使用成像流式细胞术和人工智能实现微核检测自动化

Summary

微核 （MN） 测定是量化 DNA 损伤的成熟测试。然而，使用常规技术（如手动显微镜或基于特征的图像分析）对测定进行评分既费力又具有挑战性。本文描述了开发人工智能模型以使用成像流式细胞术数据对 MN 测定进行评分的方法。

Abstract

微核（MN）测定在全球范围内被监管机构用于评估化学品的遗传毒性。该测定可以通过两种方式进行:在一次分裂、细胞分裂阻断的双核细胞或完全分裂的单核细胞中对 MN 进行评分。从历史上看，光学显微镜一直是对测定进行评分的金标准方法，但它既费力又主观。近年来，流式细胞术已被用于对测定进行评分，但由于无法直观地确认细胞图像的关键方面而受到限制。成像流式细胞术（IFC）结合了高通量图像捕获和自动图像分析，已成功应用于快速获取MN检测中所有关键事件的图像并对其进行评分。最近，已经证明，基于卷积神经网络的人工智能（AI）方法可用于对IFC获取的MN测定数据进行评分。本文介绍了使用 AI 软件创建深度学习模型以对所有关键事件进行评分并应用此模型自动对其他数据进行评分的所有步骤。AI 深度学习模型的结果与手动显微镜相比效果很好，因此可以通过结合 IFC 和 AI 实现 MN 检测的全自动评分。

Introduction

微核 （MN） 测定是遗传毒理学的基础，用于评估人类使用的化妆品、药品和化学品开发中的 DNA 损伤¹，²，^3，4。微核由整个染色体或染色体片段形成，这些染色体或染色体片段在分裂后不会合并到细胞核中，并凝结成与细胞核分离的小圆形体。因此，MN可用作量化遗传毒性检测中DNA损伤的终点¹。

定量 MN 的首选方法是通过使用细胞松弛素-B （Cyt-B） 阻断分裂在一次分裂的双核细胞 （BNC） 内。在此版本的测定中，还通过评分单核（MONO）和多核（POLY）细胞来评估细胞毒性。该测定也可以通过在未阻塞的单核细胞中对MN进行评分来进行，该评分更快，更容易评分，并使用暴露前和暴露后的细胞计数来评估细胞毒性以评估增殖^5，6。

历来通过手动显微镜进行检测的物理评分，因为这允许目视确认所有关键事件。然而，手动显微镜具有挑战性^且主观1。因此，已经开发了自动化技术，包括显微....

Protocol

1. 使用成像流式细胞术采集数据

注意:请参考Rodrigues等人¹⁶ 进行以下修改，注意使用IFC的采集区域可能需要修改以获得最佳图像捕获:

1. 对于非Cyt-B方法，按照制造商的说明（参见 材料表）在培养前和恢复期后立即对每种培养物进行细胞计数。
2. 如果在单相机成像流式细胞仪上运行样品，请将明场（BF）置于通道4中。将 M01 替换为 M04，将 M07 替换为 M01。
   注:"M"是指 IFC 上的摄像机通道。
3. 采集过程中使用 40 倍放大倍率。
4. 在采集过程中的BF面积与BF纵横比图上，使用以下区域坐标:
   X坐标:100和900;Y 坐标:0.7 和 1（Cyt-B 方法）
   X坐标:100和600;Y 坐标:0.7 和 1
5. 在赫斯特强度图上，使用以下区域坐标:
   X坐标:55和75;Y 坐标:9.5 和 15（Cyt-B 方法）
   X坐标:55和75;Y 坐标:13 和 21（非 Cyt-B 方法）
6. 要从数据中删除凋....

Results

图 1 显示了使用 AI 软件创建 MN 检测模型的工作流程。用户将所需的 .daf 文件加载到 AI 软件中，然后使用 AI 辅助集群（图 2）和预测（图 3）标记算法将对象分配给真实模型类。一旦所有真实模型类都填充了足够的对象，就可以使用 RF 或 CNN 算法训练模型。训练后，可以使用包括类分布直方图、准确性统计和交互式混淆矩阵在内的工具来评估模型的性能（图 4）。从AI软件的结果屏幕中，用户可以返回到工作流的训练部分以增强真实数据，或者，如果已达到足够的精度，则用户可以使用该模型对其他数据进行分类。

使用聚类和预测算法，将总共 285，000 个对象的 190 个段分配给适当的真实地面类，直到所有类填充了 1，500 到 10，000 个图像。总共使用了 31，500 个对象（仅占加载初始对象的 10.5%）用于该模型的训练。深度学习软件.......

Discussion

这里介绍的工作描述了使用深度学习算法来自动对 MN 测定进行评分。最近的几篇出版物表明，直观的交互式工具允许创建深度学习模型来分析图像数据，而无需深入的计算知识^18，19。这项工作中描述的协议使用用户界面驱动的软件包，旨在很好地处理非常大的数据文件，并允许轻松创建深度学习模型。讨论了在AI软件包中创建和训练RF和CNN模型的所有必要步骤，从而可以高度准确地识别和量化Cyt-B版本测定中的所有关键事件。最后，描述了使用这些深度学习模型对其他数据进行分类并评估化学细胞毒性和 MN 频率的步骤。

这项工作中使用的人工智能软件具有方便的用户界面，并且可以轻松处理从IFC系统生成的大型数据集。深度学习模型的训练、评估和增强遵循简单的迭代方法（图 1），只需几个步骤即可应用经过训练的模型对其他数据进行分类。该软件包含独特的集群（图 2）和预测（

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
15 mL 离心管	Falcon	352096
洁面乳 - Coulter Clenz	贝克曼库尔特	8546931	在容器中装满 200 毫升清洁剂。https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/page/itemDetails?itemNumber=8546931#2/10//0/25/ 1/0/asc/2/8546931///0/1//0/
秋水仙碱	MilliporeSigma	64-86-8
康宁瓶顶真空过滤器	MilliporeSigma	CLS430769	0.22 µm 过滤器，500 mL 瓶
细胞松弛素 B	MilliporeSigma	14930-96-2	5 mg 瓶
除泡剂 - 70% MilliporeSigma		1.3704	用 200 mL 除泡剂装满容器 http://www.emdmillipore.com/US/en/product/2-Propanol-70%25-%28V%2FV%29-0.1-%C2%B5m-filtred,MDA_CHEM-137040?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F。
	MilliporeSigma	67-68-5
Dulbecco 磷酸盐缓冲盐水 1X	EMD Millipore	BSS-1006-B	PBS Ca++MG++ 免费
胎牛血清	HyClone	SH30071.03
甲醛，10%，不含甲醇，超纯	Polysciences， Inc.	04018	这是用于 4% 和 1% 福尔马林的成分。注意：福尔马林/甲醛吸入和吞咽有毒。刺激眼睛、呼吸系统和皮肤。吸入或皮肤接触可能引起致敏。有严重损伤眼睛的风险。潜在的癌症危害。http://www.polysciences.com/default/catalog-products/life-sciences/histology-microscopy/fixatives/formaldehydes/formaldehyde-10-methanol-free-pure/
Guava Muse 细胞分析仪	Luminex	0500-3115	使用标准配置的 Guava Muse 细胞分析仪。
Hoechst 33342	Thermo Fisher	H3570	10 mg/mL 溶液
甘露醇	MilliporeSigma	69-65-8
MEM 非必需氨基酸 100X	HyClone	SH30238.01
MIFC - ImageStreamX Mark II	Luminex 是一家 DiaSorin 公司	100220	使用配备 405 nm、488 nm 和 642 nm 激光器的 2 相机 ImageStreamX Mark II。
MIFC 分析软件 - IDEAS	Luminex，DiaSorin 公司	100220	"图像分析软件" MIFC （ImageStreamX MKII） 的配套软件
MIFC 软件 - INSPIRE	Luminex，DiaSorin 公司	100220	"图像采集软件" 这是运行 MIFC （ImageStreamX MKII）
Amnis AI 软件	Luminex（DiaSorin 公司	）的软件	100221"AI 软件" 这是允许创建人工智能模型来分析数据的软件
丝裂霉素 C	MilliporeSigma	50-07-7
NEAA 混合物 100x	Lonza BioWhittaker	13-114E
青霉素/链霉素/谷氨酰胺溶液 100X	Gibco	15070063
氯化钾 （KCl）	MilliporeSigma	P9541
冲洗液 - 超纯水或去离子水	NA	NA 使用	任何超纯水或去离子水。在容器中装满 900 mL 的冲洗液。
RNase	MilliporeSigma	9001-99-4
RPMI-1640培养基1x	HyClone	SH30027.01
鞘 - PBS	MilliporeSigma	BSS-1006-B	这与Dulbecco的磷酸盐缓冲盐水1x相同 Ca++MG++免费。用 900 mL 的护套填充容器。
无菌水	HyClone	SH30529.01
灭菌器 - 0.4%–0.7% 次氯酸盐	VWR	JT9416-1	这是大约 10% 的 Clorox 漂白剂，可以通过用水稀释 Clorox 漂白剂制成。用 200 mL 灭菌器填充容器。
T25 培养瓶	Falcon	353109
T75 培养瓶	Falcon	353136
TK6 细胞	MilliporeSigma	95111735