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方法文章

从大鼠心脏动态连续采血 通过 无创微透析技术

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DOI：

10.3791/64531

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2022年9月13日

 ,  ,  ,  ,  , 
1School of Pharmacy, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 2Research Institute of Integrated TCM & Western Medicine, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 3School of Ethnic Medicine, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 4Innovative Institute of Chinese Medicine and Pharmacy, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine

本文内容

摘要

本方案描述了一种利用微透析技术实时、动态采集大鼠心脏血液的简单高效方法。

摘要

血液成分的动态分析对于理解心血管疾病及其相关疾病（如心肌梗死、心律失常、动脉粥样硬化、心源性肺水肿、肺栓塞和脑栓塞）具有重要意义。同时，迫切需要突破在活体大鼠中持续采集心脏血液的技术，以评估不同民族医学疗法的有效性。本研究中，通过精确且无创的手术操作，将血液微透析探针植入大鼠右颈静脉。随后，通过连接在线微透析样本采集系统，以2.87 nL/min至2.98 mL/min的速率采集心脏血液样本。更为重要的是，所获得的血液样本可暂时储存在4 °C的微透析容器中。基于微透析的在线连续血液采集程序从大鼠心脏实现了高质量血液样本的获取，显著提升了系统性心血管疾病研究的科学合理性，并从血液学角度推动了民族医学疗法的评估。

引言

随着生活节奏的加快和心理压力的增加，心血管疾病（CVDs）在青、中、老年人群中的发病率呈上升趋势1,2。心血管疾病的发病率和死亡率较高，具有起病急、进展快、病程长等特点，严重威胁患者的生命安全3。心血管疾病的发生可能与某些血液成分的变化密切相关，例如胆固醇、血清脂质、血糖、心肌酶和蛋白激酶K等4,5,6。通过分析常规血液检测项目，可最快掌握患者的有关情况。因此，血液样本的质量直接决定了检测结果的准确性。然而，传统的采血方法存在一些不可避免的缺陷，严重影响实验结果，例如创伤面积大、采血量少、对操作人员技术要求高、无法实时反映药物变化、血液样本前处理繁琐、实验动物消耗量大，以及难以满足动物伦理要求等7,8,9。随着医学技术的不断进步，对采血质量也提出了更高的要求。因此，亟需开发一种新型的采血技术，以克服上述缺点。

微透析是一种基于透析原理的体内取样技术10。在非平衡条件下，待测化合物依据浓度梯度从组织中扩散并透过植入组织内的微透析探针进入透析液，透析液被持续引出，从而实现对活体组织的取样11,12。与传统取样方法相比，微透析技术在以下几个方面具有显著优势13,14,15：可连续实时追踪血液中各种化合物的变化；取样无需繁琐的前处理，能够真实反映取样部位目标化合物的浓度；探针可植入体内不同部位，用于研究目标化合物的吸收、分布、代谢、排泄及毒性；所获得的样品不含生物大分子（>20 kD）。因此，更高品质的血液样本有助于更准确地阐释心血管疾病（CVDs）及其民族药物治疗机制。

微透析采样系统通常由微型注射泵、连接管、动物自由活动装置、微透析探针和样品收集器组成16。作为微透析系统装置中最关键的部分，常见的微透析探针包括同心圆探针、柔性探针、线性探针和分流探针17。其中，柔性探针是一种柔软且非金属的探针，主要用于从清醒或麻醉状态下自由活动动物的心脏、肌肉、皮肤和脂肪等血管及外周组织中采集样品13。当探针与血管或组织接触时可灵活弯曲，从而避免对探针或采样部位造成不可逆损伤。随着探针技术的不断发展，微透析技术在各个领域的应用也日益深入。本文通过专为血液采集设计的柔性探针，利用无创微透析技术实现了对大鼠心脏血液的动态连续获取。

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方案

动物实验方案已获得成都中医药大学行政委员会批准（记录编号：2021-11）。选用特定病原体阴性（SPF级）雄性Sprague Dawley（SD）大鼠（8–10周龄，260–300 g），饲养于独立通风笼具中，实验室环境维持在22 °C、相对湿度65%，用于本研究。实验动物购自商业来源（见材料表）。所有大鼠在实验前适应性喂养1周，期间自由饮水和进食。

1. 实验准备

  1. 按照图1所示，组装用于血液微透析取样的设备（参见材料表）。
  2. 配制含3.50 mmol/L柠檬酸、7.50 mmol/L枸橼酸钠和13.60 mmol/L葡萄糖的抗凝剂枸橼酸右旋葡萄糖溶液（ACDs），作为微透析血液采集的灌流液（参见材料表）。
  3. 使用前，用0.22 µm膜过滤装置过滤ACDs，并通过超声去除气泡。将ACDs保持在37 °C，以减少对SD大鼠的刺激。

2. 微透析管道系统的通畅性检查

  1. 将透析装置探针的入口端与注射器针头、管路连接器以及FEP管路（参见材料表）连接。
    注意：微透析探针的蓝色端为液体流入端，透明端为液体流出端。
  2. 以2 µL/min的流速向管路系统灌注ACDs18，检测微透析管路系统的通畅性。
    ​注意：若在样品收集端有ACDs流出，则表明微透析系统通畅，可用于后续心脏血液采集；若无液体流出，需检查血液探针是否存在破裂或泄漏，或管路连接处是否密封不严。

3. 微透析探针植入

  1. 用空气-氧气混合气体（0.6 L/min）中的 2% 异氟烷麻醉大鼠，将完全失去意识的大鼠固定在手术台上，并使用动物体温维持仪（参见材料表）保持体温在 37 °C。
  2. 用电剃刀去除颈部毛发，并用聚维酮碘和 70% 酒精交替消毒手术部位三遍。向大鼠注射布比卡因（1.5 mg/kg）。通过沿颈部中线做 1.5 cm 切口，钝性分离软组织及血管周围筋膜，暴露右侧颈静脉。
    注意：实验中使用的所有外科器械和工具均应预先通过高压灭菌法进行消毒。使用无菌手套和手术巾。整个实验操作应在无菌环境中进行。遵循当地关于麻醉和镇痛方案的动物使用指南。
  3. 在右侧颈静脉靠近心脏端近心侧，使用 4-0 外科缝线打一个可拆卸的滑结，以暂时阻断血流，并在靠近心脏处的右侧颈静脉上做 1.5 cm 切口。
  4. 将针状导管芯（长度 25 mm，直径 0.7 mm，参见材料表）插入右侧颈静脉，朝向大鼠心脏近心端，将血液微透析探针（总探针长度 24 mm，膜长 10 mm）置入导管中，并用眼科镊子沿导管芯的斜切口方向植入探针19。
  5. 移除引导用导管芯，使探针的半透膜（膜长 10 mm，膜直径 0.5 mm）完全浸入右侧颈静脉中。解开远心端的可拆卸滑结，恢复右侧颈静脉的血流。
  6. 用 4-0 外科缝线将探针与右侧颈静脉结扎固定，并将探针尾管经皮下从颈背部引出。具体探针植入步骤见图 2。
    ​注意：本研究所用血液微透析探针的分子截留量为 >20 kD。所采集的血液样本中含有分子量小于 20 kD 的物质。

4. 微透析取样

  1. 微透析探针植入一周后，从手术创伤中恢复的大鼠进行微透析取样。将清醒的大鼠放入自由活动箱（见材料表）中，并将探针连接至微透析系统。以2 µL/min的流速灌注ACD溶液，持续1小时，使探针透析膜达到平衡。
  2. 以2 µL/min的流速收集微透析血液样本，并暂时保存于4 °C的分段收集容器中。
    ​注意：所获得的血液样本可直接在室温下以20,000 x g 离心10分钟进行检测，或保存于-80 °C以备后续检测。在收集样本过程中，务必持续观察是否存在探针脱出和/或泄漏现象。

5. 采样后操作

  1. 使用2%异氟烷与空气-氧气混合气体（流速0.6 L/min）对SD大鼠进行麻醉。
  2. 解剖以确认探针位于右颈静脉内。将微透析探针从右颈静脉中取出，并放入超纯水中。
  3. 最后，通过吸入5%异氟烷对大鼠实施安乐死。
  4. 将探针连接至管路，用超纯水以2 µL/min的流速冲洗过夜，以彻底清除管路和探针中的残留盐分。
  5. 取出探针并浸泡于超纯水中，于4 °C保存，防止探针透析膜收缩。
    注意：若透析液体积与灌注液体积不一致，可能是探针被凝固血液堵塞。可将探针置于胰蛋白酶溶液中，直至探针膜尖端可见物质脱落。

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结果

本方案允许根据微透析设备设定的采样参数，从清醒大鼠获取心脏血液。正常血液样本应呈鲜红色，而缺氧、可能存在血凝块或贫血疾病的动物血液可能呈深紫色或暗红色。通过血液微透析技术获得的样本无色、澄清且透明，可用于采用高效液相色谱法或质谱法分析不同疾病的血清标志物以及药物及其代谢物在血液中的分布情况。所设定的参数及单次采集的血液体积见表1。

用于血液微透析探针的麻醉设备和手术器械设置；包括操作台和管路。
图1血液微透析所需的设备和仪器。 (A动物麻醉系统。B) 外科手术器械。

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讨论

心血管疾病是临床上常见的慢性疾病，在中国发病率呈逐渐上升趋势，且发病年龄趋于年轻化，引起大多数患者的担忧与恐慌20,21心血管疾病是全球首要的死亡原因，可引发脑梗死及其他高死亡率疾病，严重威胁患者的生命健康。22心血管疾病（CVD）包括缺血性心脏病、心肌病、动脉粥样硬化、高血压、中风和心力衰竭，当供应心脏的动脉变窄或硬化时发生23,24尽管已有多种方法可用于诊断心血管疾病（CVDs），血液检测仍然是最方便且最快的方法。准确、灵敏且快速地检测与心血管疾病相关的早期标志物，有助于迅速诊断并了解疾病的病理生理状态。因此，随着心血管疾病患者诊断需求的不断增加，有必要采集高质量且具有代表性的血液样本。25动物实验中常用的采血方法包括断尾法、尾静脉采血、内眦静脉采血、腹主动脉采血、舌下静脉采血、颈动脉-静脉采血、断头法、注...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作由国家自然科学基金（82104533）、中国博士后科学基金（2020M683273）和科学技术 & 中国四川省科技厅（2021YJ0175）以及重点研发计划&四川省科技计划项目 #38;D（2022YFS0438）。同时，作者谨向TRI-ANGELS公司的高级设备工程师洪云成先生表示感谢&H TRADING PTE. LTD.（新加坡市，新加坡），提供微透析技术相关的技术服务。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
动物麻醉系统Rayward Life Technology Co., LtdR500IE
动物体温维持仪Rayward Life Technology Co., Ltd69020
血液微透析探针 CMA Microdialysis ABT55347
导管 CMA Microdialysis ABT55347
柠檬酸盐Merck Chemical Technology (Shanghai) Co., Ltd251275
电动剃毛器Rayward Life Technology Co., LtdCP-5200
Fep 管路 CMA Microdialysis AB3409501
动物自由活动装置 CMA Microdialysis ABCMA120
葡萄糖Merck Chemical Technology (Shanghai) Co., LtdG8270
止血钳Rayward Life Technology Co., LtdF21020-16
异氟烷Rayward Life Technology Co., LtdR510-22
显微剪刀Beyotime Biotechnology Co., LtdFS221
微透析收集管 CMA Microdialysis AB7431100
微透析收集器 CMA Microdialysis ABCMA4004
微透析体外支架 CMA Microdialysis ABCMA130
微透析微量注射泵 CMA Microdialysis AB788130
微透析注射器（1.0 mL） CMA Microdialysis AB8309020
微透析管路连接头 CMA Microdialysis AB3409500
微孔滤膜Merck Millipore Ltd.R0DB36622
不可吸收外科缝合线上海天勤生物材料有限公司S19004
手术台玉研科学仪器有限公司30153
眼科镊Rayward Life Technology Co., LtdF12016-15
柠檬酸钠Merck Chemical Technology (Shanghai) Co., Ltd1613859
Sprague Dawley  (SD) 大鼠成都达硕实验动物有限公司SYXK(figure-materials-1)2019-049
手术剪刀Rayward Life Technology Co., LtdS14014-15
手术剪刀上海炳宇流体技术有限公司BY-103
注射器针头 CMA Microdialysis ABT55347
超声波清洗机广东高特超声有限公司KMH1-240W8101

参考文献

  1. van Rensburg, W. J. J. Post-mortem evidence of a diverse distribution pattern of atherosclerosis in the South African population. Scientific Reports. 12 (1), 11366(2022).
  2. Katz, A. J., Chen, R. C., Usinger, D. S., Danus, S. M., Zullig, L. L. Cardiovascular disease prevention and management of pre-existent cardiovascular disease in a cohort of prostate cancer survivors. Journal of Cancer Survivorship. , (2022).
  3. Rødevand, L., Tesli, M., Andreassen, O. A. Cardiovascular disease risk in people with severe mental disorders: an update and call for action. Current Opinion in Psychiatry. 35 (4), 277-284 (2022).
  4. Izumi, Y., et al. Impact of circulating cathepsin K on the coronary calcification and the clinical outcome in chronic kidney disease patients. Heart and Vessels. 31 (1), 6-14 (2016).
  5. Wang, K., et al. Whey protein hydrolysate alleviated atherosclerosis and hepatic steatosis by regulating lipid metabolism in apoE-/- mice fed a Western diet. Food Research International. 157, 111419(2022).
  6. Angelone, T., Rocca, C., Pasqua, T. Nesfatin-1 in cardiovascular orchestration: From bench to bedside. Pharmacological Research. 156, 104766(2020).
  7. Bernardi, P. M., Barreto, F., Dalla Costa, T. Application of a LC-MS/MS method for evaluating lung penetration of tobramycin in rats by microdialysis. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 134, 340-345 (2017).
  8. Anderzhanova, E., Wotjak, C. T. Brain microdialysis and its applications in experimental neurochemistry. Cell and Tissue Research. 354 (1), 27-39 (2013).
  9. Joukhadar, C., Müller, M. Microdialysis: current applications in clinical pharmacokinetic studies and its potential role in the future. Clinical Pharmacokinetics. 44 (9), 895-913 (2005).
  10. Stangler, L. A., et al. Microdialysis and microperfusion electrodes in neurologic disease monitoring. Fluids and Barriers of the CNS. 18 (1), 52(2021).
  11. Young, B., et al. Cerebral microdialysis. Critical Care Nursing Clinics of North America. 28 (1), 109-124 (2016).
  12. O'Connell, M. T., Krejci, J. Microdialysis techniques and microdialysis-based patient-near diagnostics. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 414 (10), 3165-3175 (2022).
  13. Hammarlund-Udenaes, M. Microdialysis as an important technique in systems pharmacology-a historical and methodological review. The AAPS Journal. 19 (5), 1294-1303 (2017).
  14. Stahl, M., Bouw, R., Jackson, A., Pay, V. Human microdialysis. Current Pharmaceutical Biotechnology. 3 (2), 165-178 (2002).
  15. Pierce, C. F., Kwasnicki, A., Lakka, S. S., Engelhard, H. H. Cerebral microdialysis as a tool for assessing the delivery of chemotherapy in brain tumor patients. World Neurosurgery. 145, 187-196 (2021).
  16. Sørensen, M., Jacobsen, S., Petersen, L. Microdialysis in equine research: a review of clinical and experimental findings. Veterinary Journal. 197 (3), 553-559 (2013).
  17. Dmitrieva, N., Rodríguez-Malaver, A. J., Pérez, J., Hernández, L. Differential release of neurotransmitters from superficial and deep layers of the dorsal horn in response to acute noxious stimulation and inflammation of the rat paw. European Journal of Pain. 8 (3), 245-252 (2004).
  18. Li, T., et al. Microdialysis sampling and HPLC-MS/MS quantification of sinomenine, ligustrazine, gabapentin, paracetamol, pregabalin and amitriptyline in rat blood and brain extracellular fluid. Acta Pharmaceutica Sinica. 55 (9), 2198-2206 (2020).
  19. Chauzy, A., Lamarche, I., Adier, C., Couet, W., Marchand, S. Microdialysis study of Aztreonam-Avibactam distribution in peritoneal fluid and muscle of rats with or without experimental peritonitis. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 62 (10), 01228(2018).
  20. Fang, X. X., Ardehali, H., Min, J. X., Wang, F. D. The molecular and metabolic landscape of iron and ferroptosis in cardiovascular disease. Nature Reviews. Cardiology. , 1-17 (2022).
  21. Samson, R., Ennezat, P. V., Le Jemtel, T. H., Oparil, S. Cardiovascular disease risk reduction and body mass index. Current Hypertension Reports. , (2022).
  22. Kim, M. H., et al. School racial segregation and long-term cardiovascular health among Black adults in the US: A quasi-experimental study. PLoS Medicine. 19 (6), 1004031(2022).
  23. Qin, Y. H., et al. Role of m6A RNA methylation in cardiovascular disease (Review). International Journal of Molecular Medicine. 46 (6), 1958-1972 (2020).
  24. Xu, C. M., Liu, C. J., Xiong, J. H., Yu, J. Cardiovascular aspects of the (pro)renin receptor: Function and significance. FASEB Journal. 36 (4), 22237(2022).
  25. Guvenc-Bayram, G., Yalcin, M. The intermediary role of the central cyclooxygenase / lipoxygenase enzymes in intracerebroventricular injected nesfatin-1-evoked cardiovascular effects in rats. Neuroscience Letters. 756, 135961(2021).
  26. Ahrens Kress, A. P., Zhang, Y. D., Kaiser-Vry, A. R., Sauer, M. B. A comparison of blood collection techniques in mice and their effects on welfare. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 61 (3), 287-295 (2022).
  27. Joshi, A., Patel, H., Joshi, A., Stagni, G. Pharmacokinetic applications of cutaneous microdialysis: Continuous+intermittent vs continuous-only sampling. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 83, 16-20 (2017).
  28. Reyes-Garcés, N., et al. In vivo brain sampling using a microextraction probe reveals metabolic changes in rodents after deep brain stimulation. Analytical Chemistry. 91 (15), 9875-9884 (2019).
  29. Kho, C. M., Enche Ab Rahim, S. K., Ahmad, Z. A., Abdullah, N. S. A review on microdialysis calibration methods: the theory and current related efforts. Molecular Neurobiology. 54 (5), 3506-3527 (2017).
  30. Zhuang, L. N., et al. Theory and application of microdialysis in pharmacokinetic studies. Current Drug Metabolism. 16 (10), 919-931 (2015).
  31. Zhang, Y. F., Huang, X. X., Zhu, L. X. Metabonomics research strategy based on microdialysis technique. China Journal of Chinese Materia Medica. 45 (1), 214-220 (2020).
  32. Carpenter, K. L., Young, A. M., Hutchinson, P. J. Advanced monitoring in traumatic brain injury: microdialysis. Current Opinion in Critical Care. 23 (2), 103-109 (2017).
  33. Brunner, M., Langer, O. Microdialysis versus other techniques for the clinical assessment of in vivo tissue drug distribution. The AAPS Journal. 8 (2), 263-271 (2006).
  34. Tettey-Amlalo, R. N., Kanfer, I., Skinner, M. F., Benfeldt, E., Verbeeck, R. K. Application of dermal microdialysis for the evaluation of bioequivalence of a ketoprofen topical gel. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 36 (2-3), 219-225 (2009).
  35. Dhanani, J. A., et al. Recovery rates of combination antibiotic therapy using in vitro microdialysis simulating in vivo conditions. Journal of Pharmaceutical Analysis. 8 (6), 407-412 (2018).

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