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方法文章

利用成像流式细胞术与人工智能实现微核试验的自动化

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DOI：

10.3791/64549

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2023年1月27日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Amnis Flow Cytometry, Luminex Corporation

本文内容

摘要

微核（MN）试验是一种用于量化DNA损伤的成熟检测方法。然而，使用传统技术（如人工显微镜检查或基于特征的图像分析）对试验结果进行计分十分耗时且具有挑战性。本文描述了利用成像流式细胞术数据开发人工智能模型以实现MN试验自动计分的方法学。

摘要

微核（MN）试验被全球监管机构用于评估化学物质的遗传毒性。该试验可通过两种方式进行：对经过一次分裂、细胞质分裂受阻的双核细胞或完全分裂的单核细胞进行微核计数。传统上，光学显微镜一直是微核试验评分的金标准方法，但其操作繁琐且具有主观性。近年来，流式细胞术已被用于该试验的评分，但其局限性在于无法直观确认细胞图像的关键特征。成像流式细胞术（IFC）结合了高通量图像采集与自动图像分析，已成功应用于快速获取微核试验中所有关键事件的图像并进行评分。最近研究表明，基于卷积神经网络的人工智能（AI）方法可用于分析IFC获取的微核试验数据并完成评分。本文详细描述了利用AI软件构建深度学习模型以识别和评分微核试验中所有关键事件的全部步骤，并将该模型应用于自动评分其他数据集。人工智能深度学习模型的分析结果与人工显微镜评分结果高度一致，因此通过结合成像流式细胞术与人工智能技术，可实现微核试验的全自动评分。

引言

微核（MN）试验是遗传毒理学中的基础方法，用于评估化妆品、药品和人类使用化学品开发过程中的DNA损伤1,2,3,4。微核由在细胞分裂后未能进入主细胞核的完整染色体或染色体片段形成，并凝聚成独立于主核的小型圆形结构。因此，MN可作为遗传毒性测试中量化DNA损伤的终点指标1。

定量微核（MN）的首选方法是使用细胞松弛素-B（Cyt-B）阻断细胞分裂，从而在已分裂一次的双核细胞（BNCs）中进行计数。在此版本的实验中，还可通过计数单核（MONO）和多核（POLY）细胞来评估细胞毒性。该实验也可通过在未阻断的单核细胞中计数微核来进行，此方法计数更快、更简便，细胞毒性则通过暴露前后的细胞计数来评估细胞增殖情况5,6。

该实验的传统评分方法是通过人工显微镜观察完成的，因为这种方法能够直观确认所有关键事件。然而，人工显微镜观察具有挑战性且存在主观性1。因此，人们开发了自动化技术，包括显微镜玻片扫描和流式细胞术，每种方法各有其优势与局限性。尽管玻片扫描法能够可视化关键事件，但玻片需在最佳细胞密度下制备，而这一条件往往难以实现。此外，该技术通常缺乏对细胞质的可视化，可能影响对单核细胞（MONO）和多核细胞（POLY）的准确评分7,8。流式细胞术虽可实现高通量数据采集，但需要对细胞进行裂解，因而无法用于Cyt-B形式的实验。同时，作为一种非成像技术，常规流式细胞术无法提供关键事件的可视化验证9,10。

因此，人们已开始研究利用成像流式细胞术（IFC）来开展微核试验。ImageStreamX Mk II 将传统流式细胞术的高速度和统计稳健性与显微镜的高分辨率成像能力集成于单一系统之中11。研究表明，利用 IFC 可捕获所有关键事件的高分辨率图像，并可通过基于特征的方法12，13或人工智能（AI）技术14，15进行自动评分。通过采用 IFC 实施微核试验，可在更短时间内自动分析远多于显微镜方法的细胞数量。

本研究偏离了先前描述的图像分析工作流程16 并讨论开发和训练随机森林（RF）所需的全部步骤 使用Amnis AI软件的卷积神经网络（CNN）模型（以下简称 "人工智能软件"）。所有必要步骤均已描述，包括使用人工智能辅助标注工具生成真实数据、解读模型训练结果，以及应用模型对额外数据进行分类，从而实现遗传毒性和细胞毒性的计算。15.

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方案

1. 使用成像流式细胞术进行数据采集

注意：参考 Rodrigues 等人16 的方法并作如下修改，需注意使用 IFC 时的采集区域可能需要调整，以获得最佳成像效果：

  1. 对于非细胞松弛素B法，在培养前和恢复期结束后立即对每份培养物使用商用细胞计数仪进行细胞计数，操作遵循制造商说明（参见材料表）。
  2. 若在单相机成像流式细胞仪上运行样本，将明场（BF）置于通道4；将M01替换为M04，将M07替换为M01。
    注意：“M”指IFC上的相机通道。
  3. 采集过程中使用40倍放大倍率。
  4. 在采集期间的明场面积对明场长宽比图上，使用以下区域坐标：
    X坐标：100 和 900；Y坐标：0.7 和 1（细胞松弛素B法）
    X坐标：100 和 600；Y坐标：0.7 和 1
  5. 在Hoechst荧光强度图上，使用以下区域坐标：
    X坐标：55 和 75；Y坐标：9.5 和 15（细胞松弛素B法）
    X坐标：55 和 75；Y坐标：13 和 21（非细胞松弛素B法）
  6. 为从数据中剔除凋亡和坏死物体的图像，请启动IDEAS 6.3软件包（下文简称“图像分析软件”；参见材料表）。
    注意：人工智能软件设计用于通过最新版本的图像分析软件处理过的.daf文件。请确保图像分析软件为最新版本。
  7. 将此工作保存为模板（.ast）文件。

2. 为所有 .rif 文件创建 .daf 文件

  1. AI 软件仅允许导入 .daf 文件。通过批处理为实验中的所有 .rif 文件创建 .daf 文件。
  2. 在 Tools 菜单下，点击 Batch Data Files，然后点击 Add Batch。
  3. 在新窗口中，选择 Add Files，并选中要添加到批处理中的 .rif 文件。在 Select a Template or Data Analysis File (.ast, .daf) 选项下，选择此前创建的 .ast 文件。
  4. 如有需要，指定一个批处理名称，然后点击 OK，以为所有已加载的 .rif 文件生成 .daf 文件。

3. 在人工智能软件中创建实验

  1. 参见 图1 中的流程图，该流程图描述了使用 AI 软件创建深度学习模型的过程。
  2. 启动 AI 软件，并通过点击窗口左下角的 关于 来确认是否已安装最新版本。若未安装最新版本，请联系 support@luminexcorp.com 获取。
  3. 软件的默认界面为 新建实验 界面。使用 文件夹 图标选择实验的保存位置，并为实验输入名称（例如，“MN 模型”）。
  4. 在 实验类型 下，点击 训练 旁边的单选按钮，以启动训练实验，开始构建 CNN 模型。点击 下一步。
    1. 可选：如果此前已训练过模型，可将其用作新 AI 模型的模板，并可在 选择模板模型 界面中选择该模板以创建新模型。若无可用模板模型，可直接点击 下一步 跳过此步骤。
  5. 下一个界面为 定义新模型 界面。在 模型 下，步骤 3.3 中为模型输入的名称将自动填入。
    1. 在 描述 下，输入模型的描述信息（可选），并将最大图像尺寸保持为 150 像素。
    2. 在 通道 下，点击 添加 BF 以在列表中添加明场通道。在 名称 下，双击 明场 并将该通道重命名为 BF。点击 添加 FL 以在列表中添加荧光通道。在 名称 下，双击 荧光 并将该通道重命名为 DNA。
    3. 在 类别名称 下，点击 添加。在弹出窗口中输入 单核 ，然后点击 确定。这将单核类别添加到类别名称列表中。重复此过程，确保以下六个类别均在列表中定义：
      单核
      带微核的单核
      双核
      带微核的双核
      多核
      异常形态
      ​点击 下一步。
      注：这六个真实值模型类别将代表需要评分的关键事件，以及形态上不符合标准评分准则的图像5。
      1. 可选：如需要，可包含步骤 1.7 中的分析模板，以使用图像分析软件中的特征。若希望在 AI 模型中包含这些特征，请浏览选择 .ast 文件，然后从通道特定的下拉菜单中选择希望包含的特征子集。
    4. 在 选择文件 下，点击 添加文件，并浏览选择要添加到 AI 软件中的目标文件，以构建真实值数据。点击 下一步。
      注：应添加多个数据文件（例如，阳性和阴性对照数据），以确保包含足够数量的所有关键事件。
  6. 接下来，在 选择基础群体 界面中，从群体层级中找到 非凋亡 群体。右键点击 非凋亡 群体，选择 选择所有匹配群体。点击 下一步。
    注：应排除所有不应被分类的群体（例如，微球、碎片、双联体等）。
  7. 此界面为 选择真实值群体 界面。
    1. 若图像分析软件中尚未创建关键事件的标记真实值群体，则点击 下一步。
    2. 若已在图像分析软件中创建了标记真实值群体，则将其分配至相应的模型类别。
    3. 为分配 MONO 细胞带微核的标记真实值群体，点击左侧 模型类别 下的 带微核的单核 类别，然后在右侧点击包含这些事件的相应标记真实值群体。
    4. 若标记真实值群体在多个数据文件中创建，可右键点击其中一个真实值群体，选择 选择所有匹配群体，以将多个文件中的标记群体添加至相应类别。
    5. 完成所有适当真实值群体的分配后，点击 下一步。
  8. 在 选择通道 界面中，为实验选择合适的通道。此处，将 BF 设置为通道 1，Hoechst 设置为通道 7。右键点击某一通道，选择 应用至所有。点击 下一步。
  9. 最后，在 确认 界面中，点击 创建实验。
  10. AI 软件将从数据文件中加载图像，并根据步骤 3.7 中分配的真实值图像，创建步骤 3.5.3 中定义的模型类别。点击 完成。
  11. 实验创建完成后，将显示五个选项：
    实验：提供实验的详细信息，包括已加载的数据文件、所选通道以及定义的真实值模型类别。
    标记：启动标记工具，用户可通过该工具填充真实值数据。
    训练：基于真实值数据训练模型。
    分类：使用已训练的模型对数据进行分类。
    ​结果：提供训练实验和分类实验的结果。

4. 使用人工智能辅助标记工具填充真实数据

  1. 点击标记以启动标记工具界面。
    1. 点击缩放工具（放大镜图标）对图像进行裁剪，以便更清晰地查看。
    2. 拖动滑动条调整图像尺寸，以改变画廊中显示的图像数量。
    3. 点击显示设置选项，并选择最小-最大，该模式可提供最佳对比度图像，便于识别所有关键事件。
    4. 点击设置画廊显示，将DNA图像的颜色更改为黄色或白色，以增强小物体（例如微核MN）的可视化效果。
  2. 点击聚类运行算法，将形态相似的对象归为一组。聚类完成后，各个聚类及其包含的对象数量将列在未知群体下方。选择各个聚类以查看其中的对象，并将这些对象分配至相应的模型类别。
  3. 当每个模型类别中至少分配了25个对象后，预测算法将变为可用。点击预测。
    注意：无法良好归入任何群体的对象将保持为未知分类。随着更多对象被添加至真实群体，预测准确性将逐步提高。
  4. 继续向真实模型类别中添加适当图像，直至每个类别中的对象数量达到足够水平。
  5. 当每个模型类别中至少分配了100个对象后，点击屏幕顶部的训练标签页。点击训练按钮，使用随机森林（Random Forest）和卷积神经网络（CNN）算法创建模型。
    注意：人工智能软件将同时使用随机森林和CNN算法创建模型，复选框允许仅使用随机森林或仅使用CNN算法单独建模。

5. 评估模型准确性

  1. 模型训练完成后，点击查看结果。
  2. 使用结果界面评估模型准确性。通过下拉菜单在随机森林和卷积神经网络（CNN）之间切换。
    注意：真实样本群体可进行更新，模型可重新训练，也可直接用于分类更多数据。
    1. 如需更新真实样本群体，请点击顶部的标注，并参照第4节操作。

6. 使用模型对数据进行分类

  1. 启动 AI 软件。默认界面为 新建实验 界面。使用 文件夹 图标选择实验的保存位置，并为实验输入名称。
  2. 在 实验类型下，点击 分类 旁边的单选按钮，以开始分类实验。点击 下一步。
  3. 点击要用于分类的模型，然后点击 下一步。
  4. 在 选择文件界面，点击 添加文件，浏览并选择将由 CNN 模型进行分类的文件。点击 下一步。
  5. 接下来，在 选择基础群体界面，点击已加载文件中 非凋亡群体旁的复选框。右键点击 非凋亡群体，然后选择 选择所有匹配群体，以从所有已加载文件中选中该群体。点击 下一步。
  6. 可选：如果待分类数据中包含真实群体，可在“选择真实群体”界面将其分配至相应的模型类别。否则，点击“下一步”跳过此步骤。
  7. 在 选择通道界面，选择 通道 1 用于明场图像，通道 7 用于 DNA 染色。右键点击某一通道，然后选择 应用到全部。然后点击 下一步。
  8. 最后，在 确认 界面，点击 创建实验。AI 软件将加载所选模型以及所选数据文件中的所有图像。点击 完成。
  9. 点击 分类 以进入分类界面。点击 分类按钮。这将启动使用 RF 和 CNN 模型对额外数据进行分类的过程，并识别属于指定模型类别的所有对象。
    注意：可通过复选框选择使用 RF 模型和/或 CNN 模型。
  10. 分类完成后，点击 查看结果。
  11. 点击 更新 DAF 文件 按钮，以打开 使用分类结果更新 DAF 文件 窗口。点击 确定 以更新 .daf 文件。

7. 生成分类结果报告

  1. 在结果界面，点击生成报告。如果需要为每个输入的 daf 文件生成单独的报告，请勾选为每个输入 DAF 创建报告旁边的复选框，然后点击确定。
  2. 任务完成后，打开报告文件保存的文件夹。该文件夹中包含一份实验的 .pdf 报告以及一个资源文件夹。
  3. 打开 .pdf 文件以查看报告内容。报告中包含模型与实验信息、输入 .daf 文件列表、以表格和直方图形式呈现的类别计数与类别百分比，以及汇总所有输入 .daf 文件中位预测概率的混淆矩阵。
  4. 打开资源文件夹，然后进入CNN文件夹。该文件夹中包含类计数和百分比的柱状图以及混淆矩阵的 .png 图像文件，同时还包含每个输入文件对应的类计数和百分比的 .csv 文件。

8. 确定微核频率和细胞毒性

  1. 计算微核频率
    1. 非Cyt-B方法：要确定微核频率，请打开步骤7.4中的class_count.csv文件。对于每个输入文件，将“含微核的单核细胞”群体的计数除以“单核细胞”群体的计数，再乘以100：
      微核频率计算公式，图示单核细胞中含微核细胞的比例。
    2. Cyt-B方法：要确定微核频率，请打开步骤7.4中的class_count.csv文件。对于每个输入文件，将“含微核的双核细胞”群体的计数除以“双核细胞”群体的计数，再乘以100：
      双核细胞比例计算公式，细胞生物学，用于量化含微核的双核化细胞的方程。
  2. 计算细胞毒性
    1. 非Cyt-B方法：
      1. 根据初始细胞计数和处理后的细胞计数，首先计算每个样本的群体倍增数（PD）2：
        PD计算公式：处理后细胞数与初始细胞数的对数比值除以log 2，用于细胞增殖分析。
      2. 接着计算相对群体倍增数2：
        RPD百分比公式，用于量化处理组与对照组细胞培养物的相对生长情况。
      3. 最后计算每个样本的细胞毒性2：
        细胞毒性公式：细胞毒性 = 100 - RPD，适用于生物学数据分析。
    2. Cyt-B方法：
      1. 为计算分裂阻滞增殖指数（CBPI）2，使用来自class_count.csv文件中每个样本的单核、双核和多核细胞类别的计数：
        CBPI计算公式，用于核分裂分析；显示分裂阻滞增殖指数的计算方法。
      2. 为计算细胞毒性2，使用对照培养物（C）和暴露处理培养物（T）的CBPI值：
        细胞毒性公式，方程，毒理学研究中用于细胞活力分析的CBPI比值。

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结果

图1 展示了使用人工智能软件为微核（MN）检测建立模型的工作流程。用户将所需的 .daf 文件加载到人工智能软件中，然后利用AI辅助的聚类（图2）和预测（图3）标记算法，将对象分配至真实标注模型的类别中。当所有真实标注模型类别中均填入足够数量的对象后，即可使用随机森林（RF）或卷积神经网络（CNN）算法对模型进行训练。训练完成后，可通过类别分布直方图、准确率统计以及交互式混淆矩阵（图4）等工具评估模型性能。在人工智能软件的结果界面中，用户可选择返回工作流程的训练部分以进一步完善真实标注数据；若已达到足够的准确率，则可直接使用该模型对其他数据进行分类。

通过同时使用聚类和预测算法，共将190个片段中的285,000个对象分配至相应的真值类别，直至每个类别的图像数量达到1,500至10,000张。总计有31,500个对象（仅占初始加载对象的10.5%）被用于...

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讨论

本文介绍利用深度学习算法实现微核试验（MN assay）评分的自动化。最近多项研究表明，直观且交互式的工具能够创建深度学习模型，用于分析图像数据，而无需深入的计算专业知识18,19。本研究所描述的基于用户界面的软件方案专为高效处理超大数据文件而设计，可便捷地构建深度学习模型。文中详细讨论了在人工智能软件包中创建和训练RF和 CNN模型 所需的全部步骤，从而实现对Cyt-B和非Cyt-B两种版本试验中所有关键事件的高精度识别与定量分析。最后，还阐述了如何应用这些深度学习模型 对新数据进行分类，并评估化学物质的细胞毒性和微核频率。

本研究中使用的AI软件具备便捷的用户界面，可轻松处理由IFC系统生成的大型数据集。深度学习模型的训练、评估与优化遵循一种简单直接的迭代方法（图1），将训练好的模型应用于分类新数据仅需几个步骤即可完成。该软件包含独特的聚类（

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披露

作者就职于 DiaSorin 旗下的 Luminex Corporation 公司，该公司是本研究所用 ImageStream 成像流式细胞仪及 Amnis AI 软件的制造商。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
15 mL 离心管Falcon352096
清洁剂 - Coulter Clenz Beckman Coulter8546931用200 mL清洁剂填充容器。  https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/page/itemDetails?itemNumber=8546931#2/10//0/25/
1/0/asc/2/8546931///0/1//0/
秋水仙素MilliporeSigma64-86-8
康宁瓶顶式真空过滤器 MilliporeSigmaCLS4307690.22 µm 滤膜，500 mL 瓶
细胞松弛素BMilliporeSigma14930-96-25 mg 瓶装
去泡剂 - 70% 异丙醇MilliporeSigma1.3704用200 mL去泡剂填充容器。  http://www.emdmillipore.com/US/en/product/2-Propanol-70%25-%28V%2FV%29-0.1-%C2%B5m-filtred,MDA_CHEM-137040?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F
二甲基亚砜（DMSO）MilliporeSigma67-68-5
杜氏磷酸盐缓冲液 1XEMD MilliporeBSS-1006-BPBS Ca++MG++ 免费 
胎牛血清HyCloneSH30071.03
甲醛，10%，无甲醇，超纯Polysciences, Inc.04018此为用于4%和1%甲醛的溶液。注意：甲醛/福尔马林经吸入或吞咽有毒。  对眼睛、呼吸系统和皮肤有刺激性。  可能通过吸入或皮肤接触引起致敏。有严重损害眼睛的危险。  潜在致癌风险。  http://www.polysciences.com/default/catalog-products/life-sciences/histology-microscopy/fixatives/formaldehydes/formaldehyde-10-methanol-free-pure/
Guava Muse 细胞分析仪Luminex0500-3115采用标准配置的 Guava Muse Cell Analyzer。
Hoechst 33342Thermo FisherH357010 mg/mL 溶液
甘露醇MilliporeSigma69-65-8
MEM非必需氨基酸 100XHyCloneSH30238.01
MIFC - ImageStreamX Mark IILuminex，一家DiaSorin公司100220采用配备405 nm、488 nm和642 nm激光器的两相机ImageStreamX Mark II系统。
MIFC 分析软件 - IDEASLuminex，一家DiaSorin公司100220"图像分析软件"
MIFC（ImageStreamX MKII）的配套软件
MIFC 软件 - INSPIRELuminex，一家DiaSorin公司100220"图像采集软件"
这是运行MIFC（ImageStreamX MKII）的软件
Amnis AI 软件Luminex，一家DiaSorin公司100221"人工智能软件"
这是用于创建人工智能模型以分析数据的软件
丝裂霉素CMilliporeSigma50-07-7
NEAA混合液 100倍浓缩Lonza BioWhittaker13-114E
青霉素/链霉素/谷氨酰胺溶液 100XGibco15070063
氯化钾 (KCl)MilliporeSigmaP9541
冲洗——超纯水或去离子水NANA使用任何超纯水或去离子水。  用900 mL冲洗液填充容器。
RNaseMilliporeSigma9001-99-4
RPMI-1640 培养基 1xHyCloneSH30027.01
鞘液 - PBSMilliporeSigmaBSS-1006-B这与1×杜尔贝科磷酸盐缓冲液相同  Ca++MG++ 免费  向容器中加入 900 mL 鞘液。
无菌水HyCloneSH30529.01
灭菌器 - 0.4%–0.7% 次氯酸钠VWRJT9416-1这实际上是通过将 Clorox 漂白剂与水混合稀释制成的 10% Clorox 漂白液。  用200 mL消毒剂填充容器。
T25 培养瓶Falcon353109
T75 培养瓶Falcon353136
TK6细胞MilliporeSigma95111735

参考文献

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