由微生物和化学刺激物诱导的中性粒细胞胞外诱捕网的形态学与成分分析

摘要

本文介绍了一种诱导与分析的方法方案 体外 中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）。通过定量DNA、抗菌肽（LL37）及酶活性，获得数据显示在相似的受控条件下，由微生物和化学刺激诱导产生的NETs在组成和形态上存在差异。

摘要

中性粒细胞通过多种机制在先天免疫反应中发挥第一道细胞防御作用，例如形成中性粒细胞胞外诱捕网（neutrophil extracellular traps, NETs）。本研究采用标准化方法分析微生物和化学刺激物诱导的NETs在形态和组成上的变化 体外 用于诱导和表征人类细胞中NET的方法。本文所述方案可用于分析NET的形态（裂解性或非裂解性）和组成（DNA-蛋白质结构及酶活性），以及可溶性因子或细胞接触对这些特征的影响。此外，本文描述的技术可经修改用于评估外源性可溶性因子或细胞接触对NET组成的影响。

所采用的技术包括利用双密度梯度（1.079–1.098 g/mL）从人外周血中纯化多形核细胞，通过瑞氏染色、台盼蓝排斥法及流式细胞术（包括前向散射光与侧向散射光分析以及7AAD染色）验证，可确保细胞纯度和活性达到最佳水平（≥ 95%）。中性粒细胞胞外诱捕网（NET）的形成通过微生物刺激诱导铜绿假单胞菌，金黄色葡萄球菌，以及 白色念珠菌）以及化学刺激物（佛波酯，HOCl）进行刺激，并通过DNA-DAPI染色、抗菌肽cathelicidin（LL37）免疫荧光染色以及酶活性（中性粒细胞弹性蛋白酶、组织蛋白酶G和髓过氧化物酶）定量来表征NETs。图像通过荧光显微镜采集，并使用ImageJ软件进行分析。

引言

中性粒细胞是血液中最丰富的白细胞，在清除病原体过程中通过多种机制发挥关键作用，其中包括释放由DNA以及多种细胞核、细胞质和颗粒抗菌蛋白组成的大分子染色质结构^1,2。最早描述中性粒细胞这种抗菌作用的文献由Takei等人³于1996年发表。这些作者报道了一种不同于凋亡和坏死性凋亡的新型细胞死亡方式，表现为中性粒细胞出现核破裂，随后核质释放到细胞质中，并在佛波酯（phorbol myristate acetate, PMA）刺激孵育3小时后细胞膜通透性增加^2,3。然而，直到2004年，“"中性粒细胞胞外诱捕网（neutrophil extracellular traps, NETs）"”这一术语才被正式提出⁴。

中性粒细胞胞外诱捕网（NET）的形成已在多种条件下被观察到，例如细菌、真菌感染等⁵，病毒的⁶以及寄生虫感染，用于中和、杀灭微生物并防止其扩散⁷其他研究表明，无菌性刺激物（如细胞因子、单钠尿酸....

方案

血液样本来自临床健康志愿者在知情同意后的捐赠。所有实验均获得瓦哈卡自治大学生物化学科学学院人类研究伦理委员会许可后进行。

注意：研究的纳入标准为性别和年龄不明确，且根据参与者在采集血样前填写的问卷结果显示临床健康。通过血液学分析确定细胞计数，并排除感染或贫血；同时进行C反应蛋白检测，以排除供体存在炎症。

1. 外周血采集及红细胞与白细胞组分的获取

1. 在获得知情同意后，使用含 1.8 mg/mL K_2·EDTA 作为抗凝剂的试管，通过静脉穿刺采集 10 mL 外周血（参见材料表）。随后进行标准血液计数和 C-反应蛋白检测，以排除感染或炎症，确保样本质量。
2. 将外周血样本在 82 x g 条件下离心 15 分钟，去除富血小板血浆，随后在 630 x g 条件下再次离心 5 分钟。弃去剩余血浆，获得红细胞和白细胞沉淀。
3. 用 1x Dulbecco 磷酸盐缓冲液（DPBS）按 1:1（v/v）比例稀释。

2. 采用双密度梯度法纯化多形核中性粒细胞（PMN）

注意：采集血液后应立即进行中性粒细胞....

结果

中性粒细胞的纯度与活力
通过双密度梯度纯化后，在离心管中可观察到不同的动态细胞层。其中，对应于粒细胞的层位于密度为1.079 g/mL的分层之上，可与外周血单个核细胞（PBMCs）及红细胞所在层区分开来（图1A）。通过Wright染色验证纯化细胞的形态，显微镜下可见具有由细丝状结构连接的分叶核的细胞，符合成熟中性粒细胞的特征（图2A）。由于中性粒细胞的半衰期较短，其活力对于后续的NET诱导实验至关重要。因此，采用台盼蓝排斥染色法检测细胞活力，通过评估染料无法穿透完整细胞膜的情况来判断细胞膜的完整性（图2B）。此外，7AAD可插入DNA的胞嘧啶和鸟嘌呤碱基对之间并发出荧光，从而便于识别并排除死细胞（图2C、D）。在10次独立实验中，上述方法获得的细胞纯度为98.9% ± 0.06%，细胞活力为95.5% ± 4.2%。

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讨论

必须获得高纯度的活中性粒细胞群体，以诱导NETs的释放，因为这些细胞的寿命有限 离体 平均寿命为8小时，在此期间必须完成所有实验。为此，理想的方法是采用双密度梯度法，以优化纯化时间，分离出对异源刺激更敏感的非活化细胞，相比之下，该方法优于Ficoll-Histopaque密度梯度法或右旋糖酐沉降法¹⁷双密度梯度法的另一优势在于其成本相对较低，相较于依赖细胞表面抗原（如CD16）的高纯度细胞富集技术，例如荧光激活细胞分选（FACS）和磁激活细胞分选（MACS），该方法更具经济性^你好 中性粒细胞中。除了成本较高外，这些分选方法还可能在抗体-抗原相互作用过程中引起靶细胞的非预期活化，并增加 离体 中性粒细胞的作用时间，因为这两种技术通常在密度梯度纯化后使用。细胞形态和活力检测可排除纯化中性粒细胞的异常变化，并证实所观察到的变化是相对于未受刺激的静息中性粒细胞在相同实验条件下对所加刺激物的特异性反应图2）。这证实了该方案在不改变细胞活力和形态的情况下，作为一种无菌且可重复的中性粒细.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
用于细胞培养的24孔板	Corning	3526
7-氨基放线菌素D（7-AAD）	BD Pharmingen	51-668981E
用于细胞培养的96孔板	Costar	3596	平底
振荡器	CRM Globe	CRM-OS1
LL37抗体	Santa Cruz Biotechnology	sc-166770
血液采集管	BD VACUTAINER	368171	K2 EDTA 7.2 mg
羧基荧光素琥珀酰亚胺酯（CFSE）	Sigma-Aldrich	21878
离心机	Hettich	1406-01
盖玻片	Madesa	M03-CUB-22X22	22 mm × 22 mm
Dulbecco´s 磷酸盐缓冲液（DPBS）	Caisson	1201022
50 mL Falcon管	CORNING	430829
流式细胞术管	Miltenyi Biotec		5 mL - 无盖
FlowJo软件	BD Biosciences		分析流式细胞术数据
荧光显微镜	DM 2000	LEICA
含DAPI的Fluoroshield封片剂	Sigma-Aldrich	F6057
培养箱	NUAIRE	UN-4750
MACSQuant分析仪	Miltenyi Biotec		流式细胞仪
微孔板读数仪（光度计）	Clarkson Laboratory - CL
1.5 mL微量离心管	Zhejiang Runlab Tech	35200N	带金属夹扣
Minitab软件	Minitab		统计分析
针头	BD VACUTAINER	301746	直径1.34 mm
光学显微镜	VELAB	VE-B50
Percoll	GE Healthcare	17-0891-01	密度梯度溶液
磷酸盐缓冲液（10×）	Caisson	PBL07-500ML
Pyrex培养管	CORNING	CLS982025	N°9820
RPMI 1640 1×	Corning	10-104-CV	含Glutagro
载玻片	Madesa	PDI257550	22 mm × 75 mm
0.4%台盼蓝溶液	SIGMA	T8154-100ML