使用微透析系统在清醒大鼠中实时动态采集海马区细胞外液

摘要

本方案通过微透析系统，对清醒大鼠海马区细胞外液进行详细的实时动态取样。

摘要

多种中枢神经系统（CNS）疾病与海马区细胞外液（HECF）成分的变化相关。然而，长期以来，难以实时获取清醒大鼠的HECF，限制了对CNS疾病进展及民族医学疗法有效性的评估。值得鼓舞的是，脑部微透析技术可用于连续取样，具有动态观察、定量分析和取样量小等优势，从而实现对活体动物脑内传统草药及其代谢产物在细胞外液中含量变化的监测。因此，本研究旨在利用三维脑立体定位仪，将脑脊液微透析探针精确植入Sprague Dawley（SD）大鼠的海马区，并截留分子量大于20 kDa的物质。随后，通过可调节采样速率为2.87 nL/min至2.98 mL/min的微透析采样控制系统，从清醒大鼠中获取高质量的HECF。综上所述，本实验方案结合微透析技术，为在清醒大鼠中高效、快速、动态地获取HECF提供了一种可行方法，为我们进一步探索CNS相关疾病的发病机制及评估药物疗效提供了广阔的可能性。

引言

中枢神经系统（CNS）疾病具有较高的发病率，例如神经退行性疾病、创伤性脑损伤、高原缺氧引起的脑损伤以及缺血性脑卒中，是全球死亡率上升的重要原因^1,2,3。对特定脑区细胞因子和蛋白质变化进行实时监测，有助于提高中枢神经系统疾病的诊断准确性，并推动用药后脑部药代动力学的研究。传统的科学研究通常采用脑组织匀浆或手动采集动物脑间质液的方法，用于检测特定物质及开展药代动力学研究。然而，这些方法存在一些局限性，如样本量有限、无法动态观察指标变化以及采样质量不均等^4,5,6。脑脊液是一种间质液，可保护脑和脊髓免受机械性损伤。由于血脑屏障（BBB）的存在，其成分与血清不同⁷。直接分析脑脊液样本更有利于揭示中枢神经系统病变的机制并促进药物研发。然而，通过注射器直接从小脑延髓池或脑室手动获取的脑脊液样本不可避免地存在血液污染、采样随机性强、样本量不确定以及几乎无法多次重复采集等缺点^8,9。更为显著的是，传统的脑间质液采样方法无法从受损脑区获取样本，这阻碍了对特定脑区中枢神经系统疾病发病机制的探索以及靶向民族药物疗法疗效的评估^9,10。

脑部微透析是一种用于在清醒动物中采集脑组织间液的技术¹¹。该微透析系统通过植入脑内的探针模拟血管通透性。微透析探针配备有半透膜，并可植入特定脑区。在使用等渗人工脑脊液（ACSF）灌注后，可有效收集透析后的脑组织间液，具有采样量小、可连续采样以及实现动态观察等优势^12,13。从位置角度来看，脑微透析探针可选择性地植入感兴趣的脑结构或颅内池中¹⁴。若观察到海马区细胞外液（HECF）中内源性物质水平异常，提示可能存在中枢神经系统疾病或揭示疾病的发病机制。多项研究表明，中枢神经系统疾病的生物标志物，如精神分裂症中的D-氨基酸、阿尔茨海默病中的β-淀粉样蛋白和tau蛋白、创伤性脑损伤中的神经丝轻链以及缺氧缺血性脑病中的泛素羧基末端水解酶L1，均可在脑脊液中进行分析^15,16,17。基于脑微透析采样技术的化学分析方法可用于监测外源性化合物（如民族药物中的活性成分）在特定脑区的扩散与分布过程中的动态变化¹⁴。

本文介绍了在清醒大鼠中动态采集 HECF 的具体过程，并测量其渗透压以确保样本质量。

方案

实验方案严格遵循成都中医药大学实验动物使用与动物护理和使用委员会的要求进行（记录编号：2021-11）。本研究选用雄性Sprague Dawley（SD）大鼠（体重280 ± 20 g，6-8周龄）。

1. 脑部微透析探针植入手术

1. 使用动物麻醉系统，在0.6 L/min的空气-氧气混合气体中，分别采用3%和1.5%的异氟烷进行大鼠麻醉诱导和维持。确保大鼠深度麻醉，无痛觉反射和角膜反射。麻醉期间使用兽用眼膏涂抹眼睛，防止角膜干燥。
2. 在准备区域使用电动剃须刀去除麻醉大鼠颅骨部位的毛发。随后将麻醉后的大鼠固定于立体定位脑部定位仪上。术前使用无菌棉球蘸取聚维酮碘和乙醇，对手术区域进行三次消毒。涂抹 局部镇痛用布比卡因表面给药。 注意：基于微透析的脑外液样本采集全过程如图所示。 图1.
3. 使用手术剪在颅面正中做一条1.5 cm的切口，并用手术剪和眼科镊去除骨膜。
4. 以颅骨前囟为基准位置，使用颅骨钻在前后位（AP）-2 mm、内外侧位（ML）-3.5 mm 和背腹位（DV）-3.5 mm 处（海马 CA1 区）穿透颅骨内板，钻出一个直径为 2 mm 的孔洞。
5. 将导管针芯固定在立体定位仪夹持器上，调整微透析套管在前后向（AP，-2 mm）、内外向（ML，-3.5 mm）和背腹向（DV，0 mm）的位置。调节脑立体定位仪的背腹向（DV）数值，将微透析套管植入CA1区，深度为3.5 mm。
   注意：使用动物体温维持仪在手术过程中将动物体温保持在 37 °C。
6. 用直径为2 mm的钻头再钻三个孔，使这三个孔与探针孔共同构成一个三角形，且探针孔位于三角形中心。将螺钉植入各孔中，深度为1 mm。
7. 用牙科水泥固定探针导管，并使用4-0外科缝线缝合皮肤。参见 图2 用于探针的放置。
8. 将大鼠置于笼中恢复7天。术后每日局部浸润布比卡因（1.5 mg/kg）一次。 提供食物和水 随意术后每日使用3次透明质酸钠滴眼液，以防止眼睛干涩。
   ​注意：所有操作均须在无菌手术室内进行。动物在恢复足够意识、能够在37 °C条件下维持胸卧位之前，不得无人看管。动物术后须完全恢复后方可与其他动物同笼饲养。

2. 微透析系统连接与探针检查

1. 根据制造商的说明，连接微透析泵、微量注射器、清醒动物活动装置和低温样本收集器。将装有人工脑脊液（ACSF）的微量注射器安装到微透析泵上，并将泵的流速设置为 1 µL/min，以排出管路中的空气。
2. 连接管路与脑部微透析探针（膜材料：聚醚砜（PAES）；膜长度：4 mm；膜外径：0.5 mm；截留分子量：20 kDa；探针杆长度：14 mm）。以 1 µL/min 的流速运行微透析泵，将 ACSF 注入探针，直至探针表面略微湿润。随后将探针浸入肝素钠注射液中备用。
   ​注意：若肉眼观察到在重力作用下有大量 ACSF 从探针的半透膜处滴落，则应更换新的探针。

3. 从清醒大鼠收集 HECF

1. 将脑部微透析探针插入探针套管中，并将大鼠置于一个带有软垫的圆形容器内（高度：360 mm；直径：400 mm），确保大鼠可自由活动。
2. 连接管道、微量注射泵和脑部微透析探针。固定大鼠 通过 大鼠固定装置顶部的孔和不锈钢旋转接头
3. 打开多通道旋转控制器，以避免大鼠自由活动时微透析管路缠绕。启动微量注射泵，以1 µL/min的流速泵入ACSF。在微透析脑外液（HECF）采集系统平衡60 min后，定期收集HECF。
4. 确保冷藏式组分收集器中HECF样品的流速与ACSF灌注流速一致。收集20 µL HECF后，自动切换至下一个采样管。插入探针时，注意检查探针膜是否受损。

4. HECF 渗透压的测定

1. 打开渗透压仪并登录检测系统。在触摸屏上点击Cal按钮，然后在页面上点击Res按钮，以清除之前的校准记忆。
2. 在测量头上安装一个含有100 µL无气泡纯水的1.5 mL离心管。将测量头拉至冷肼容器底部。
3. 在触摸屏上输入样品编号0并确认开始测试。迅速将探针浸入样品管中，然后快速取出，以在-6.2 °C的温度下诱导样品结晶。
4. 等待屏幕显示：将测量头向上推起，然后依次点击Cal和Cal 0进行校准。使用300 mOsm校准溶液进行测量，并按照上述方法测定HECF样品的渗透压。
   ​注意：校准或测量后，用柔软的纸巾擦拭测量头。HECF样品应充分混匀且无气泡。

5. 采样后微透析系统的维护与设备保养

1. 采样结束后，将脑部微透析探针从探针套管中取出。将探针浸入去离子水中，并用去离子水冲洗12小时，以清除管路和探针上的残留盐分沉积物。
2. 将探针取出后置于4 °C的0.05%胰蛋白酶溶液中。将管路在25 °C的空气干燥箱中干燥，并于室温下保存。
   ​注意：微透析探针价格昂贵，此步骤可提高探针的重复使用率。附着在探针表面的蛋白质可被胰蛋白酶溶液消化，从而防止蛋白质堵塞探针膜，且胰蛋白酶对探针材料无影响。

6. 采样后动物处理

1. 采样后，根据动物伦理要求，先让大鼠吸入1.5%异氟烷使其无痛安乐死，随后给予5%异氟烷过量暴露。

结果

按照上述实验方案以及表1中设定的采样参数，以设定的采样速率获得了类似水样、无色且透明的大鼠HECF（图1K）。所获得的大鼠HECF渗透压为290–310 mOsm/L，可间接保证样品的质量^18,19。

讨论

中枢神经系统疾病的发病机制尚未完全阐明，这阻碍了新疗法和药物的开发。研究表明，大多数中枢神经系统疾病与海马病变密切相关^20,21,22。所提出的脑部微透析技术能够靶向特定脑区，尤其是海马区，从而区别于传统的脑脊液采集方法。通过植入手术将探针置入大鼠脑的CA1区，利用人工膜的被动扩散作用分离特定分子量的物质。探针植入是关键步骤，若探针本身受损，或脑组织出现局部损伤（如蛋白质聚集物²³），可能由探针植入引起，将导致实验失败或测量结果准确性下降。因此，必须检查探针的完整性，并在微透析探针植入手术后给予动物适当的恢复期。

近年来，使用民族医学治疗脑部疾病的研究日益增多^24,25。传统获取脑脊液和脑组织间液的方法多为一次性操作，且血液污染概率较...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
鼓风干燥箱	苏州大电子设备有限公司	GHG-9240A
动物麻醉系统	瑞沃德生命科技有限公司	R500IE
动物体温维持仪	瑞沃德生命科技有限公司	69020
人工脑脊液	北京雷根生物科技有限公司	CZ0522
脑部微透析探针	CMA Microdialysis AB	T56518
导管	CMA Microdialysis AB	T56518
动物自由活动输注背心	Instech Laboratories, Inc.	CIH95
义齿基托树脂	上海二医张江生物材料有限公司	190732
电动颅骨钻	瑞沃德生命科技有限公司	78001
电动剃毛器	瑞沃德生命科技有限公司	CP-5200
动物自由活动箱	CMA Microdialysis AB	CMA120
肝素钠注射液	成都海通制药有限公司	H51021208
碘伏	四川乐康制药辅料有限公司	202201
异氟烷	瑞沃德生命科技有限公司	R510-22
微透析导管针芯	CMA Microdialysis AB	8011205
微透析收集管	CMA Microdialysis AB	7431100
微透析收集器	CMA Microdialysis AB	CMA4004
微透析FEP管路	CMA Microdialysis AB	3409501
微透析体外支架	CMA Microdialysis AB	CMA130
微透析微量注射泵	CMA Microdialysis AB	788130
微透析注射器（1.0 mL）	CMA Microdialysis AB	8309020
微透析管路连接头	CMA Microdialysis AB	3409500
不可吸收外科缝线	上海天勤生物材料有限公司	S19004
眼科镊	瑞沃德生命科技有限公司	F12016-15
渗透压仪	Löser	OM 807
玻璃酸钠滴眼液	URSAPHARM Arzneimittel GmbH	H20150150
立体定位仪	瑞沃德生命科技有限公司	68025
手术剪	瑞沃德生命科技有限公司	S14014-15
手术剪	上海秉誉流体技术有限公司	BY-103
注射器针头	CMA Microdialysis AB	T56518
胰蛋白酶溶液	Boster 生物技术有限公司	PYG0107
超声波清洗机	广东高特超声有限公司	KMH1-240W8101