意： 捆扎线通常含有29 G金属丝，可用丙酮去除外部纸质涂层后使用。
  3. 将混合好的硅胶弹性体溶液倒在金属丝上方，并用培养皿盖覆盖。在室温下静置固化24–48小时。
  4. 使用洁净镊子将硅胶片从培养皿中取出，并转移至洁净的平坦表面。
  5. 从硅胶片中取出金属丝。用尖头镊子去除通道外侧残留的薄层硅胶，使通道一侧保持开放（图1A）。
  6. 使用洁净剪刀将硅胶片垂直于通道方向切成3 mm宽的条状。将每条硅胶条转移至铝箔袋中，并用高压灭菌胶带密封。
  7. 在121 °C下对硅胶条进行高压灭菌至少30分钟，保存备用。

2. 幼苗准备

  1. 对种子进行灭菌和春化处理。
    1. 在1.5 mL离心管中，将最多100粒拟南芥（Arabidopsis）种子悬浮于1 mL含0.1% Tween 20的50%次氯酸钠溶液中，于无菌条件下孵育5–10分钟。通过移液或抽吸方式去除次氯酸钠溶液，加入1 mL无菌去离子水（dH2O）清洗种子。务必反复倒置离心管，充分清洗种子并去除管壁顶部残留的次氯酸钠溶液。重复清洗4次。
    2. 在离心管中保留约0.25 mL水分，与种子一同置于4 °C黑暗环境中保存3天。
  2. 将种子接种于培养基上，为嫁接做准备。
    1. 制备1%琼脂MS培养基平板：每升含0.5%蔗糖的MS固体培养基，称取4.4 g MS盐、5 g蔗糖和10 g琼脂溶于800 mL水中，用KOH调节pH至5.7，再加水定容至1 L。高压灭菌至少20分钟，冷却后向方形培养皿中倒入约25 mL培养基。
    2. 在无菌条件下，使用20 µL移液器吸头吸取并转移适量已处理的种子至培养基表面。
    3. 在培养基表面放置一条无菌定位条，引导种子排列，使种子与定位条上的沟槽对齐。种子接种完成后移除定位条。
      注意：一个100 mm × 100 mm的方形培养皿可容纳两排幼苗（图1B）。
    4. 将培养皿竖立放置，使培养基中的液体蒸发并积聚于皿底。种子接种后盖上皿盖，用封口膜密封与两排幼苗平行的一侧（如图1B中蓝色高亮区域所示），并在封口膜上方及培养皿其余边缘包裹透气胶带。
  3. 将两个培养皿小心竖立，使封有封口膜的一侧朝下。在两个培养皿底部之间放置一支水平的15 mL离心管以分开二者，并用橡皮筋固定。确保培养皿表面与实验台面形成100°–110°的夹角（图1C）。
  4. 将培养皿以该角度置于21 °C完全黑暗条件下培养72小时，使幼苗下胚轴生长至约5 mm长。72小时后取出培养皿，继续在相同温度下进行16小时光照（光强100 µE m-2 sec-1）和8小时黑暗的光周期条件下培养2–4天，随后进行嫁接。
  5. 在接种后第5至第7天进行幼苗嫁接。将嫁接用硅胶条覆盖于幼苗上方，使下胚轴嵌入沟槽中。轻柔调整幼苗位置，使根与下胚轴连接处位于硅胶条底部，为切割做准备（图1D）。

3. 嫁接操作步骤

  1. 通过使用70%乙醇对解剖显微镜进行消毒，并将两把尖头镊子和一把手术刀刀柄进行高压灭菌，以准备无菌工作环境。所有移植操作均须在无菌操作台中进行，并根据需要借助解剖显微镜完成。移植操作主要在10.5倍放大倍数下进行。
  2. 准备接穗。使用新的手术刀刀片垂直切割下胚轴，以获得平整干净的切口。切割时应向前推动刀片，而不是向下按压植物，以防止幼苗被推入琼脂中。视频 1).
  3. 去除茎段。注意保持茎段切口部分与培养基表面接触，以确保其水分供应。或者，可将茎段转移至指定的暂存区域，例如装有无菌去离子水的培养皿顶部。2O，直至准备使用。
  4. 准备砧木。轻轻抓住镊子闭合后留出的空隙中的根部，旋转镊子，使砧木的切段留在条带中央视频 2).
    注意：脆弱的根部若被闭合的镊子直接夹压会受到损伤，因此需将根部楔入镊子尖端的锐角处以操作组织。
  5. 用精细尖头镊子轻轻夹取目标茎段，插入通道顶部。
    注意：为确保嫁接成功，必须目视确认接穗与砧木之间的接触（视频 3).
  6. 在完成所有嫁接操作后，用封口膜和透气胶带将培养皿包好，并以与之前相同的方式放置，避免扰动幼苗或硅胶条。随后小心地将培养皿转移至设定为26 °C、光照16小时/黑暗8小时循环的生长培养箱中。
  7. 在无菌条件下评估嫁接后的幼苗，时间为7-10天。用镊子小心地从一侧揭起硅胶条，将其剥离，使通道释放出幼苗。使用新的解剖刀刀片切除接穗上长出的不定根，或用尖头镊子夹碎。通过肉眼观察判断砧木是否已牢固地与接穗连接，形成成功的嫁接图2).
  8. 将成功嫁接的植株移栽至幼苗繁殖用土壤中，根据需要生长相应时间。幼苗定植期间，用透明塑料薄膜覆盖土壤数天。移栽至土壤后，在21 °C下按照前述光照与黑暗循环条件进行培养。

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结果

通过测试嫁接条设计的多个方面，以确定所需技术熟练度最低的最优嫁接条件（表1）。所有嫁接实验均在含0.5%蔗糖的MS培养基上完成，该培养基此前已被报道为理想的嫁接培养基11,12。

在嫁接条带上直接发芽无法实现幼苗的最佳生长
在初代硅胶条设计中，通过在导线从硅胶片上移除后，保留条带通道背面的一层薄硅胶来形成封闭的通道。与直接在培养板上发芽、再将嫁接条覆盖于幼苗下胚轴上的方法不同，该方法是在将种子置入填充少量MS培养基的通道后，直接在条带上进行发芽。采用此技术时，约一半的幼苗在发芽过程中卡在通道内，无法正常伸长。包括未发芽和未伸长的幼苗在内，嫁接成功率仅为25%（n = 16）（表1）。为解决幼苗伸长失败的问题，调整了种子方向，使胚的子叶和胚根朝下进行发芽。采用该方法后，75%的种子成功发芽并伸长，嫁接效率略有提高（成功率为33%，n = 12）（

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讨论

总结与意义
嫁接界面的形成对于成功嫁接至关重要，这需要砧木与接穗之间直接且不受干扰的接触。拟南芥等小型植物的幼苗体型微小且脆弱，技术上难以满足这一要求。早期的拟南芥幼苗嫁接方法中开发了一种技术，即将接穗和砧木同时插入一段短的硅胶管套中，以支撑嫁接部位10。尽管该方法在防止两个嫁接部分分离方面非常有效，但将脆弱的接穗和砧木插入内径狭窄的管中并非易事。此外，随着植株生长，嫁接部位逐渐增粗，常常导致难以在不损伤嫁接幼苗的情况下移除窄径硅胶管。其他方法则采用替代技术以避免使用嫁接套管，同时防止幼苗在生长过程中移动，例如切除接穗的两片子叶，并将嫁接后的幼苗培养在倾斜的表面上9,11。虽然这些方法所需资源较少，但在实际试验中，这些方法导致接穗从砧木上显著移位，嫁接成功率低于报道值（两项研究中推荐条件下的平均成功率约为80%）。此外，这些方法均要求操作者在没有任何辅助装置的情况下精确对齐嫁接部位的接触界面，...

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

感谢 Javier Brumos 在嫁接技术方面的初步培训与指导 拟南芥 幼苗

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
15 mL 离心管VWR International Inc10026-076
乙腈（HPLC级） & ACS 认证溶剂）4 LVWRBJAH010-4
BactoAgarSigmaA1296-500g
道康宁 SYLGARD 184 透明硅胶封装剂 0.5 kg 套件道2646340
D-蔗糖（分子生物学级），1 kgFisher ScientificBP220-1
Eppendorf Snap-Cap 微量离心管（1.5 mL），500个/包Fisher Scientific20901-551 / 05-402
Fisherbrand 高精度 #4 型手术刀柄Fisher Scientific12-000-164
Fisherbrand 无铅高压灭菌指示胶带Fisher Scientific15-901-111
Fisherbrand 方形培养皿Fisher ScientificFB0875711A
Leica Zoom 2000 体视显微镜显微镜中心L-Z2000
微孔胶带3MB0082A9FEM
MS基本培养基SigmaM5519-10L
ParafilmGenesee Scientific16-101
氢氧化钾VWR International IncAA13451-36
Redi-earth 插扦与育苗基质Sun Gro HorticultureSUN239274728CFLP
Scotts Osmocote PlusHummert International7630600
手术设计编号22碳素手术刀片Fisher Scientific22-079-697
Tween 20，500 mLFisher ScientificBP337500
Dumont 5号镊子，Dumoxel，110毫米VWR102091-580

参考文献

  1. Mudge, K., Janick, J., Scofield, S., Goldschmidt, E. E. A history of grafting. Horticultural Reviews. 35, 437-493 (2009).
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