评估软体动物粗提取物和澄清提取物的假定抗隐球菌特性

Summary

人类真菌病原体 Cryptococcus neoformans 产生多种毒力因子（例如肽酶），以促进其在宿主内的存活。环境生态位代表了新型天然肽酶抑制剂的有希望的来源。该协议概述了软体动物提取物的制备以及评估它们对真菌毒力因子产生的影响。

Abstract

新型隐球菌 是一种荚膜的人类真菌病原体，分布于全球，主要感染免疫功能低下的个体。抗真菌药物在临床环境中的广泛使用、其在农业中的使用以及品系杂交导致耐药性的进化增加。抗真菌药物耐药率的上升是全球临床医生和科学家日益关注的问题，开发新型抗真菌疗法的紧迫性也越来越高。例如， C. neoformans 产生几种毒力因子，包括细胞内和细胞外酶（例如肽酶），在组织降解，细胞调节和营养获取中起作用。抑制剂破坏这种肽酶活性会扰乱真菌的生长和增殖，这表明这可能是对抗病原体的重要策略。重要的是，软体动物等无脊椎动物产生具有生物医学应用和抗菌活性的肽酶抑制剂，但在对抗真菌病原体方面尚未得到充分探索。在该协议中，从软体动物中进行全局提取以分离粗提取物和澄清提取物中潜在的肽酶抑制剂，并评估它们对经典隐球菌毒力因子的影响。该方法支持对具有抗真菌特性的软体动物进行优先排序，并通过利用软体动物中发现的天然抑制剂为发现抗毒力剂提供了机会。

Introduction

新型隐球菌是一种人类真菌病原体，可在免疫功能低下的宿主（例如艾滋病毒/艾滋病感染者）中产生严重疾病1，并导致约19%^{的艾滋病相关}死亡²。真菌对几类抗真菌药敏感，包括唑类、多烯类和氟胞嘧啶，它们使用^{不同的机制发挥}杀真菌和抑真菌活性3^，4。然而，在临床和农业环境中广泛使用抗真菌药物与菌株杂交相结合，放大了多种真菌物种（包括C. neoformans）耐药性的进化5。

为了克服抗真菌耐药性的挑战并在全球范围内降低真菌感染的流行率，一种有希望的方法是使用隐球菌属的毒力因子（例如，温度适应性、多糖胶囊、黑色素和细胞外酶）作为潜在的治疗靶点^4，6.这种方法有几个优点，因为这些毒力因子在文献中得到了很好的表征，并且靶向这些因子可以通过损害毒力而不是靶向^{细胞生长来}施加较弱的选择压力来潜在地降低抗真菌抗性率6。在这种情况下，许多研究已经评估了靶向细胞外酶（例如蛋白酶、肽酶）以降低或抑制隐球菌属 ^spp.7，^8，9 的毒力的可能性。

无脊椎动物和植物等生物不具备适应性免疫系统来保护自己免受病原体的侵害。然而，它们依靠强大的先天免疫系统和大量的化合物来对付微生物和捕食者¹⁰。这些分子包括肽酶抑制剂，其在许多生物系统中起着重要作用，包括无脊椎动物免疫的细胞过程，例如血淋巴的凝固，细胞因子和抗菌肽的合成，以及通过直接灭活病原体的蛋白酶来保护宿主¹¹。因此，来自软体动物等无脊椎动物的肽酶抑制剂具有潜在的生物医学应用，但许多仍未表征¹⁰，^12，13。在这方面，安大略省大约有34种陆生软体动物，加拿大有180种淡水软体动物¹⁴种。然而，他们的深入剖析和表征仍然有限¹⁵.这些生物为鉴定具有潜在抗真菌活性的新化合物提供了机会¹⁰。

在该协议中，描述了分离和澄清无脊椎动物（例如软体动物）提取物的方法（图1），然后测量推定的肽酶抑制活性。然后通过使用表型测定法测量这些提取物对 C. neoformans 毒力因子产生的影响来评估这些提取物的抗真菌特性（图2）。重要的是要注意，粗提取物和澄清提取物之间的抗真菌特性差异可能表明软体动物的微生物因素（例如，宿主微生物组产生的次级代谢物或毒素），这可能会影响实验观察。这些发现支持该协议需要独立评估粗提取物和澄清提取物，以揭示作用模式。此外，提取过程是公正的，可以检测针对大量真菌和细菌病原体的抗菌特性。因此，该协议为优先考虑具有抗真菌特性的软体动物物种提供了一个起始点 ，并通过假定 的抑制机制评估酶活性与毒力因子产生之间的联系。

Protocol

1. 从软体动物中提取蛋白质

1. 从指定和批准的自然区域（例如，安大略省圭尔夫的斯皮德河）收集软体动物。在这项研究中，选择了本地和入侵物种来评估广泛的潜在抗真菌作用。
2. 用研杵和研钵轻轻地掰开软体动物的外壳（例如，Nemoralis，Planorbella pilsbryi和 Cipangopaludina chinensis），并用镊子去除固体碎片。通常，将10种软体动物汇集在一起，用于整个协议。
3. 收集并称量器官。大约 15-20 g 样品是最佳的。用剪刀将器官切成约0.5-1厘米的小块。
4. 用液氮快速冷冻解剖和切割的器官样品。然后，使用研杵和研钵将器官样品研磨成细粉。
5. 将器官样品粉末（约15g）加入30mL冷蒸馏水（4°C）中，以达到1:2的比例（w / v）。
6. 将 2 mL 样品倒入高冲击力 2 mL 管中。向每个管中加入一勺3mm不锈钢珠（约500μg），并使用搅拌机（参见 材料表）在1，200rpm和4°C下均质化3分钟。
7. 在4°C下以12，000× g 离心20分钟。 用移液管将所有上清液收集在新鲜的50mL管中，丢弃沉淀。
8. 使用0.22μm膜过滤灭菌上清液。将样品储存在冰上，然后继续进行澄清方案（第2节）（如适用）。
   注意:样品可以在液氮中快速冷冻并储存在-20°C下用作粗提取物。

2. 软体动物提取物的澄清

1. 将步骤1.8中的上清液样品置于60°C的热浴中30分钟。然后，通过将样品转移到装有冰的桶中20分钟来快速冷却样品。
2. 将样品在4°C下以15，000× g 离心45分钟。 将上清液收集在新鲜的 50 mL 管中，并弃去沉淀。使用0.22μm膜过滤器对样品进行过滤灭菌，然后将其储存在冰上。
3. 使用定量测定（例如，二辛可宁酸测定¹⁷）确定步骤1.8（即粗提取物）和步骤2.2（即澄清提取物）中的样品中的蛋白质浓度。最佳蛋白质浓度范围为4-8 mg/mL。
4. 将样品在冰上储存长达1小时或在液氮中快速冷冻，并将它们储存在-20°C直至需要。

3. 抑制活性测定

1. 使用酶法测量粗提取物和澄清提取物的抑制活性，一式三份。
   注意:每种酶测定由一种酶（例如，枯草杆菌蛋白酶A，其参与真菌毒力^16，17，18;通常约为1 x ^10-9 mol/L用于显色测定），缓冲液和底物组成。当底物遇到酶时，反应开始。酶活性与底物转化为产物的速率成正比。
2. 评估酶浓度（EC）对酶活性（EA）的影响，直到获得两个参数之间的线性依赖性。对于后续步骤，请使用测量的线性范围内的酶浓度。
   注意:肽酶枯草杆菌蛋白酶A的酶测定详见以下步骤。
3. 将粗（步骤1.11）或澄清（步骤2.5）软体动物蛋白提取物（例如，含有4mg / mL蛋白的10μL）与10μL枯草杆菌蛋白酶A（浓度从步骤3.2测定）和220μL100mM Tris-HCl在pH 8.6（对于对照，加入230μLTris缓冲液而不添加提取物）在25°C下在96孔平底板中孵育10分钟。
4. 加入 10 μL N-琥珀酰基-Ala-Ala-Pro-Phe-p-硝基苯胺，枯草杆菌蛋白酶 A 的底物，终浓度为 1 K_m （Michaelis-Menten 常数;该底物含枯草杆菌蛋白酶 A 为 0.2 mM），最终反应体积为 250 μL。
5. 通过每15秒读取405nm处的光密度（OD）3分钟来监测产品的外观，从而测量酶活性。
6. 通过计算存在软体动物提取物时的酶活性与不存在提取物时的酶活性之比来确定残留的酶活性。
7. 如果观察到抑制活性（即残余活性低于1），则使用一系列浓度的提取物（例如，从200μg/mL到1μg/mL的两倍稀释系列）测量抑制浓度50（IC₅₀）值，遵循标准方法¹⁹。

4. 软体动物提取物对 新福曼梭菌 生长的影响

1. 使用 10 μL 移液器吸头将单个菌落的 C. neoformans . var. grubii H99 野生型 （WT） 引入 5 mL 酵母提取物-蛋白胨-葡萄糖 （YPD） 培养基（10 g/L 酵母提取物、20 g/L 蛋白胨和 20 g/L 葡萄糖，pH 6.5），并在 30 °C 和 200 rpm 下孵育 16-18 小时。在生物一式三份和技术重复中进行实验。
2. 在比色皿中收集 500 μL 培养物，并通过读取 600 nm 处的 OD 来测量生长。用酵母氮碱（YNB）培养基稀释培养物至最终OD₆₀₀ 为0.02。
3. 具有不同浓度（例如，从 440 μg/mL 到 15 μg/mL 蛋白质的三倍稀释系列）的提取物（即粗品和澄清品）共培养 C. neoformans 细胞。为此，在 96 孔板中将 10 μL 提取物与 190 μL 稀释的 C. neoformans 培养物（步骤 4.2）混合。
4. 通过在200rpm和37°C下每15分钟至1小时使用读板器读取OD₆₀₀₇₇ 小时72小时来测量生长。

5. 软体动物提取物对 新福曼梭菌 黑色素生成的影响

1. 准备L-3，4-二羟基苯丙氨酸（L-DOPA）板。
   1. 高压灭菌230 mL 14 g/L琼脂，使其冷却至达到50-60°C。
   2. 向液体琼脂中加入 3.25 mL 的 1 M 甘氨酸、7.35 mL 的 1 M KH 2 PO 4、2.5 mL 的 1 M MgSO_4.7H 2 O、0.6 mL 的 40% 葡萄糖、70 μL 的 10 mM 硫胺素和 _2.5mL 的 100 mM L-DOPA（过滤灭菌）。
   3. 将15mL混合物倒入培养皿中，在黑暗中干燥约1小时，并在2-4°C下储存长达1周。确保盖子部分抬起，使琼脂正确干燥。
2. 用步骤 4.1 中的 50 μL 新生梭菌 培养物接种 5 mL YNB 培养基。在30°C和200rpm下孵育16-18小时。
3. 在4°C下以1，000× g 旋转细胞5分钟。用pH 7.4的无菌磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗涤细胞2x。
4. 使用血细胞计数器计数细胞。将细胞重悬于 1 mL PBS 中，以达到 10^{6 个} 细胞/mL 的终浓度。
5. 制备粗体和澄清软体动物提取物的稀释系列（例如，两倍）。同样，使用无菌PBS在96孔板中制备10倍稀释系列的C. neoformans细胞（步骤5.4 ），从1 x 10⁶ 细胞/ mL到1 x 10¹ 细胞/ mL。
6. 使用拭子将 200 μL 提取物铺在含有 L-DOPA 琼脂的培养皿上，并干燥 15 分钟。
7. 将每个孔中的 5 μL 培养物点到左旋多巴平板上，在两次滴之间留出 1 厘米。让它在黑暗中干燥15分钟。
8. 将板在30°C和37°C的静态培养箱中孵育3-5天，每24小时用相机或平板成像仪（例如扫描仪）捕获图像。
   注意:这里使用两种温度条件来探索温度对软体动物提取物生长抑制作用的影响，其中30°C代表环境温度，37°C代表人体生理温度。

6. 软体动物提取物对 新福曼梭菌 多糖胶囊生产的影响

1. 如下所述制备低铁培养基（LIM）。
   1. 将 5 g 螯合树脂（见 材料表）溶解在 60 mL 超纯水中，并装入玻璃柱（直径 2 cm x 长度 25 cm）中。用 100 mL 水清洗色谱柱，并丢弃收集的水。
   2. 通过将2L无菌超纯水通过螯合柱来制备低铁水（LI-water）。将LI-水在4°C下储存长达3个月。
   3. 将 5 g 葡萄糖溶解在 100 mL LI 水中。将 5 g L-天冬酰胺溶解在单独的烧杯中的 200 mL LI 水中。
   4. 按顺序将以下内容添加到 500 mL LI 水中:4.78 g HEPES、0.4 g K 2 HPO₄、0.08 g MgSO_4.7H 2 O、1.85 g NaHCO₃ 和 0.25 g CaCl_{2.2H 2}O。
   5. 合并步骤 6.1.3 和步骤 6.1.4 中的解决方案。加入 1 mL 100 mM 巴咯咯啉二磺酸钠盐 （BPS） 至终浓度为 100 μM。
   6. 用 1 M LI-拖把将 pH 值调节至 7.2。加入LI水至最终体积为1L，并通过0.22μm膜过滤灭菌培养基。向培养基中加入 100 μL 无菌硫胺素 （4 mg/mL）。
2. 用步骤 4.1 中的 50 μL 新福曼梭菌 培养物接种 5 mL YNB 培养基。在30°C和200rpm下孵育16-18小时。使用该培养物接种 5 mL LIM 至终浓度为 10^{5 个} 细胞/mL。
3. 加入适当体积的软体动物提取物（例如，两倍稀释或从先前的毒力测定中确定的体积）以达到所需的浓度。用松开的盖子在37°C和200rpm下孵育72小时。孵育后，收集1mL细胞，并在4°C下用无菌PBS，pH 7.4，在1，500× g 下洗涤2分钟。
4. 轻轻地将细胞重悬于 1 mL PBS 中。在玻璃显微镜载玻片上以 1:1 的比例将细胞与印度墨水混合（例如，4 μL 印度墨水与 4 μL 细胞悬浮液）。将盖玻片放在载玻片顶部。
5. 使用带有63x油物镜的微分干涉对比（DIC）显微镜可视化样品（参见 材料表）。将对比度设置为自动，并使用显微镜转盘手动对焦。选择所有图片，并以TIFF格式导出。无需应用过滤器。
6. 使用 ImageJ²⁰ 中的标尺工具，量化总细胞大小（包括胶囊）与细胞体大小的比率。

7. 软体动物提取物对 新福曼梭菌 生物膜产生的影响

1. 用步骤 4.1 中的 50 μL 新生梭菌 培养物接种 5 mL YNB 培养基。在30°C和200rpm下孵育16-18小时。
2. 从 5 mL 培养物中收获细胞。用无菌PBS，pH 7.4，在4°C下以1，500× g 洗涤细胞2分钟。
3. 使用血细胞计数器计数细胞。将细胞重悬于 3 mL Dulbecco 改良鹰培养基 （DMEM） 中，终浓度为 10⁷ 个细胞/mL。
4. 将 300 μL 细胞悬液转移到无菌聚苯乙烯平底 24 孔板的各个孔中。仅将带有培养基的孔用作对照。
5. 加入适当体积的软体动物提取物（例如，两倍稀释或从先前的毒力测定中确定的体积），以达到10-20μg/ mL蛋白质的最终浓度。确保提取物体积不大于总体积的 10%。
6. 用铝箔包裹板（以避免培养基蒸发），并使用静态培养箱在30°C和37°C孵育48小时。
7. 使用瓶子或分配器用无菌水清洗孔2次，并在室温下风干10-15分钟。然后，向每个孔（包括仅培养基对照孔）中加入 100 μL 0.3% 结晶紫溶液，并在室温下孵育 10 分钟。
8. 用无菌水彻底清洗孔3次（洗涤过程中生物膜不会被破坏）。加入 200 μL 100% 乙醇，并在室温下孵育 10 分钟。
9. 将 75 μL 转移到新的 96 孔平底板中，并读取 OD₅₅₀。将生物膜形成量化为（样品的OD_550nm - 空白的OD_550nm ）。

Results

本文描述的工作流程能够从软体动物中分离蛋白质和肽，这些蛋白质和肽对C. neoformans具有潜在的抗毒力特性。同样，评估不同形式的提取物（即粗品和澄清物）允许对潜在的活性化合物进行半纯化，并支持下游评估（例如，基于质谱的蛋白质组学）。通常，蛋白质提取工作流程可产生蛋白质浓度为 4-8 mg/mL 的均质溶液。在这里，代表性结果证明了对羊草提取物的酶活性和抗真菌特性的评估。粗提取物和澄清提取物能够抑制枯草杆菌蛋白酶A的蛋白水解活性（与新甲虫的毒力有关）（图3），IC 50值分别为5.3 μg/mL和_4.53 μg/mL。进一步测试了羊草提取物的活性与新福曼梭菌毒力因子产生相关的过程，包括真菌生长、胶囊和黑色素的产生以及生物膜的形成。在粗品（图4A）和澄清的（图4B）羊草提取物存在下，37°C的真菌生长显着减少。值...

Discussion

这里描述的提取方案概述了从加拿大安大略省收集的软体动物中分离化合物的方法，并展示了使用软体动物提取物对抗人类真菌病原体C . neoformans的新研究。该协议增加了越来越多的研究，调查无脊椎动物的肽酶抑制剂活性¹³。在提取过程中，一些提取物样品难以过滤灭菌，可能是由于存在可溶性多糖和/或阻碍滤膜的色素。为了克服这一限制，建议首先通过5μm膜过滤以排除大化合物（例如，破碎的细胞膜，基因组DNA），从而使蛋白质通过过滤器，然后再次通过0.22μm膜过滤。这些步骤对协议至关重要，因为它们限制了可能污染样品并干扰下游实验的微生物的存在。

在这项研究中，检测到针对枯草杆菌蛋白酶A的肽酶抑制剂，枯草杆菌蛋白酶A是S8家族枯草杆菌蛋白酶的模型酶。该酶家族的成员广泛分布在生物体中，并具有不同的作用，例如在蛋白质加工，营养和毒力机制²¹，²²中^，这支持本研究中观察到的表型效应。例如，在存在粗提取物和澄清提取物以及相...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2 μm 过滤器	VWR	28145-477 （北美）
1.5 mL 管（安全锁）	Eppendorf	0030120086
2 mL 管（安全锁）	Eppendorf	0030120094
3,4-二羟基-L-苯丙氨酸 （L-DOPA）	Sigma-Aldrich	D9628-5G	CAS #： 59-92-7
96 孔板	Costar （Corning）	3370
BulletBlender Storm 24	NEXT ADVANCE	BBY24M
离心机 5430R	Eppendorf	5428000010
Chelex 100 树脂	BioRad	142-1253
CO2 培养箱（静态）	SANYO	不可用
新型隐球菌 H99	ATCC	208821
DIC 显微镜	奥林巴斯
DIC 显微镜软件	蔡司
DMEM	康宁	10-013-CV
葡萄糖（D-葡萄糖，无水，试剂级）	BioShop	GLU501	CAS #：50-99-7
甘氨酸	费舍尔化学	G46-1	CAS #：56-40-6
GraphPad Prism 9	点阵
血球计数器	VWR	15170-208
HEPES	Sigma Aldrich	H3375
七水硫酸镁 （MgSO4.7 H2O）	霍尼韦尔	M1880-500G	CAS #： 10034-99-8
蛋白胨	BioShop	PEP403
磷酸盐缓冲盐 pH 7.4	BioShop	PBS408	SKU： PBS408.500
读板机 （Synergy-H1）	BioTek （Agilent）	不可用
磷酸二氢钾 （KH2PO4）	Fisher Chemical	P285-500	CAS #： 7778-77-0
枯草杆菌蛋白酶 A	Sigma-Aldrich	P4860	CAS #：9014-01-01
琥珀酰基-Ala-Ala-Pro-Phe-p-硝基苯胺	Sigma-Aldrich	573462	CAS #：70967-97-4
温泉浴	VWR	76308-834
盐酸硫胺素	Fisher-Bioreagents	BP892-100	CAS #：67-03-8
酵母提取物	BioShop	YEX401	CAS #：8013-01-2
酵母氮碱（含氨基酸）	Sigma-Aldrich	Y1250-250G	YNB