慢性绵羊右心室衰竭与功能性三尖瓣反流模型

摘要

右心室衰竭和功能性三尖瓣反流与左侧心脏疾病及肺动脉高压相关，是导致患者发病和死亡的重要因素。建立研究右心室衰竭和功能性三尖瓣反流的慢性绵羊模型，将有助于理解其发病机制、疾病进展及可能的治疗方法。

摘要

与右心室功能障碍相关的重度功能性三尖瓣反流（FTR）的病理生理机制尚不明确，导致临床治疗效果欠佳。本研究旨在建立一种慢性绵羊FTR及右心衰竭模型，以探讨FTR的发生机制。20只成年雄性绵羊（6-12月龄，体重62 ± 7 kg）接受左侧开胸术并完成基线超声心动图检查。通过在主肺动脉（PA）周围放置并收紧肺动脉环缩带（PAB），使收缩期肺动脉压力（SPAP）至少增加一倍，从而诱导右心室（RV）压力超负荷及右心室扩张的征象。PAB使SPAP从21 ± 2 mmHg急性升高至62 ± 2 mmHg。动物术后随访8周，出现心力衰竭症状时使用利尿剂治疗，并通过监测性超声心动图评估胸腔和腹腔积液情况。随访期间有3只动物因卒中、出血和急性心力衰竭死亡。2个月后，行正中胸骨切开术及心外膜超声心动图检查。在存活的17只动物中，3只出现轻度三尖瓣反流，3只出现中度三尖瓣反流，11只出现重度三尖瓣反流。持续8周的肺动脉环缩可稳定建立一种表现为右心室功能障碍和显著功能性三尖瓣反流的慢性绵羊模型。该大型动物平台可用于进一步研究右心室衰竭及功能性三尖瓣反流的结构与分子基础。

引言

右心室衰竭（RVF）被认为是导致心脏病患者发病和死亡的重要因素。RVF最常见的病因是左侧心脏病和肺动脉高压¹。在RVF进展过程中，功能性三尖瓣反流（FTR）可能继发于右心室（RV）功能障碍、瓣环扩张以及瓣下结构重塑。中度至重度FTR是独立的死亡预测因子^2,3，据估计，约80%–90%的三尖瓣反流病例属于功能性病因⁴。FTR本身可能通过影响后负荷或前负荷而促进不良的心室重塑⁵。三尖瓣在历史上曾被称为“被遗忘的瓣膜”⁶，过去认为治疗左侧心脏病即可解决相关的右心室病变及FTR⁷。然而，近期数据表明这一策略存在缺陷，目前的临床指南主张对FTR采取更为积极的干预措施⁴。尽管如此，与右心室功能障碍相关的重度FTR的病理生理机制仍不明确，导致临床疗效欠佳⁸。目前可用的大型动物RVF模型主要基于压力负荷、容量负荷或混合性超负荷建立。我们此前曾报道过一种RVF和三尖瓣反流的大型动物模型，但仅限于急性状态下的研究⁹。

本研究聚焦于一种慢性绵羊肺动脉束带结扎（PAB）模型，旨在增加右心室（RV）后负荷（压力超负荷），并诱导右心室功能障碍及功能性三尖瓣反流（FTR）。与肺动脉高压模型相比，该后负荷模型具有更高的可靠性与可重复性，因为在肺动脉高压模型中，微血管结构的变化较难预测且更易出现变异¹⁰。本研究的目标是建立一种能够准确模拟左心疾病和肺动脉高压患者右心室压力超负荷状态的慢性大型动物模型，用于研究右心衰竭（RVF）和FTR。该模型的建立将有助于深入探讨与右心室功能障碍及三尖瓣反流相关的室壁与瓣膜重构的病理生理机制。选择绵羊作为模型动物，是基于我们既往在二尖瓣方面的研究工作，以及已有文献所支持的人类与绵羊心脏在解剖结构和生理功能上的高度相似性^11,12,13。

本研究中，20只成年绵羊（体重 62 ± 7 kg）接受了左侧开胸术及主肺动脉束带结扎术（PAB），使肺动脉收缩压（SPAP）至少升高至原来的两倍，从而诱导右心室压力超负荷。动物被随访8周，在出现心力衰竭临床症状时使用利尿剂进行治疗。定期进行监测性超声心动图检查，以评估右心室功能及瓣膜功能状态。在完成模型建立的实验方案（8周）后，将动物再次送入手术室，接受胸骨正中切开术，并在心外膜及心内结构上植入声学测微晶体。该手术在心脏跳动状态下进行体外循环，并采用上下腔静脉阻断技术完成。所有动物均能顺利脱离体外循环，并在无需正性肌力药物支持右心功能的稳定血流动力学环境中成功获取声学测微数据。我们预计在不久的将来，将通过右侧开胸入路，在终末性及存活性实验中开展三尖瓣成形环环缩术及其他右心手术。目前的经验使我们相信，动物能够顺利脱离体外循环，且长期存活是可行的。因此，我们认为该模型可用于实施具有临床相关性的心脏手术。以下是实施绵羊实验方案所涉及的各步骤（围手术期及手术操作）的详细描述。

方案

本实验方案已获得密歇根州立大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准（方案编号 2020-035，批准日期为 2020 年 7 月 27 日）。本研究共使用 20 只成年雄性绵羊，体重为 62 ± 7 kg。

1. 术前步骤

1. 手术前 12 小时开始禁食动物（过夜）。
2. 将动物置于羊用固定椅中（图 1），准备使用长 11 Fr 导入鞘（鞘长度 = 10 cm）进行右侧颈静脉插管。
3. 使用电推剪在静脉置管部位（右侧颈部前侧，距中线约 10–15 cm 处）进行剃毛。
4. 将动物头部转向左侧，以暴露颈部右侧前部和侧部区域。定位颈静脉走行路径；为便于操作，可压迫颈部下端以使静脉充盈扩张。
5. 使用氯己定和酒精基消毒液清洁皮肤，并用 1% 利多卡因进行局部麻醉。
6. 按照以下步骤在颈部中上三分之一处进行颈静脉插管：
   1. 使用 11 号刀片垂直于静脉方向切开静脉上方皮肤。
   2. 用 14 G 血管套管针穿刺静脉；当穿刺成功（有血液自针头流出或可见血液）后，拔出针芯，保留套管，插入导丝，撤出套管，置入 11 Fr 导入鞘并固定。
   3. 通过回抽暗红色血液以及用生理盐水冲洗以确认导管通畅，并观察穿刺部位无肿胀，确保导管位置正确。
7. 开始静脉注射丙泊酚，诱导剂量为 1.0–1.5 mg/kg。
8. 使用喉镜（配备 5 号镜片）插入 9 号气管导管。操作时，一人应固定 下颌和舌头，另一人识别 气管位置，插入气管导管并充气密封套囊。通过双侧呼吸音及气管导管壁上的冷凝水雾确认导管位置正确。
9. 静脉给予镇痛药布托啡诺，剂量为 0.01 mg/kg；同时使用 240 mg 妥布霉素和 1 g 头孢唑林 进行抗生素预防。
10. 将动物从羊用固定椅转移至手术台，并使其右侧卧位固定。

2. 手术步骤

1. 以15 mL/kg（12-18次/分钟）通气，氧流量为4 L/min，异氟烷浓度为2.5%-4.0%。通过检查下颌张力和眼球转动确认麻醉深度，确保动物处于外科手术水平（3期）。
2. 通过涂抹眼用软膏润滑双眼 插入胃管以确保气体和食物排出。连接心电图（EKG）、脉搏血氧仪（SpO₂）₂），二氧化碳描记仪（ETCO₂）₂）和体温监测仪。将心电图肢体导联（I、II、III）连接至皮肤 通过 鳄鱼夹，SpO₂ 将传感器贴附于动物的面颊，并连接呼气末二氧化碳（ETCO₂）监测₂ 将导管连接至气管插管，并将温度探头经鼻孔插入鼻咽部。
3. 准备手术区域。剃除左侧前胸毛发，使用氯己定酒精溶液进行皮肤消毒，然后覆盖无菌手术单。
4. 在第四肋间隙水平做一条10厘米长的皮肤及皮下切口。
5. 通过确定胸廓入口并向下数取肋间隙来确认正确的肋间隙位置。随后，沿第四肋间隙的中央继续延长切口。
6. 分离肋间肌，打开胸腔，使用小型Finochietto式胸腔牵开器撑开肋骨。进行开胸术时，应注意避免损伤切口胸骨边缘处的左乳内动脉（LIMA）以及上缘处的肺组织。
7. 进行基线心外膜超声心动图检查，以评估双心室功能和瓣膜功能。由于小切口开胸术主要针对三尖瓣（TV）、左右心室功能及肺动脉血流，因此可能出现非标准切面。
8. 在切口的胸骨边缘识别左内乳动脉（LIMA），清除其周围的邻近组织，并准备建立动脉通路以进行压力监测。
9. 在动脉上放置两根4-0丝线缝合线，分别位于插管部位的近端和远端（用于固定动脉导管）。
10. 使用钛夹和施夹器在预期插管部位的远端夹闭左乳内动脉（LIMA），以防止插管过程中发生逆流出血。
11. 使用11号刀片在左乳内动脉（LIMA）上做一个垂直切口，切口长度为导管周长的一半。
12. 插入18 G套管针，并将其连接至动脉压监测模块。当压力达到约120/80 mmHg时，使用先前放置的两根4-0丝线缝合固定套管针。
13. 从肺动脉窦水平开始，沿主肺动脉（MPA）向外侧延伸4-5 cm，进行心包切开术，注意避免损伤左膈神经。
14. 在切开的心包膜上缝合四到五针牵引线，以形成心包井，这有助于暴露和分离肺动脉干与主动脉之间的区域。
15. 使用钝性直角镊从升主动脉（AA）起始处约2-3 cm位置分离主肺动脉（MPA）， 从左心耳水平开始，向升主动脉方向分离。为完全游离主肺动脉与升主动脉，可使用电凝或剪刀去除两者之间的结缔组织。
16. 用钝头直角钳将脐带绕在主肺动脉（MPA）上。在主肺动脉窦远端1 cm处放置一根5-0单丝缝合线作为荷包缝合，以建立主肺动脉压力监测通路。
17. 插入20 G套管针，并连接至监测导管。在收紧脐带线之前，确保获得准确的主肺动脉（MPA）和动脉导管读数；动脉压和肺动脉压可能有所差异，但应与人类患者的数值相当。
18. 握住脐带的两端，将它们夹在一起以减小主肺动脉（MPA）的管腔。
19. 逐步使用施夹器连续施加夹子，每个夹子置于前一个夹子下方，直至系统血压开始持续下降（图2此时，移除最后放置的夹子以稳定全身血压。
20. 当达到最大程度的缩窄且血流动力学稳定后，使用5-0单丝缝线将脐带结扎线固定于主肺动脉（MPA）的外膜，以防止远端移位。
21. 进行绑扎后超声心动图检查以评估双心室功能和瓣膜功能，步骤同2.7。移除主肺动脉压力监测导管和动脉导管，检查绑扎部位及动脉导管置入区域是否有出血，确保止血良好。
22. 将胸管置入左侧胸腔，进管位置为初始切口下方一个肋间隙。使用两根2号薇乔线（Vicryl）缝合肋骨。 缝合，并采用三层连续缝合关闭切口：肌肉层和皮下组织使用Vicryl 2-0缝线，皮肤使用Prolene 3-0缝线。
23. 当未见出血征象时，在脱离呼吸机前拔除胸腔引流管。
24. 将动物脱离呼吸机，拔除气管插管，转移至单独笼具中，并密切观察至少1小时。保留中心静脉导管原位，用颈部松散包扎的敷料固定。
    注意： 术后静脉镇痛维持使用丁丙诺啡（0.05 mg/kg）和氟尼辛（1.2 mg/kg），持续3天 术后第几天 

结果

在完成模型建立的实验方案（约8周）后，将动物重新送回手术室，接受胸骨正中切开术，并在心外膜和心内结构上植入声学测微晶体。该手术采用体外循环并在心脏跳动状态下进行，同时控制上下腔静脉，具体操作步骤此前已由本研究团队详细描述⁹。所有动物均顺利脱离体外循环，并在稳定的稳态血流动力学环境中成功获取了声学测微数据。

肺动脉束带术使收缩期肺动脉压（SPAP）从21 ± 2 mmHg急性升高至62 ± 9 mmHg（p = 0.001）。在随访期间，3只动物因卒中、出血和急性心力衰竭死亡。在存活的17只动物中，3只出现轻度三尖瓣反流（TR），3只出现中度TR，11只出现重度TR。随访结束后，TR平均分级（0–4级；0 = 无或极微量，1 = 轻度，2 = 中度，3 = 中重度，4 = 重度）从0.8 ± 0.4升高至3.2 ± 1.2（p = 0.0001）。表1中所示数据表明，在肺动脉束带术后8周出现了右心室功能衰竭的征象以及显著的三尖瓣反流，这与

讨论

在该模型中，通过8周的肺动脉束带缩窄，成功建立了稳定的慢性绵羊右心室功能障碍模型，并且在大多数情况下出现了显著的三尖瓣反流（FTR）。本研究所展示的慢性肺动脉束带（PAB）模型的优点包括术中可精确调节后负荷，尽管其对右心室（RV）反应的影响可能有所不同。该模型适用于评估不同程度的右心室衰竭或三尖瓣反流，其严重程度可通过肺动脉缩窄的程度进行调控。此外，与肺动脉高压模型不同，该模型在主肺动脉水平施加了固定且稳定的阻力，从而排除了肺血管床变化对后负荷的干扰¹¹。已有研究表明，通过肺动脉栓塞建立的绵羊肺动脉高压模型难以可预测地诱导右心室衰竭（RVF）¹⁴。然而，要充分收紧束带以达到预期程度（表型）的右心衰竭可能具有挑战性¹⁵，更不用说精确控制三尖瓣反流的分级。这一点在本研究中有所体现：所有动物均达到了相似的肺动脉峰值压力（62 ± 9 mmHg），但该压力值与三尖瓣反流或右心衰竭（RHF）均无相关性。这可能提示，在后负荷增加的情况下，应变右心室的重构反应存在生物学变异性。尽管如此，在大多数情况下，显著的...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Drager Narkomed MRI-2 麻醉机	Drager	4116091-001
血管导管	BD	BD382268	14GA×8.25cm
BD ChloraPrep 擦拭器 青绿色 26 ml 带无菌溶液的涂抹器
11号刀片	Bard-Parker	371111
布托啡诺	HIKMA
头孢唑林 1.0g	Hikma	0143-9924-90
丙泊酚 200mg/20ml	63323-0269-29	FRESENIUS KABI
Valleylab Force FX 电外科发生器	Valleylab	CF5L44233A
硫酸庆大霉素 40 mg/mL	Fresenius	406365
i-Stat 血气分析仪 MN 300	Abbott
盐酸利多卡因 1%	Pfizer	243243
Horizon Medium 开放式结扎夹施夹器	Teleflex	237061
PERMAHAND 丝线缝合线	PERMA HAND	SA 63H
Pinnacle 导引鞘	Terrumo	RSS102	鞘长度 10cm
普理灵 3-0	ETHICON	8684H
中号钛夹	Teleflex	2200
脐带绳	Ethicon	EFA 1165
VICRYL 2 薇乔缝线 未染色 涂层 1×54" TP-1	ETHICON	J 880T
薇乔缝线 2-0	ETHICON	J269H