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方法文章

利用自发荧光成像评估红藻生理状态

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DOI：

10.3791/64533

⸱

2023年2月17日

 ,  , 
1Microscopy Core Facility, Technological Research and Scientific Area (ACTI), University of Murcia, 2Confocal Microscopy and Cellular Imaging Unit, Genetic and Molecular Medicine Department, Pediatric Institute for Rare Diseases, Hospital Sant Joan de Déu, 3Research Institute Sant Joan de Déu, Esplugues de Llobregat, Spain 4Algology Laboratory, Biology Faculty, University of Murcia, 4Algology Laboratory, Biology Faculty, University of Murcia

本文内容

摘要

本实验方案详细描述了基于光谱分析的红藻藻胆蛋白变化的自发荧光成像与评估步骤。该方法无需标记且对样品无损伤，适用于仅能获取少量材料、细胞在实验室条件下生长缓慢或完全无法生长时，对细胞适应极端生境能力的评估。

摘要

红藻（Rhodophyta）含有藻胆蛋白，通常定植于弱光环境中，但某些种类（例如某些 Chroothece 物种）也能在全日照条件下生长。大多数红藻呈红色，但有些会呈现蓝色，这取决于蓝色和红色胆色素蛋白（藻蓝蛋白和藻红蛋白）的比例。不同的藻胆蛋白能够捕获不同波长的光，并将能量传递给叶绿素a，从而使光合作用在差异显著的光照条件下仍可进行。这些色素可响应光照环境的变化，其自发荧光特性有助于研究生物学过程。本研究以 Chroothece mobilis 为模式生物，利用共聚焦显微镜的光谱λ扫描模式，在细胞水平上研究了光合色素对不同单色光的适应性，以推断该物种的最佳生长条件。结果表明，即使所研究的菌株分离自洞穴环境，它仍能适应弱光和中等强度的光照。该方法特别适用于研究在实验室条件下无法生长或生长极为缓慢的光合生物，而这类生物通常生活在极端生境中。

引言

红藻，例如Chroothece属，能够在极端环境中生长，常常需要应对显著的环境变化1。在该属藻类分布的半干旱地区，洪水和干旱频繁发生，一些物种已被报道存在于溪流、悬崖、洞穴甚至温泉中2。然而，大多数情况下，生物因素如种间竞争或摄食作用会使这些物种局限于不适合其生长的次优环境中。由于这些生物通常难以培养，在实验室条件下往往无法生长或生长极为缓慢，因此样本量有限成为主要制约因素。因此，遵循非破坏性方法或仅需最小程度样本操作的方法显得尤为重要3,4。

通过监测光合系统的变化，可以了解生物在这些严酷环境中生存所需的生理能力。由于能量传递或捕获效率的精确变化，色素荧光发射谱能够揭示其代谢机制、光合效率以及对光照或培养条件的敏感性5,6,7,8。

细胞化合物的自发荧光可作为细胞诊断的标志物，或作为细胞状态或代谢的天然指示剂，以响应内外信号并通过发射光的变化来反映9。它也可用于区分分类学上不同的光合生物类群10。根据光合微生物的系统发育位置，可以观察到不同的体内荧光特征。因此，已有数次尝试基于光合生物荧光的体内特性（包括荧光吸收和发射光谱）进行分类学鉴定11,12。由于浮游植物类群中辅助色素的多样性，叶绿素a（Chl a）荧光激发波长的差异或发射光谱的差异可用于推断其分类学归属13。体内荧光激发和发射光谱不仅依赖于藻类的门类，还与光系统的适应性有关14。能量向Chl a传递的效率、Chl a与辅助色素的比例以及细胞内色素含量均对生长条件敏感5。

红藻，尤其是Chroothece，含有多种辅助性荧光色素——藻胆蛋白和类胡萝卜素；其中前者聚集在附着于叶绿体类囊体上的藻胆体中。藻胆蛋白（包括藻蓝蛋白、藻红蛋白和别藻蓝蛋白）能够捕获不同波长的光，并将其传递给叶绿素a，从而使光合作用在差异极大的光照和培养条件下仍可进行15。例如，Chroothece物种可在洞穴内部生长，或几乎出现在微咸的钙质溪流中2。

单色光会影响光合生物的生长和色素组成，已被用于研究如何预防或控制洞穴中光合生物的生长。Mulec 等人研究表明，富红光照明会促进蓝细菌、藻类和植物的生长16。先前的研究还报道，绿光会影响蓝细菌的色素组成17，而其他研究则发现，绿光可抑制大多数光合生物的生长，某些蓝细菌表现出类囊体减少以及平均荧光强度减弱18。

为了了解Chroothece作为模式生物耐受恶劣环境的能力，已将培养的细胞暴露于逐渐增强的光照强度以及单色光（绿色或红色）15，以观察其如何适应洞穴中昏暗的环境（其中以红光为主）。本文所述的实验方案利用Chroothece自身的自发荧光，在细胞水平上重现上述变量对其藻胆蛋白的影响。

如今，荧光技术常被用作研究维管植物、微藻、大型藻类和蓝细菌生理反应的工具13,14,16光谱共聚焦荧光显微镜是一种卓越的工具，用于 体内 在单细胞水平上评估光合作用样本生理学的研究10,17,18,19,20，通过避免实验室中生长速率低以及难以获得足够生物量来进行相关提取和生化方法的问题8细胞在不同培养条件下处理2周后，可测定其lambda扫描谱型 体内. 尽管已有若干出版物采用了共聚焦成像中不同激发波长的方法3,4,10,17，大多数藻胆蛋白和叶绿素a可使用561 nm波长的激发光进行检测，检测到的发射光波长范围为570至760 nm。这些标准基于先前进行的分析10 使用商用纯颜料（表1通过共聚焦成像获得的不同藻类物种中的结果20,21,22.

色素λflmax (nm)λ exc (nm)
351364458476488514543633
Chl a660.9-678.143.4 ± 1.811.2 ± 0.21.8 ± 0.052.0 ± 0.0812.2 ± 0.76.0 ± 0.34.2 ± 0.1680.7 ± 1.5
R-PE569.2-583.35.9 ± 0.65.9 ± 0.1611.1 ± 0.0442.2 ± 0.3100.0 ± 090.0 ± 0.399.2 ± 0.08-
652.1-668.6--1.5 ± 0.013.7 ± 0.0426.7 ± 0.58.7 ± 0.1611.1 ± 0.1611.3 ± 0.2
C-PC636.2-676.42.3 ± 0.041.0 ± 0.010.6 ± 0.0040.7 ± 0.0082.0 ± 0.082.0 ± 0.043.3 ± 0.1633.6 ± 0.9
APC-XL667.3-683.815.1 ± 1.59.6 ± 0.981.0 ± 0.041.2 ± 0.085.9 ± 0.74.1 ± 0.523.2 ± 3.591.4 ± 2.3

表1：用于进行lambda扫描分析的纯色素信息。 本表显示了不同荧光染料/色素在共聚焦成像分光光度法下，针对所有激发波长的发射峰、肩峰/荧光带最大值，以及色素/荧光染料的发光百分比。数值通过以下公式计算得出：= MFI×100/255。每个数值均为均值 ± 标准误（mean ± standard error from the mean）。纯色素用于校准共聚焦扫描激光显微镜，具体如下1,2,10。叶绿素a来源于Spinacia oleracea，R-藻红蛋白（R-PE）来源于Porphyra tenera，C-藻蓝蛋白（C-PE）来源于Spirulina sp.。所有物种均溶解于过滤蒸馏水中。别藻蓝蛋白-XL（APC-XL）来源于Mastigocladus laminosus，用60%硫酸铵和磷酸钾（pH = 7）溶解，配制成38 mM浓度。使用8孔带盖玻底培养皿，每种色素溶液取400 µL（浓度为1 mg/mL）进行扫描。

对单一激发波长的研究是一种非常有用的第一近似方法。然而，在这种情况下，有必要阐明不同复合物在荧光信号中的相对贡献，建议采用在多个波长下进行荧光比值或光谱分析等方法。

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方案

本研究使用了藻类物种 Chroothece mobilis，该物种来源于西班牙东南部土壤微藻培养物保藏中心（Microalgae Edaphic SE Spain, MAESE 20.29）。实验方案的总体流程见图1。

对集胞藻细胞进行单色光测试，CLSM λ 扫描，荧光光谱分析。
图 1：研究概述。 Chroothece mobilis 在不同单色光等极端生境条件下培养 2 周。通过共聚焦激光扫描显微镜检测藻胆体和光系统中蛋白质的自发荧光，评估这些条件对 Chroothece 生理特性的影响。请点击此处查看该图的放大版本。

1. 样品制备

  1. 从保藏的琼脂培养物中取 Chroothece mobilis 接种物，转移至 SWES 液体培养基中（表 2）。
    注：SWES “Seewasser + Erddekokt + Salze” = 海水培养基23。
  2. 将所有培养物在 20 °C、低白光强度（LL：80 µM/m2/s）条件下，以 16:8 光照/黑暗光周期培养 2 周，静置培养，直至达到所需细胞密度（见步骤 1.3）。
    注：生长光照条件为 80 µM/m2/s 的光照强度（光合有效辐射，PAR）。此条件作为低光条件（对照）。SWES 培养基的组成见 表 2。
  3. 在对数生长期进行不同实验的接种，将细胞密度为 5 × 103 个细胞/mL 的培养物接种于 24 孔板中，每孔 1 mL。
    注：使用血球计数板24 进行细胞计数，必要时用 SWES 培养基稀释培养物。

SWES 培养基成分
组分浓度
KNO31.98 mM
K2HPO4115 µM
MgSO481 µM
ZnSO4, 7H2O17 nM
MnSO4, 7H2O45 nM
H3BO3, 4H2O3.1 mM
Co(NO3)217 µM
Na2MoO4, 6H2O21 nM
CuSO4, 2H2O0.1 nM
FeSO4, 5H2O13 µM
EDTA, 7H2O11 µM
维生素 B125 µg
土壤提取物30 mL
过滤的河水455 mL

表2：SWES培养基成分。

2. 模拟极端藻类生境条件：绿色和红色单色光的影响

  1. 取1 mL上述细胞密度的储备培养物（步骤1.2）接种至24孔板的每个孔中。
  2. 将细胞培养物覆盖后培养2周，以重现单色光效应。
    1. 使用绿色滤光片，允许波长为470至570 nm的绿光通过，峰值位于506 nm（根据制造商说明；参见材料表），并将培养物暴露于该光源下25。
    2. 使用红色滤光片，允许波长为590至720 nm的红光通过，峰值位于678 nm（根据制造商说明；参见材料表），并将培养物暴露于该光源下25。
      注：低强度白光（LL：80 µM/m2/s；参见材料表）作为光照强度对照，用于比较所获得的效应。所用光照强度单位为微摩尔每秒每平方米（µmol m-2 s-1），即光合光子通量密度（PPFD）。

3. 自发荧光成像

注意：成像软件（参见材料表）的设置如图2所示。

  1. 开启倒置共聚焦激光扫描显微镜（CLSM；参见材料表）的所有组件，包括激光器。
  2. 将24孔板中每个实验孔的细胞用SWES生长培养基转移至35 mm玻璃底培养皿（参见材料表）中，用于成像。
  3. 选择63x/1.30 NA甘油浸没物镜，并在物镜上滴加甘油（参见材料表）。
  4. 将培养板置于显微镜载物台上，并确保在图像采集过程中样品不发生移动。
  5. 将样品置于光路中心，并通过选择荧光强度最高的层面来对准细胞中心进行调焦。
  6. 打开图像采集软件，并在采集模式下拉菜单中选择xyλ 26。
  7. 将激光的激发波长设为561 nm DPSS，动态范围设为8位，图像分辨率为1024 x 1024像素。
    注意：确保共聚焦显微镜配备有561 nm DPSS激光器或白光激光器（WLL）。
  8. 在570–760 nm范围内，以10 nm带宽和4 nm的lambda步长采集荧光发射光谱。
  9. 将针孔设为1个艾里单位（Airy unit），并运行lambda扫描采集。
  10. 在不同视野下尽可能多次重复此过程，以收集足够数量的数据用于统计分析（通常标准差低于10%22）。
  11. 在不同条件（红光和绿光下）重复上一步操作，并保存数据。
    注意：对不同样品和条件应使用相同的采集设置，以便进行比较和统计分析。

激光扫描共聚焦显微镜软件界面，逐步采集设置示意图。
图2：软件设置。 用于设置lambda扫描参数的成像软件用户界面。（A）从左至右，从下拉列表中选择采集模式xyλ，对应实验方案中的步骤3.6，并选择正确的浸没透镜类型，对应步骤3.3。确保在步骤3.9中从光路中移除任何滤光片。（B）设置lambda扫描参数的面板，对应步骤3.8。（C）在步骤3.10中运行lambda扫描。请点击此处查看该图的放大版本。

4. 评估 Chroothece 生理学特性的参数

  1. 获取lambda扫描后，点击软件顶部的定量窗口（如图3所示），以评估采集到的荧光发射光谱。进入打开项目窗口，选择一个xyλ文件（图3）。
  2. 在成像软件中选择图像堆栈剖面分析。
  3. 在细胞中心定义一个4 µm2的感兴趣区域（ROI），用于分析平均荧光强度（MFI）。将数据导出为CSV格式。
    注意：应避免出现黑色像素（确保所选像素包含正值），并始终使用相同大小的ROI。
  4. 在不同条件下对多个细胞重复此过程，以获得足够的数据进行统计分析。
  5. 打开CSV文件，从中选择所有测量ROI中藻胆蛋白和叶绿素的不同荧光发射峰。
    1. 在csv文件中分别选择藻红蛋白-藻蓝素（PE-PCB；620 nm）、C-藻蓝蛋白（CPC；648 nm）、别藻蓝蛋白（APC；660 nm）和叶绿素a（Chl a；680 nm）的荧光数据。
  6. 创建一个新表格，汇总各藻胆蛋白和叶绿素峰对应的最高荧光值，并将数据绘制成图表。
  7. 进行统计分析。
    1. 分析所得数据是否符合正态性和方差齐性27。
    2. 若满足第一个条件，则进行t检验分析27,28；否则进行Mann-Whitney U检验29。
    3. 以p值<0.05视为差异具有统计学意义。

荧光显微分析；光谱图；图像定量步骤；发射数据。
图 3：评估 Chroothece 的自发荧光。 进行自发荧光分析时，需在“打开的项目”窗口中选择“定量”窗口和一个 xyλ 文件（步骤 4.1）；选择“堆栈剖面可视化”（步骤 4.2）；在细胞中心选择一个 4 µm2 的感兴趣区域（ROI），然后点击“报告”按钮，以 CSV 格式导出波长扫描数据（步骤 4.3）。请点击此处查看该图的放大版本。

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结果

叶绿素a通常吸收可见光中的蓝光和红光波长，而藻胆蛋白则利用绿光、黄光和橙光波长7。这些色素的自发荧光使得研究藻胆蛋白和叶绿素在实验和野外条件下的行为成为可能。

通过比较所获得的数据并在不同图表上进行绘制，可以区分平均荧光强度（MFI）的显著变化（图4）。对λ扫描谱图中获得的不同发射峰（620、648、660 和 680 nm）进行进一步的统计学分析，结果显示存在显著差异（统计学显著性：*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001）。

当细胞暴露于绿色单色光（GL）时，PE-PCB 的平均荧光强度（MFI）显著降低，而在红光（RL）下与对照组相比无显著差异（图4A）。然而，GL 对 APC 和叶绿素 a（Chl a）产生了相反的影响（

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讨论

一些单细胞或群体红藻，例如 Chroothece, 生长缓慢 体外 但含有多种自发荧光化合物，可通过共聚焦显微镜下的光谱分析进行检测，其中可识别色素发射峰的差异。光谱共聚焦荧光显微技术使我们能够开展 体内 评估光合生物适应或驯化的研究8,10,17,18,19,20. 大多数其他技术，例如蛋白质分析，需要大量样品，具有破坏性，或成本高得多。

选择561 nm波长是因为它对藻胆蛋白更具选择性（基于先前的报道23）；该结果也验证了之前一项利用三种不同激发波长（351、488 和 543...

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

本研究作为由西班牙经济与竞争力部以及穆尔西亚地区塞内卡基金会资助的项目TIN2015-68454-R和20961/PI/18的一部分开展。穆尔西亚大学科研与科学领域统计支持科（Sección de Apoyo Estadístico (SAE)，Área Científica y de Investigación (ACTI)，Universidad de Murcia）的Irene Hernández Martínez和Francisco Javier Ibáñez López参与了本研究。（图1）使用Servier医学艺术图库中的图片绘制而成。Servier医学艺术（Servier Medical Art）依据知识共享署名3.0未本地化许可协议（https://creativecommons.org/licenses/by/3.0/）获得授权。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
µ-Dish 35 mm，高底玻璃培养皿Ibidi 81158-
24孔黑色培养板Ibidi82406 平底透明，适用于高通量显微镜观察
藻类培养箱PanasonicMLR-352-PE
共聚焦激光扫描显微镜Leica MicrosystemsSP8 TCS-
烧瓶Fisher Scientific15380591可在本地便利店或在线商店购买。
绿色滤光片PNTA，LEE filters-可在本地便利店或在线商店购买。
HC PL APO 63X/1.30 GLYC CORR CS2Leica Microsystems506353甘油浸没物镜
图像采集软件 LAS XLeica MicrosystemsSP8 TCS-
光源PanasonicFL40SSENW/37MLR-352-PE
量子光辐射计DeltaOhm DO 9721-
R 软件R Core Team, 20204.0.2.-
红色滤光片PNTA，LEE filters-可在本地便利店或在线商店购买。
SWES 培养基穆尔西亚大学--
Type G 浸油液体Leica Microsystems11513910甘油 

参考文献

  1. Vis, M. L., Necchi, O. Freshwater Red Algae: Phylogeny, Taxonomy and Biogeography. , Springer Nature. (2021).
  2. Aboal, M., et al. Diversity of Chroothece (Rhodophyta, Stylonematales) including two new species. European Journal of Phycology. 53 (2), 189-197 (2018).
  3. Millach, L., Obiol, A., Solé, A., Esteve, I. A novel method to analyse in vivo the physiological state and cell viability of phototrophic microorganisms by confocal laser scanning microscopy using a dual laser. Journal of Microscopy. 268 (1), 53-65 (2017).
  4. Millach, L., Villagrasa, E., Solé, A., Esteve, I. Combined confocal laser scanning microscopy techniques for a rapid assessment of the effect and cell viability of Scenedesmus sp. DE2009 under metal stress. Microscopy and Microanalysis. 25 (4), 998-1003 (2019).
  5. Poryvkina, L., Babichenko, S., Leeben, A. Analysis of phytoplankton pigments by excitation spectra of fluorescence. Proceedings of EARSeL-SIG-Workshop LIDAR. , Dresden. (2000).
  6. Beutler, M., et al. A fluorometric method for the differentiation of algal populations in vivo and in situ. Photosynthesis Research. 72 (1), 39-53 (2002).
  7. Grigoryeva, N., Chistyakova, L. Fluorescence microscopic spectroscopy for investigation and monitoring of biological diversity and physiological state of cyanobacterial cultures. Cyanobacteria. , (2018).
  8. Grigoryeva, N. Fluorescence Methods for Investigation of Living Cells and Microorganisms. , (2020).
  9. Roshchina, V. V. Vital autofluorescence: application to the study of plant living cells. International Journal of Spectroscopy. 2012, 5-18 (2012).
  10. Roldán, M., Thomas, F., Castel, S., Quesada, A., Hernández-Mariné, M. Noninvasive pigment identification in single cells from living phototrophic biofilms by confocal imaging spectrofluorometry. Applied and Environmental Microbiology. 70 (6), 3745-3750 (2004).
  11. Hense, B. A., Gais, P., Jütting, U., Scherb, H., Rodenacker, K. Use of fluorescence information for automated phytoplankton investigation by image analysis. Journal of Plankton Research. 30 (5), 587-606 (2008).
  12. Millie, D. F., Schofield, O. M., Kirkpatrick, G. J., Johnsen, G., Evens, T. J. Using absorbance and fluorescence spectra to discriminate microalgae. European Journal of Phycology. 37 (3), 313-322 (2002).
  13. Richardson, T. L., et al. Spectral fluorometric characterization of phytoplankton community composition using the Algae Online Analyser. Water Research. 44 (8), 2461-2472 (2010).
  14. Kieleck, C., Bousquet, B., Le Brun, G., Cariou, J., Lotrian, J. Laser induced fluorescence imaging: application to groups of macroalgae identification. Journal of Physics D: Applied Physics. 34 (16), 2561-2571 (2001).
  15. Coronado-Parra, T., Roldán, M., Aboal, M. Confocal microscopy in ecophysiological studies of algae: a door to understanding autofluorescence in red algae. Microscopy and Microanalysis. 28 (1), 218-226 (2022).
  16. Mulec, J., Kosi, G. Lampenflora algae and methods of growth control. Journal of Cave and Karst Studies. 71 (2), 109-115 (2009).
  17. Nelissen, B., De Baere, R., Wilmotte, A., De Wachter, R. Phylogenetic relationships of nonaxenic filamentous cyanobacterial strains based on 16S rRNA sequence analysis. Journal of Molecular Evolution. 42 (2), 194-200 (1996).
  18. Roldán, M., Oliva, F., Gónzalez Del Valle, M. A., Saiz-Jimenez, C., Hernández-Mariné, M. Does green light influence the fluorescence properties and structure of phototrophic biofilms. Applied and Environmental Microbiology. 72 (4), 3026-3031 (2006).
  19. Topinka, J. A., Bellows, W. K., Yentsch, C. S. Characterization of marine macroalgae by fluorescence signatures. International Journal of Remote Sensing. 11 (12), 2329-2335 (1990).
  20. Roldán, M., Ascaso, C., Wierzchos, J. Fluorescent fingerprints of endolithic phototrophic cyanobacteria living within halite rocks in the atacama desert. Applied and Environmental Microbiology. 80 (10), 2998-3006 (2014).
  21. Solé, A., Diestra, E., Esteve, I. Confocal laser scanning microscopy image analysis for cyanobacterial biomass determined at microscale level in different microbial mats. Microbial Ecology. 57 (4), 649-656 (2009).
  22. Ramírez, O., García, A., Rojas, R., Couve, A., Härtel, S. Confined displacement algorithm determines true and random colocalization in fluorescence microscopy. Journal of Microscopy. 239 (3), 173-183 (2010).
  23. Universität Gottingen-Georg-August. SAG Culture Collection of Algae. Universität Gottingen-Georg-August. , www.uni-goettingen.de (2022).
  24. Zhang, M., et al. Improvement of cell counting method for Neubauer counting chamber. Journal of Clinical Laboratory Analysis. 34 (1), 23024(2020).
  25. Wolf, E., Schüßler, A. Phycobiliprotein fluorescence of Nostoc punctiforme changes during the life cycle and chromatic adaptation: Characterization by spectral confocal laser scanning microscopy and spectral unmixing. Plant, Cell and Environment. 28 (4), 480-491 (2005).
  26. Zucker, R. M., Rigby, P., Clements, I., Salmon, W., Chua, M. Reliability of confocal microscopy spectral imaging systems: Use of multispectral beads. Cytometry Part A. 71 (3), 174-189 (2007).
  27. Field, A. M. Discovering Statistics Using R. , (2013).
  28. Linnet, K. Limitations of the paired t-test for evaluation of method comparison data. Clinical Chemistry. 45 (2), 314-315 (1999).
  29. Rosner, B., Grove, D. Use of the Mann-Whitney U-test for clustered data. Statistics in Medicine. 18 (11), 1387-1400 (1999).
  30. Colin, L., et al. Imaging the living plant cell: from probes to quantification. The Plant Cell. 34 (1), 247-272 (2022).
  31. Borlinghaus, R. The white confical: continuous spectral tuning in excitation and emission. Optical Fluorescence Microscopy. , Springer. Berlin, Heidelberg. (2011).

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