自发荧光成像评估红藻生理学

摘要

本协议描述了基于光谱分析的红藻中藻胆蛋白变化的分步自发荧光成像和评估。这是一种无标记且无损的方法，用于评估细胞对极端栖息地的适应，当只有稀缺材料可用并且细胞在实验室条件下生长缓慢或根本不生长时。

摘要

红藻（Rhodophyta）含有藻胆蛋白，并在光线昏暗的栖息地定居，但是一些（例如，一些 Chroothece 物种）也可以在充足的阳光下发育。大多数红藻是红色的，但有些可能呈现蓝色，这取决于蓝色和红色胆蛋白（藻蓝蛋白和藻红蛋白）的比例。不同的藻胆蛋白可以捕获不同波长的光并将其传输到叶绿素a，这使得在非常不同的光条件下进行光合作用成为可能。这些色素对光的栖息地变化做出反应，它们的自发荧光可以帮助研究生物过程。以 Chroothece mobilis 为模式生物，在共聚焦显微镜下使用光谱λ扫描模式，在细胞水平上研究了光合色素对不同单色光的适应性，以猜测物种的最佳生长条件。结果表明，即使将所研究的菌株从洞穴中分离出来，它也适应了昏暗和中等光强度。所提出的方法对于研究在实验室条件下生长不慢或生长非常缓慢的光合生物特别有用，这通常是生活在极端栖息地的人的情况。

引言

红藻，如Chroothece属，可以在极端的栖息地生长，在那里它们经常不得不应对明显的^{环境变化1}。在可以找到该属的半干旱地区，洪水和干旱频繁发生，据报道，在小溪，悬崖，洞穴甚至温泉水中都报告了一些物种²。然而，大多数时候，生物变量，如竞争或放牧，将物种降级到非最佳生长条件。由于这些生物通常难以培养，并且在实验室条件下生长或生长非常缓慢，因此一个主要限制是可用的样本量。因此，遵循非破坏性方法或涉及最少样品操作的方法非常重要3^，4。

在这些恶劣环境中生存所需的生理技能可以通过跟踪其光合作用系统的变化来监测。代谢机制、光合作用效率以及对光或培养条件的敏感性可以通过色素荧光发射曲线来揭示，因为它们的能量转移或捕获⁵，⁶，^7，8的准确变化。

细胞化合物的自发荧光可用作细胞诊断的标志物，或作为细胞状态或代谢的自然指标，

方案

藻类物种 Chroothece mobilis 用于本研究。该物种是从西班牙微藻Edaphic SE，MAESE 20.29培养物收集中获得的。该协议的概述如图 1 所示。

图1:研究概述。 在极端栖息地条件下（例如不同的单色光）孵育 Chroothece mobilis2 周。通过使用共聚焦激光扫描显微镜对藻胆体和光系统中含有的蛋白质进行自发荧光来评估对 Chroothece生理学的影响。 请点击此处查看此图的大图。

1. 样品制备

1. 通过将Chroothec....

结果

叶绿素a通常吸收蓝色和红色波长的可见光，而藻胆蛋白使用绿色，黄色和橙色波长⁷。这些色素的自发荧光使得在实验和现场条件下研究藻胆蛋白和叶绿素行为的第一种方法成为可能。

通过比较获得的数据并绘制在不同的图表上，可以区分平均荧光强度（MFI）的显着变化（图4）。对λ扫描轮廓（620、648、660和680 nm）中获得的不同发射峰进行的一项不可告人的统计研究表明，差异显著（统计学意义:*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001）。

当细胞暴露于绿色单色光（GL）时，PE-PCB的MFI显着降低，但在红光（RL）下与对照相比没有差异（图4A）。然而，GL对APC和Chl a具有相反的影响（图4B，C），其中由于天线复.......

讨论

一些单细胞或殖民红藻，如Chroothece，在体外生长缓慢，但含有多种自发荧光化合物，可以通过共聚焦显微镜下的光谱分析进行分析，其中可以检测到色素发射峰的差异。光谱共聚焦荧光显微镜使我们能够进行体内研究，以评估光合生物的适应或适应8，10，17，^18，19，20。大多数其他技术，如蛋白质分析，需要大量的样品，具有破坏性，或者更昂贵。

这里选择了 561 nm 波长，因为它对藻胆蛋白更具选择性（基于之前的报告²³）;它证实了先前使用三种不同激发波长（351、488 和 543 nm）对蓝藻影.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
&-微型培养皿 35 毫米，高玻璃底	Ibidi	81158-24
黑色孔板	Ibidi	82406	用于高通量显微镜的平坦透明底部
藻类培养箱	Panasonic	MLR-352-PE
共聚焦激光扫描显微镜	Leica Microsystems	SP8 TCS-Flask
	Fisher Scientific	15380591	可以在当地的便利店或网上商店购买。
绿色过滤器	PNTA、LEE 过滤器	-	可以在当地便利店或网上商店购买。
HC PL APO 63X/1.30 GLYC CORR CS2	Leica Microsystems	506353	甘油浸没镜头
图像采集软件。LAS X	Leica Microsystems	SP8 TCS
光源	Panasonic	FL40SSENW/37MLR-352-PE
量子光辐射计	DeltaOhm	DO 9721-R
软件	R 核心团队，2020	4.0.2。	-
红色过滤器	PNTA、LEE 过滤器	-	可以在当地便利店或网上商店购买。
SWES 培养基	University of Murcia	-	-
G 型浸没液	Leica Microsystems	11513910	甘油