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方法文章

评估软体动物粗提物和澄清提取物的潜在抗隐球菌特性

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DOI：

10.3791/64540

⸱

2022年12月2日

 ,  ,  , 
1Molecular and Cellular Biology Department, University of Guelph, 2School of Environmental Sciences, University of Guelph

本文内容

摘要

人类真菌病原体Cryptococcus neoformans可产生多种毒力因子（例如蛋白酶），以促进其在宿主内的存活。环境生态位是新型天然蛋白酶抑制剂的潜在来源。本方案概述了从软体动物制备提取物及其对真菌毒力因子产生影响的评估方法。

摘要

Cryptococcus neoformans 是一种具有荚膜的人类真菌病原体，呈全球分布，主要感染免疫功能低下者。抗真菌药物在临床的广泛使用、农业中的应用以及菌株间的杂交促进了耐药性的不断演化。抗真菌药物耐药率的持续上升已引起全球临床医生和科学家的广泛关注，迫切需要开发新型抗真菌疗法。例如，C. neoformans 可产生多种毒力因子，包括参与组织降解、细胞调控和营养获取的胞内和胞外酶类（如肽酶）。通过抑制剂阻断这些肽酶的活性可干扰真菌的生长与增殖，提示这可能是一种对抗该病原体的重要策略。值得注意的是，无脊椎动物（如软体动物）能够产生具有生物医学应用价值和抗微生物活性的肽酶抑制剂，但其在抗真菌病原体方面的应用仍鲜有研究。本实验方案中，对软体动物进行了全提取，以分离粗提物和澄清提取物中的潜在肽酶抑制剂，并评估其对新型隐球菌经典毒力因子的影响。该方法有助于筛选具有抗真菌特性的软体动物，并为发掘来源于软体动物天然抑制剂的抗毒力因子提供新机遇。

引言

Cryptococcus neoformans 是一种人类真菌病原体，可在免疫功能低下者（如艾滋病病毒感染者/艾滋病患者）中引起严重疾病1，并导致约 19% 的艾滋病相关死亡2。该真菌对多种抗真菌药物敏感，包括唑类、多烯类和氟胞嘧啶，这些药物通过不同的作用机制发挥杀菌或抑菌活性3,4。然而，在临床和农业环境中广泛使用抗真菌药物，加之菌株间的杂交，已加剧了包括C. neoformans在内的多种真菌耐药性的进化5。

为了应对抗真菌耐药性的挑战并降低全球范围内真菌感染的发生率，一种有前景的策略是利用真菌的毒力因子 隐球菌 种（例如，温度适应性, 多糖荚膜，黑色素 以及细胞外酶）作为潜在的治疗靶点4,6该方法具有多项优势，因为这些毒力因子在文献中已有充分表征，且通过抑制毒力而非靶向细胞生长来施加较弱的选择性压力，有望降低抗真菌药物耐药的发生率。6在此背景下，大量研究已评估了靶向细胞外酶（如蛋白酶、肽酶）以降低或抑制病原体毒力的可能性 隐球菌 sp.7,8,9.

无脊椎动物和植物等生物不具备适应性免疫系统来抵御病原体。然而，它们依赖强大的先天免疫系统，并利用大量化学化合物来应对微生物和捕食者10。这些分子包括肽酶抑制剂，其在多种生物系统中发挥重要作用，例如无脊椎动物免疫中的血淋巴凝固、细胞因子和抗菌肽的合成，以及通过直接使病原体蛋白酶失活来保护宿主11。因此，来自软体动物等无脊椎动物的肽酶抑制剂具有潜在的生物医学应用价值，但其中许多尚未被充分表征10,12,13。在此背景下，安大略省约有34种陆生软体动物，加拿大境内有约180种淡水软体动物14。然而，对它们的深入分析和表征仍然有限15。这些生物为发现具有潜在抗真菌活性的新化合物提供了机会10。

本方案描述了从无脊椎动物（例如软体动物）中分离和澄清提取物的方法（图1），随后检测其潜在的肽酶抑制活性。接着通过表型实验测定这些提取物对C. neoformans毒力因子产生的影响，以评估其抗真菌特性（图2）。需要注意的是，粗提物与澄清提取物之间抗真菌特性的差异可能提示软体动物体内微生物因素（例如宿主微生物组产生的次级代谢产物或毒素）的存在，这些因素可能影响实验结果。此类发现支持本方案中分别评估粗提物和澄清提取物的必要性，以揭示其作用机制。此外，该提取过程具有无偏性，可能有助于检测对多种真菌和细菌病原体的抗菌活性。因此，本方案为优先筛选出对C. neoformans具有抗真菌活性的软体动物物种提供了起点，同时也为通过潜在的抑制机制评估酶活性与毒力因子产生之间的关联提供了机会。

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方案

1. 从软体动物中提取蛋白质

  1. 从指定且经批准的自然区域（例如，加拿大安大略省圭尔夫市的斯比德河）采集软体动物。本研究中选择了本地种和入侵种，以评估其广泛的潜在抗真菌效应。
  2. 使用研钵和研杵轻轻敲碎软体动物（例如 Cepaea nemoralis、Planorbella pilsbryi 和 Cipangopaludina chinensis）的外壳，并用镊子移除碎片。通常将10只软体动物合并为一组用于后续实验流程。
  3. 收集并称量器官组织，约15–20 g样品为最佳用量。使用剪刀将器官剪切成大小约为0.5–1 cm的小块。
  4. 用液氮快速冷冻已解剖并切碎的器官样品，随后在研钵中用研杵研磨成细粉。
  5. 将约15 g的器官样品粉末加入30 mL冷蒸馏水（4 °C）中，制成1:2（w/v）的混合液。
  6. 将2 mL样品转移至耐冲击的2 mL离心管中，每管加入一勺3 mm不锈钢珠（约500 µg），在4 °C条件下以1,200 rpm转速使用均质器（见材料表）均质3分钟。
  7. 在4 °C条件下以12,000 × g 离心20分钟，用移液器收集全部上清液至新的50 mL离心管中，弃去沉淀。
  8. 使用0.22 µm滤膜对上清液进行过滤除菌。将样品置于冰上保存，并根据需要进入澄清步骤（第2节）。
    ​注意：样品也可用液氮速冻后于−20 °C保存，作为粗提物使用。

2. 软体动物提取物的澄清

  1. 将步骤1.8中的上清液样品置于60 °C的水浴中孵育30分钟。随后将样品转移至装有冰的容器中快速冷却20分钟。
  2. 在4 °C条件下，以15,000 × g 离心45分钟。收集上清液至新的50 mL离心管中，弃去沉淀。使用0.22 µm孔径的滤膜对样品进行过滤除菌，然后将样品置于冰上保存。
  3. 采用蛋白定量检测方法（例如双辛可宁酸法17）测定步骤1.8（即粗提物）和步骤2.2（即澄清提取物）中样品的蛋白浓度。理想的蛋白浓度范围为4–8 mg/mL。
  4. 样品可在冰上保存最多1小时，或在液氮中速冻后于−20 °C保存，直至后续使用。

3. 抑制活性测定

  1. 使用技术重复三次的酶学检测方法测定粗提物和澄清提取物的抑制活性。
    注意：每种酶学检测均包含一种酶（例如，参与真菌毒力的枯草杆菌蛋白酶A16,17,18；通常在比色法检测中浓度约为 1 × 10−9 mol/L）、缓冲液和底物。当底物与酶接触时，反应开始。酶活性与底物转化为产物的速率成正比。
  2. 评估酶浓度（EC）对酶活性（EA）的影响，直至两个参数之间获得线性依赖关系。在后续步骤中，使用处于所测线性范围内的酶浓度。
    注意：枯草杆菌蛋白酶A的酶学检测将在以下步骤中详细说明。
  3. 在96孔平底板中，将粗提物（步骤1.11）或澄清的软体动物蛋白提取物（步骤2.5）（例如，含4 mg/mL蛋白的10 µL）与10 µL枯草杆菌蛋白酶A（浓度根据步骤3.2确定）以及220 µL pH 8.6的100 mM Tris-HCl于25 °C孵育10分钟（对照组则加入230 µL Tris缓冲液，不加提取物）。
  4. 加入10 µL枯草杆菌蛋白酶A的底物N-琥珀酰-丙氨酰-丙氨酰-脯氨酰-苯丙氨酰对硝基苯胺，使其终浓度为1 Km（米氏常数；该底物与枯草杆菌蛋白酶A反应时为0.2 mM），最终反应体积为250 µL。
  5. 通过每15秒读取一次405 nm处的光密度（OD），持续3分钟，监测产物生成情况以测定酶活性。
  6. 通过计算在软体动物提取物存在下与不存在下酶活性的比值，确定残余酶活性。
  7. 若观察到抑制活性（即残余活性低于1），则采用一系列提取物浓度（例如，从200 µg/mL至1 µg/mL的两倍稀释系列），按照标准方法测定半数抑制浓度（IC50） 值19。

4. 软体动物提取物对C. neoformans生长的影响

  1. 使用10 µL移液器吸头接种单个菌落 C. neoformans 变种 格鲁比亚 H99 野生型（WT）接种于 5 mL 酵母提取物-蛋白胨-葡萄糖（YPD）培养基（10 g/L 酵母提取物、20 g/L 蛋白胨、20 g/L 葡萄糖，pH 6.5）中，于 30 ℃ 培养 16–18 小时 °C 和 200 rpm。实验设置三个生物学重复，每个重复进行两次技术重复。
  2. 收集 500 µL 的培养物于比色皿中，于 600 nm 处测定 OD 值以读取生长情况。用酵母氮源基础（YNB）培养基稀释培养物至最终 OD600 0.02。
  3. 共培养 C. neoformans 不同浓度的细胞（例如，从440开始的三倍稀释系列） µ微克/毫升至15 µg/mL 蛋白）的提取物（即粗提物和澄清提取物）。为此，混合 10 µL 的提取物与 190 µ稀释液的 L C. neoformans 在96孔板中培养（步骤4.2）。
  4. 通过测定OD值来测量生长情况600 使用酶标仪在37℃、200 rpm条件下，每15分钟至1小时检测一次，持续72小时 °C.

5. 软体动物提取物对C. neoformans黑色素产生的影响

  1. 制备 L-3,4-二羟基苯丙氨酸（L-DOPA）平板。
    1. 将230 mL含14 g/L琼脂的溶液高压灭菌，冷却至50–60 ℃ °C.
    2. 加入 3.25 mL 1 M 甘氨酸和 7.35 mL 1 M KH2PO4，2.5 mL 1 M MgSO₄4.7H2O，0.6 mL 40% 葡萄糖，70 µ10 mM硫胺素L和2.5 mL 100 mM L-DOPA（滤膜除菌）加入液体琼脂中。
    3. 将15 mL混合物倒入培养皿中，于避光条件下静置干燥约1小时，并在2-4℃保存。 °4 °C 下可保存长达 1 周。确保培养皿盖部分打开，以便琼脂充分干燥。
  2. 接种50 μL Cryptococcus neoformans至5 mL YNB培养基中 µL of C. neoformans 步骤4.1的培养物，于30℃孵育16–18小时 °C 和 200 rpm。
  3. 在1,000 ×g下离心细胞 × g 4℃下离心5分钟 ˚C. 用 pH 7.4 的无菌磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞 2 次。
  4. 使用血细胞计数板对细胞进行计数。将细胞重悬于 1 mL 磷酸盐缓冲液（PBS）中，使其最终浓度达到 106 细胞/mL
  5. 制备软体动物粗提物和澄清提取物的系列稀释液（例如，两倍稀释）。同样，制备10倍系列稀释液 C. neoformans 细胞（步骤 5.4）来自 1 x 106 cells/mL 至 1 × 101 细胞/mL，使用无菌PBS在96孔板中进行。
  6. 200 µ用棉签将提取物涂布于含L-DOPA琼脂的培养皿上，并静置干燥15分钟。
  7. 点 5 µ从每个孔中取 L 培养物点样于 L-DOPA 平板上，液滴之间间隔 1 cm。避光干燥 15 分钟。
  8. 在30 ℃下孵育平板 °C 和 37 °在静态培养箱中于3-5天内培养，每隔24小时使用相机或平板成像仪（如扫描仪）拍摄图像。
    ​注意：此处采用两种温度条件，以探究温度对软体动物提取物生长抑制效应的影响，其中30 °C 代表环境和 37 ˚C 代表人体生理温度。

6. 软体动物提取物对C. neoformans多糖荚膜产生的影响

  1. 按以下步骤制备低铁培养基（LIM）。
    1. 将5 g螯合树脂（见材料表）溶解于60 mL超纯水中，并装入玻璃柱（直径2 cm，长度25 cm）。用100 mL水洗涤柱子，并弃去收集的水。
    2. 将2 L无菌超纯水通过螯合柱，制备低铁水（LI-水）。将LI-水在4 ˚C下保存，最长可保存3个月。
    3. 将5 g葡萄糖溶解于100 mL LI-水中。另取一个烧杯，将5 g L-天冬酰胺溶解于200 mL LI-水中。
    4. 按顺序向500 mL LI-水中加入以下成分：4.78 g HEPES、0.4 g K2HPO4、0.08 g MgSO4·7H2O、1.85 g NaHCO3和0.25 g CaCl2·2H2O。
    5. 合并步骤6.1.3和步骤6.1.4中的溶液。加入1 mL 100 mM邻菲啰啉二磺酸钠盐（BPS），使其终浓度为100 µM。
    6. 用1 M LI-MOPS将pH调节至7.2。用LI-水定容至1 L，并通过0.22 µm滤膜过滤除菌。向培养基中加入100 µL无菌硫胺素（4 mg/mL）。
  2. 在5 mL YNB培养基中接种来自步骤4.1的C. neoformans培养物50 µL。在30 °C、200 rpm条件下培养16–18小时。用该培养物接种5 mL LIM，使终浓度为105 个细胞/mL。
  3. 加入适当体积的软体动物提取物（例如两倍稀释液或根据先前毒力实验确定的体积），以达到所需浓度。在37 °C、200 rpm条件下，松开瓶盖培养72小时。培养后，收集1 mL细胞，在4 ˚C下以1,500 × g离心2分钟，用无菌PBS（pH 7.4）洗涤两次。
  4. 将细胞轻轻重悬于1 mL PBS中。在载玻片上将细胞与印度墨水按1:1比例混合（例如，4 µL印度墨水与4 µL细胞悬液）。盖上盖玻片。
  5. 使用微分干涉差（DIC）显微镜配合63倍油镜观察样品（见材料表）。将对比度设为自动，通过显微镜旋钮手动调焦。选择所有图像，并以TIFF格式导出。无需应用任何滤镜。
  6. 使用ImageJ20中的标尺工具，量化总细胞大小（包括荚膜）与细胞体大小的比值。

7. 软体动物提取物对C. neoformans生物膜形成的影响

  1. 接种50 μL Cryptococcus neoformans至5 mL YNB培养基中 µL of C. neoformans 步骤4.1的培养物，于30 ℃孵育16–18 h °C 和 200 rpm。
  2. 从5 mL培养物中收获细胞。用无菌PBS（pH 7.4）洗涤细胞，离心条件为1,500 ×g × g 4℃下离心2分钟 ˚C.
  3. 使用血细胞计数板对细胞进行计数。将细胞重悬于 3 mL 达尔伯克改良伊格尔培养基（DMEM）中，调整终浓度为 107 细胞/mL
  4. 转移 300 µ将细胞悬液各1 L加入无菌的聚苯乙烯平底24孔板的各个孔中。仅含培养基的孔作为对照。
  5. 加入适量的软体动物提取物（例如，两倍稀释液或根据先前毒力实验确定的体积），使终浓度达到 10–20 µg/mL 蛋白。确保提取物体积不超过总体积的10%。
  6. 用铝箔包裹培养皿（以防止培养基蒸发），并在30℃恒温培养箱中静置培养48小时。 °C 和 37 °C.
  7. 使用瓶子或分配器用无菌水清洗孔板2次，并在室温下静置晾干10–15分钟。然后，加入100 µ每孔加入 0.3% 结晶紫溶液 L（包括仅含培养基的对照孔），室温孵育 10 分钟。
  8. 用无菌水彻底清洗各孔 3 次（清洗过程中生物膜不会被破坏）。加入 200 µ100% 乙醇 L，室温孵育 10 分钟。
  9. 转移 75 µL 转移至新的 96 孔平底板，测定 OD550. 以（OD）定量生物膜的形成550 nm 样品的光密度值（OD）550 nm 空白对照）

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结果

本文所述工作流程可实现从软体动物中分离具有潜在抗毒力特性的蛋白质和多肽 C. neoformans同样，评估不同形式的提取物（即粗提物和澄清提取物）有助于对潜在活性化合物进行半纯化，并支持后续分析（如基于质谱的蛋白质组学）。通常，蛋白质提取流程可获得蛋白浓度为4-8 mg/mL的匀浆溶液。此处的代表性结果展示了对酶活性及抗真菌特性的评估 C. chinensis 提取物.粗提物和澄清提取物均能抑制枯草杆菌蛋白酶A（与毒力相关）的蛋白水解活性 C. neoformans) (图3），其IC50 值 5.3 µg/mL 和 4.53 µg/mL分别。该活性 C. chinensis 提取物进一步针对与以下过程相关的活性进行了测试 C. neoformans 毒力因子的产生，包括真菌生长、荚膜和黑色素生成以及生物膜的形成。真菌生长在 37 °C 在粗提物存在的情况下（图 4A）并澄清（

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讨论

本文所述提取方案概述了从加拿大安大略省采集的软体动物中分离化合物的方法，并展示了利用软体动物提取物对抗人类真菌病原体C. neoformans的创新性研究。该方案进一步丰富了关于无脊椎动物中肽酶抑制剂活性的研究体系13。在提取过程中，部分提取样品难以实现过滤除菌，可能是因为可溶性多糖和/或色素堵塞了滤膜。为克服这一限制，建议首先通过5 µm滤膜过滤，以去除大分子物质（如破裂的细胞膜、基因组DNA），从而使蛋白质顺利通过滤膜，随后再使用0.22 µm滤膜进行二次过滤。这些步骤对本方案至关重要，因其可有效减少可能污染样品并干扰后续实验的微生物存在。

在本研究中，检测到了针对枯草蛋白酶A（subtilisin A）的肽酶抑制剂，后者是S8家族枯草蛋白酶的一个模型酶。该酶家族成员广泛分布于各类生物体中，在蛋白质加工、营养摄取以及毒力机制等方面具有多种功能21,22，这些功能支持了本研究中观察到的表型效应。例如...

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

作者感谢Geddes-McAlister实验室成员在本研究过程中提供的宝贵支持以及对稿件的反馈意见。作者感谢D. G.-G获得安大略省研究生奖学金和圭尔夫大学国际研究生研究奖的资助支持，以及J. G.-M获得加拿大创新基金会（JELF 38798）和安大略省高等院校与大学部早期研究者奖的资助支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
0.2 μm 滤膜VWR28145-477 (北美)
1.5 mL 离心管（安全锁）Eppendorf0030120086
2 mL 离心管（安全锁）Eppendorf0030120094
3,4-二羟基-L-苯丙氨酸（L-DOPA）Sigma-AldrichD9628-5GCAS #: 59-92-7
96 孔板Costar (Corning)3370
Bullet Blender Storm 24NEXT ADVANCEBBY24M
Centrifuge 5430REppendorf5428000010
Chelex 100 树脂BioRad142-1253
CO2 培养箱（静态）SANYO无货
Cryptococcus neoformans H99ATCC208821
DIC 显微镜Olympus
DIC 显微镜软件Zeiss
DMEMCorning10-013-CV
葡萄糖（D-葡萄糖，无水，试剂级）BioShopGLU501CAS #: 50-99-7
甘氨酸Fisher ChemicalG46-1CAS #: 56-40-6
GraphPad Prism 9Dotmatics
血细胞计数板VWR15170-208
HEPESSigma AldrichH3375
七水合硫酸镁（MgSO4·7H2O）HoneywellM1880-500GCAS #: 10034-99-8 
蛋白胨BioShopPEP403
磷酸盐缓冲液，pH 7.4BioShopPBS408货号：PBS408.500
酶标仪（Synergy-H1）BioTek (Agilent)无货
磷酸二氢钾（KH2PO4）Fisher ChemicalP285-500CAS #: 7778-77-0
枯草杆菌蛋白酶 ASigma-AldrichP4860CAS #: 9014-01-01
琥珀酰-Ala-Ala-Pro-Phe-对硝基苯胺Sigma-Aldrich573462CAS #: 70967-97-4
恒温水浴VWR76308-834
盐酸硫胺素Fisher-BioreagentsBP892-100CAS #: 67-03-8
酵母提取物BioShopYEX401CAS #: 8013-01-2
酵母氮源基础（含氨基酸）Sigma-AldrichY1250-250GYNB 

参考文献

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