微生物和化学刺激诱导的中性粒细胞胞外陷阱的形态学和组成分析

摘要

这里介绍的是用于体外中性粒细胞细胞 外 陷阱（NET）的诱导和分析方案。对DNA，cathelicidin（LL37）和酶活性的定量产生了数据，这些数据显示了在类似受控条件下由微生物和化学刺激诱导的NET的组成和形态的变化。

摘要

中性粒细胞通过采用多种机制（例如中性粒细胞细胞外陷阱（NET）的形成）作为先天免疫反应的第一道细胞防御线。本研究使用标准化的 体外 方法分析了微生物和化学刺激诱导的NETs的形态和组成变化，用于人体细胞的NET诱导和表征。这里描述的程序允许分析NET形态（裂解或非裂解）和组成（DNA-蛋白质结构和酶活性），以及可溶性因子或细胞接触对这些特征的影响。此外，可以修改此处描述的技术以评估外源性可溶性因子或细胞接触对NET组成的影响。

应用的技术包括使用双密度梯度（1.079-1.098 g/mL）从人外周血纯化多形核细胞，保证最佳纯度和活力（≥95%），如Wright染色，台盼蓝排除和流式细胞术（包括FSC与SSC分析和7AAD染色）所示。通过微生物（铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌和 白色念珠菌）和化学（醋酸佛波肉豆蔻酸酯，HOCl）刺激诱导NET形成，NET的特征是DNA-DAPI染色，抗菌肽cathelicidin（LL37）的免疫染色以及酶活性（中性粒细胞弹性蛋白酶，组织蛋白酶G和髓过氧化物酶）的定量。通过荧光显微镜获取图像并使用ImageJ进行分析。

引言

中性粒细胞是血液中最丰富的白细胞，在通过多种机制清除致病剂的过程中起着至关重要的作用，包括释放由DNA和几种核，细胞质和颗粒抗菌蛋白组成的大染色质结构^1，2。描述中性粒细胞这种抗菌作用的直接前因是由Takei等人于1996^年提出的。这些作者报告了一种不同于中性粒细胞凋亡和坏死性凋亡的新死亡形式，表现出表现出核破裂的形态变化，然后从核质溢出到细胞质中，并且膜通透性从与佛波肉豆蔻酸酯（PMA^）孵育3小时后增加2^，3。然而，直到2004年才使用术语"中性粒细胞细胞外陷阱（NET）"⁴。

在细菌、真菌⁵、病毒⁶ 和寄生虫感染等各种条件下观察到 NET 形成，用于中和、杀死和防止微生物传播⁷。其他研究表明，它也可以通过无菌刺激在非致病条件下发生，例如细胞因子、尿酸单钠或胆固醇晶体、自身抗体、免疫复合物和活化的血小板⁷.脂多糖（LPS），白细胞介素-8（IL-8）和PMA是....

方案

血液样本是在知情同意后从临床健康受试者那里作为捐赠获得的。所有实验均在瓦哈卡自治大学"贝尼托·华雷斯"生物化学科学学院人类研究伦理委员会的许可下进行。

注意:研究中的纳入标准是性别和年龄模糊不清，根据参与者在采集血液样本前对问卷的回答，临床健康。进行血液学分析以确定细胞计数并排除感染或贫血，以及C反应蛋白测试以排除供体中的炎症。

1.外周血采集，获取红细胞和白细胞包

1. 在装有1.8 mg/mLK_2·的试管中静脉穿刺收集10 mL外周血EDTA作为抗凝剂（见 材料表）来自临床健康个体在获得知情同意后。然后，进行标准的血液生物测定和C反应蛋白测试以排除感染或炎症，确保样品的质量。
2. 将外周血样品以82 x g 离心15分钟以除去富含血小板的血浆，然后以630 x g 第二次离心5分钟。丢弃剩余的血浆以获得红细胞和白细胞包。
3. 用 1x Dulbecco 的磷酸盐缓冲盐水 （DPBS） 以 1:1 的比例 （v/v） 稀释。

2. 使用双密度梯度的多形核中性粒细胞（PMN）纯化

注意:收集血液后立即....

结果

中性粒细胞的纯度和活力
动态细胞相在试管中通过双密度梯度纯化可视化。在这些层中，对应于粒细胞的层高于1.079 g/mL密度层，与外周血单核细胞（PBMC）和红细胞的阶段不同（图1A）。通过观察与成熟中性粒细胞对应的线状细丝连接的分段细胞核的细胞，通过Wright染色验证纯化细胞的形态（图2A）。由于中性粒细胞的半衰期缩短，活力是后续NET诱导实验的关键点。因此，通过台盼蓝排除染色验证细胞活力，评估染料未渗透时质膜的完整性（图2B）。此外，7AAD插入DNA的胞嘧啶和鸟嘌呤碱基并发出荧光，这有助于排除死细胞（图2C，D）。这些程序在10个实验中导致细胞纯度为98.9%±0.06%，细胞活力为95.5%±4.2%。

讨论

必须获得高纯度的活中性粒细胞群以诱导NET的释放，因为这些细胞的 离体 寿命有限，平均为8小时，必须在这段时间内进行所有实验。为此，理想的方法是双密度梯度，通过分离对外源性刺激更敏感的非活化细胞来优化纯化时间，与Ficoll-Histopaque梯度或葡聚糖沉降技术相比¹⁷。双密度梯度法的另一个优点是，与依赖于细胞表面抗原（例如中性粒细胞中的CD16^hi ）的高纯度细胞富集技术（例如荧光激活细胞分选（FACS）和磁激活细胞分选（MACS））相比，其成本相对较低。除了成本高外，这些分选方法还可能导致靶细胞在抗体-抗原相互作用过程中的意外活化，并增加中性粒细胞的 离体 时间，因为这两种技术通常在密度梯度纯化后使用。细胞形态和活力排除了纯化的中性粒细胞的改变，并确认观察到的变化是特异性的，在相同的实验条件下，与静息中性粒细胞相比，在没有刺激的情况下响应添加的刺激（图2）。这证实了该方案作为无菌和可重复的中性粒细胞分离方法的效率，而不会改变细胞活力和形态。排除了嗜酸性粒细胞的这种贡.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
细胞培养用 24 孔板	康宁	3526
7-氨基放线菌素 D （7-AAD）	BD Pharmingen	51-668981E
96 细胞培养用孔板	Costar	3596	平底
搅拌器	CRM 球形	CRM-OS1
抗体 LL37	Santa Cruz Biotechnology	sc-166770
血液收集管	BD VACUTAINER	368171	K2 EDTA 7.2 mg
羧基荧光素琥珀酰亚胺酯 （CFSE）	Sigma-Aldrich	21878
离心机	Hettich	1406-01
盖玻片	Madesa	M03-CUB-22X22	22 mm x 22 mm
Dulbecco´磷酸盐缓冲盐水 （DPBS）	沉箱	1201022
Falcon 管 50 mL	康宁	430829
流式细胞仪管	Miltenyi Biotec		5 mL - 无盖
FlowJo 软件	BD Biosciences		分析流式细胞仪数据
荧光显微镜	DM 2000	LEICA
Fluoroshield 带 DAPI	Sigma-Aldrich	F6057
培养箱	NUAIRE	UN-4750
MACSQuant 分析仪	Miltenyi Biotec		流式细胞仪
酶标仪 光度计	克拉克森实验室 - CL
微管 1.5 mL	浙江 Runlab Tech	35200N	线卡
Minitab 软件	Minitab		统计分析
针	BD VACUTAINER	301746	直径 1.34 毫米
光学显微镜	VELAB	VE-B50
Percoll	GE Healthcare	17-0891-01	密度梯度溶液
磷酸盐缓冲盐水 （10x）	沉箱	PBL07-500ML
耐热玻璃培养管	康宁	CLS982025	N°9820
RPMI 1640 1x	康宁	10-104-CV	含有谷氨酸
载玻片	Madesa	PDI257550	22 mm x 75 mm
台盼蓝溶液 0.4%	SIGMA	T8154-100ML