通过全光谱流式细胞术分析原代小鼠T细胞中T细胞受体诱导的钙离子内流

摘要

钙离子内流是T细胞信号传导的指标，可用于有效分析T细胞受体刺激后的反应。该方案利用全光谱流式细胞术高度灵活的检测能力，将Indo-1与针对细胞表面分子的多色抗体组合进行多重检测。

摘要

T细胞受体刺激后钙离子内流是衡量T细胞信号转导的常用指标。已有多种钙离子指示染料被开发用于通过带通流式细胞术评估钙信号。本实验方案旨在利用全光谱流式细胞术检测原代小鼠T细胞的钙离子反应。将总脾细胞用比例型钙离子指示染料Indo-1以及一组针对细胞表面分子的荧光素偶联抗体进行标记。借助全光谱流式细胞术的能力，可将多种细胞表面染色与Indo-1联合使用。随后，在37 °C条件下实时分析细胞，在加入抗CD3抗体刺激T细胞受体前后分别检测。在对光谱信号进行解混后，计算钙结合态与无钙Indo-1的比值，并可随时间变化对每一群门控的脾细胞进行可视化分析。该技术可实现对多个细胞群体钙反应的同时分析。

引言

T细胞受体（TCR）诱导的钙离子内流是衡量T细胞活化的有效指标，常用于判断某一T细胞群体在TCR信号通路的早期步骤中是否存在反应缺陷¹。钙离子内流的检测通常通过预先用一种或一对荧光钙离子指示染料对T细胞进行标记，然后在TCR交联后利用流式细胞术实时检测荧光信号来完成^2，3，4。Indo-1是一种比率型钙离子染料，可被紫外激光激发，其在两种不同波长处的峰值发射强度取决于是否结合钙离子⁵，是流式细胞术分析活淋巴细胞钙反应中常用的指示染料。由于Indo-1的发射光谱较宽，在使用带通滤光片的流式细胞术中同时分析多个细胞表面标志物时，常难以与Indo-1的检测兼容。这一限制使得钙反应的流式细胞术分析通常仅限于预先纯化的T细胞群体，或仅能通过有限数量的细胞表面分子来鉴定的细胞群体。

为克服使用带通流式细胞术检测原代淋巴细胞异质性群体中钙反应的局限性，已建立一种利用全光谱流式细胞术检测Indo-1荧光的实验方案。该方法可将Indo-1与针对细胞表面分子的多种抗体组合联用，充分利用全光谱流式细胞术高度灵活的技术优势。相较于传统流式细胞术，全光谱流式细胞术的优势在于能够区....

方案

小鼠饲养于科罗拉多大学安舒茨医学校区，遵循IACUC规程。所有小鼠均按照AAALAC标准实施安乐死。

1. 小鼠脾脏免疫细胞的制备

注意：使用 CO₂ 安乐死法处死未处理小鼠。实验使用 6–12 周龄购自 Jackson Laboratories 并在本机构内繁育的 C57BL/6 小鼠。实验同时使用雄性和雌性小鼠。

1. 用70%乙醇对小鼠皮肤进行消毒，以减少外部污染物进入样本的可能性。
2. 使用解剖工具、手术剪和镊子解剖小鼠脾脏。取出脾脏后，将离体脾脏置于含有约5 mL完全RPMI培养基（cRPMI）的50 mL圆底离心管中，并置于冰上。
   注意：完全 RPMI 培养基包含 10% FBS、2 mM L-谷氨酰胺和 1% 青霉素/链霉素。
   1. 为了获取小鼠脾脏，使用剪刀在小鼠前后肢中点左侧的皮毛和皮肤上做一个约5厘米的切口。打开腹腔约5厘米，用镊子取出脾脏。脾脏呈肾形，颜色类似芸豆，比邻近的肾脏更长且更扁平。
3. 将步骤1.2中的内容倒入无菌70 µ将脾脏通过连接至新50 mL锥形管的70 μm滤器，使用5 mL注射器活塞将脾脏压过滤器，机械分散成单细胞悬液，直至滤器表面无残留脾组织。
4. 利用摆动转子台式离心机以500 × g....

结果

使用 Indo-1 比率型染料结合多重表面染色法检测原代小鼠 T 细胞钙反应的实验流程如图 1所示。在收获并处理小鼠脾细胞以获得单细胞悬液后，细胞用 Indo-1 AM 酯染色，并用荧光染料标记的抗体进行表面染色。完成染料负载和抗体染色后，将淋巴细胞样本升温至生理温度（37 °C）。随后，通过全光谱流式细胞术对样本进行分析，在设门选定目标细胞亚群后，无需在分析前对样本进行分选。为了在全光谱流式细胞仪中使用雪崩光电二极管（Avalanche Photo Diode, APD）检测器，需将带通滤光片测量的峰值发射波长（单位为 nm）转换为 APD 上对应的通道。如图 2所示的表格提供了参考指南，但 Indo-1 两种荧光信号（钙结合态与无钙结合态）的最佳检测通道需通过实验确定。为此，需制备单染 Indo-1 的样本：使用离子霉素（Ionomycin）产生 Indo-1（钙结合态）信号，使用钙螯合剂 EGTA 产生 Indo-1（无钙结合态）信号。通过全光谱流式细胞术分析后，可观察到每种 Indo-1 信号对应的峰值荧光强度.......

讨论

本方案描述了一种优化的检测方法，旨在利用全光谱流式细胞术测量负载了滴定浓度的 Indo-1 比值型指示染料的原代小鼠 T 细胞中的钙离子反应^7,8。采用全光谱流式细胞术进行钙流检测的优势在于，能够同时进行细胞表面标志物染色与 Indo-1 荧光信号的检测。全光谱流式细胞术的优势在于允许使用光谱高度重叠的染料，从而增加检测面板中可同时使用的标志物数量。这是因为全光谱流式细胞仪在分析每个样本时，通过一组检测器收集激光激发后产生的全部发射光，而不是为每种荧光染料分配单一的检测器。利用每种荧光染料的完整发射光谱，可提高检测的灵敏度，并能够识别出在带通滤光流式细胞仪上信号会重叠的、光谱特征独特的荧光染料。此外，该方法也无需在检测前对目标细胞亚群进行预先分离。

在本研究中，采用荧光染料偶联抗体对一组细胞表面标志物进行了检测。该抗体组合包括 αCD4-APC-Cy7、αCD8-FITC、αCD19-PE、αTCRβ-PerCP-Cy5.5、αTCRδ-PE-Cy5、αCD25-P.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
12 孔 TC 处理板	Cell Treat	229111
50 mL 圆锥形离心管	Greiner Bio1	41-12-17-03	带盖的 50 mL 聚丙烯离心管
5 mL 聚苯乙烯流式管	Corning	352052
5 mL 注射器	BD 注射器	309646	仅使用推杆，针筒丢弃
70 µm 滤膜	Greiner bio1	542070
aCD3 (17A2)	Biolegend	100202
AKC 裂解缓冲液	Gibco	A1049201
Aurora 光谱流式细胞仪	https://cytekbio.com/pages/aurora
恒温振荡金属珠	coleparmer	货号 # UX-06274-52
CD19 PE	Tonbo	50-0193-U100
CD1d 四聚体 APC	NIH
CD25 PECy7	ebioscience	15-0251
CD4 APC Cy7	Tonbo	25-0042-U100
CD8a FITC	ebioscience	11-0081-85
细胞培养箱	Formal Scientific
解剖工具 镊子	McKesson	#487593	McKesson Adson 组织镊，4-3/4 英寸长度，办公级不锈钢，非无菌，无锁扣拇指柄，1×2 齿
解剖工具 剪刀	McKesson	#970135	McKesson Argent™ 手术剪，4-1/2 英寸，外科级不锈钢，指环柄，直头锐尖/锐尖
DPBS 1×	Gibco	14190-136	DPBS
EGTA	Fisher	NC1280093
FBS	Hyclone	SH30071.03	批号 AE29165301
FlowJo 软件	https://www.flowjo.com/
Indo1-AM 乙酰甲酯染料	ebioscience	65-085-39	钙离子负载染料
离子霉素	Millipore	407951-1mg
活/死细胞染料 Ghost 540	Tonbo	13-0879-T100
微量离心管 1.7 mL	Light Labs	A-7001
青霉素/链霉素/L-谷氨酰胺	Gibco	10378-016
PRN694	Med Chem Express	Hy-12688
纯化抗小鼠 CD16/CD32 抗体（FC Shield）（2.4G2）	Tonbo	70-0161-M001	FC 封闭剂
RPMI	Gibco	1875093	+ 酚红
无酚红 RPMI	Gibco	11835030	- 酚红
台式离心机	Beckman Coulter	Allegra612
TCRβ PerCP Cy5.5	ebioscience	45-5961-82
TCRγ/δ Pe Cy5	ebioscience	15-5961-82
Vi-Cell Blu 试剂包		产品编号：C06019	包含台盼蓝
Vi-Cell Blu	Beckman Coulter
水浴振荡器	Fisher Brand 干浴器