方法文章

使用成像流式细胞术和人工智能实现微核检测自动化

DOI：

10.3791/64549

⸱

2023年1月27日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Amnis Flow Cytometry, Luminex Corporation

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

微核 （MN） 测定是量化 DNA 损伤的成熟测试。然而，使用常规技术（如手动显微镜或基于特征的图像分析）对测定进行评分既费力又具有挑战性。本文描述了开发人工智能模型以使用成像流式细胞术数据对 MN 测定进行评分的方法。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

微核（MN）测定在全球范围内被监管机构用于评估化学品的遗传毒性。该测定可以通过两种方式进行:在一次分裂、细胞分裂阻断的双核细胞或完全分裂的单核细胞中对 MN 进行评分。从历史上看，光学显微镜一直是对测定进行评分的金标准方法，但它既费力又主观。近年来，流式细胞术已被用于对测定进行评分，但由于无法直观地确认细胞图像的关键方面而受到限制。成像流式细胞术（IFC）结合了高通量图像捕获和自动图像分析，已成功应用于快速获取MN检测中所有关键事件的图像并对其进行评分。最近，已经证明，基于卷积神经网络的人工智能（AI）方法可用于对IFC获取的MN测定数据进行评分。本文介绍了使用 AI 软件创建深度学习模型以对所有关键事件进行评分并应用此模型自动对其他数据进行评分的所有步骤。AI 深度学习模型的结果与手动显微镜相比效果很好，因此可以通过结合 IFC 和 AI 实现 MN 检测的全自动评分。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

微核 （MN） 测定是遗传毒理学的基础，用于评估人类使用的化妆品、药品和化学品开发中的 DNA 损伤1，2，3，4。微核由整个染色体或染色体片段形成，这些染色体或染色体片段在分裂后不会合并到细胞核中，并凝结成与细胞核分离的小圆形体。因此，MN可用作量化遗传毒性检测中DNA损伤的终点1。

定量 MN 的首选方法是通过使用细胞松弛素-B （Cyt-B） 阻断分裂在一次分裂的双核细胞 （BNC） 内。在此版本的测定中，还通过评分单核（MONO）和多核（POLY）细胞来评估细胞毒性。该测定也可以通过在未阻塞的单核细胞中对MN进行评分来进行，该评分更快，更容易评分，并使用暴露前和暴露后的细胞计数来评估细胞毒性以评估增殖5，6。

历来通过手动显微镜进行检测的物理评分，因为这允许目视确认所有关键事件。然而，手动显微镜具有挑战性且主观1。因此，已经开发了自动化技术，包括显微镜载玻片扫描和流式细胞术，每种技术都有自己的优点和局限性。虽然玻片扫描方法允许可视化关键事件，但必须以最佳细胞密度创建载玻片，这可能难以实现。此外，这种技术通常缺乏细胞质可视化，这可能会影响单核细胞和POLY细胞7，8的评分。虽然流式细胞术提供高通量数据采集，但必须裂解细胞，因此不允许使用Cyt-B形式的测定。此外，作为一种非成像技术，传统的流式细胞术不能提供关键事件的视觉验证9，10。

因此，已经研究了成像流式细胞术（IFC）来执行MN测定。ImageStreamX Mk II 将传统流式细胞术的速度和统计稳健性与显微镜的高分辨率成像功能结合在一个系统中11.研究表明，通过使用IFC，可以使用基于特征的12，13或人工智能（AI）技术14，15捕获并自动评分所有关键事件的高分辨率图像。通过使用IFC进行MN测定，与显微镜相比，可以在更短的时间内自动对更多的细胞进行评分。

这项工作偏离了前面描述的图像分析工作流程16 ，并讨论了使用Amnis AI软件（以下简称"AI软件"）开发和训练随机森林（RF）和/或卷积神经网络（CNN）模型所需的所有步骤。描述了所有必要的步骤，包括使用人工智能辅助标记工具填充真实数据，解释模型训练结果，以及应用模型对其他数据进行分类，允许计算遗传毒性和细胞毒性15。

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方案

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. 使用成像流式细胞术采集数据

注意:请参考Rodrigues等人16 进行以下修改，注意使用IFC的采集区域可能需要修改以获得最佳图像捕获:

  1. 对于非Cyt-B方法，按照制造商的说明（参见 材料表）在培养前和恢复期后立即对每种培养物进行细胞计数。
  2. 如果在单相机成像流式细胞仪上运行样品，请将明场（BF）置于通道4中。将 M01 替换为 M04，将 M07 替换为 M01。
    注:"M"是指 IFC 上的摄像机通道。
  3. 采集过程中使用 40 倍放大倍率。
  4. 在采集过程中的BF面积与BF纵横比图上，使用以下区域坐标:
    X坐标:100和900;Y 坐标:0.7 和 1（Cyt-B 方法）
    X坐标:100和600;Y 坐标:0.7 和 1
  5. 在赫斯特强度图上，使用以下区域坐标:
    X坐标:55和75;Y 坐标:9.5 和 15（Cyt-B 方法）
    X坐标:55和75;Y 坐标:13 和 21（非 Cyt-B 方法）
  6. 要从数据中删除凋亡和坏死物体的图像，请启动IDEAS 6.3软件包（以下简称"图像分析软件";请参阅 材料表）。
    注意:AI 软件设计用于处理使用最新版本的图像分析软件处理的 .daf 文件。确保图像分析软件是最新的。
  7. 将此工作另存为模板 （.ast） 文件。

2. 为所有 .rif 文件创建 .daf 文件

  1. AI 软件仅允许导入 .daf 文件。通过批处理为试验中的所有 .rif 文件创建 .daf 文件。
  2. 在" 工具 "菜单下，单击 "批处理数据文件 "，然后单击" 添加批处理"。
  3. 在新窗口中，选择" 添加文件 "，然后选择要添加到批处理中的 .rif 文件。在 "选择模板或数据分析文件（.ast、.daf） "选项下，选择之前创建的 .ast 文件。
  4. 如果需要，请指定批处理名称，然后单击" 确定" 为所有加载的 .rif 文件创建 .daf 文件。

3. 在 AI 软件中创建实验

  1. 请参考图 1 中的流程 图 ，其中描述了使用 AI 软件创建深度学习模型的过程。
  2. 启动AI软件，并通过单击窗口左下角的 "关于 "确保安装了最新版本。如果未安装最新版本，请与 support@luminexcorp.com 联系以获取它。
  3. 软件中的默认屏幕是 "新建实验 "屏幕。使用 文件夹 图标选择保存实验的位置，然后键入实验的名称（例如，"MN 模型"）。
  4. 在"实验类型"下，单击"训练"旁边的单选按钮以启动训练实验，以开始构建 CNN 模型。单击下一步。
    1. 可选:如果之前已训练模型，则可以将其用作新 AI 模型的模板，并且可以从 "选择模板模型" 屏幕中选择为创建新模型的模板。如果不存在模板模型，只需单击 "下一步"跳过此步骤。
  5. 下一个屏幕是" 定义新模型 "屏幕。在" 模型"下，将自动填充在步骤 3.3 中为模型指定的名称。
    1. 在 "说明"下，键入模型的说明（可选），并将最大图像大小保留为 150 像素。
    2. 在"通道"下，单击"添加 BF"以将明场通道添加到列表中。在"名称"下，双击"明场"并将此通道重命名为 BF。单击"添加 FL"将荧光通道添加到列表中。在名称下，双击荧光并将此通道重命名为 DNA。
    3. 在" 类名"下，单击" 添加"。在弹出窗口中，键入 单核 并单击 确定。这会将单核类添加到类名列表中。重复此过程以确保在列表中定义了以下六个类:
      单核
      用 MN 单核
      双核
      与膜性肾病双核
      多核
      形态不规则
      单击 下一步。
      注意:这六个真实模型类将代表要评分的关键事件，以及形态与公认的评分标准5 不同的图像。
      1. 可选:如果需要，可以包含 1.7 中的分析模板以使用图像分析软件中的功能。如果要在 AI 模型中包括这些功能，请浏览 .ast 文件，然后从特定于通道的下拉列表中选择要包含的功能子集。
    4. 在 "选择文件"下，单击" 添加文件 "并浏览要添加到 AI 软件以构建真实数据所需的文件。单击 下一步。
      注意:添加多个数据文件（例如，阳性和阴性对照数据）非常重要，其中包含足够数量的所有关键事件。
  6. 接下来，在 "选择基本种群" 屏幕上，从种群层次结构中找到 非凋亡 种群。右键单击 非凋亡 群体，然后选择 选择所有匹配群体。单击 下一步。
    注意:重要的是要排除任何不应分类的人群（例如，珠子，碎片，双峰等）
  7. 此屏幕是 "选择真相人口" 屏幕。
    1. 如果尚未在图像分析软件中创建关键事件的标记真实人口，请单击 下一步。
    2. 如果已在影像分析软件中创建标记的真实人口，请将其分配给相应的模型类。
    3. 要使用 MN 分配单核细胞的标记真实群体，请单击左侧模型类下的单 核 MN 类 。然后单击右侧包含这些事件的相应标记真相人口。
    4. 如果已在多个数据文件中创建了标记的真值总体，请右键单击其中一个真值总体，然后选择" 选择所有匹配的总体" 以将多个文件中的标记总体添加到相应的类。
    5. 分配所有适当的真相总体后，单击 下一步。
  8. 在 "选择通道" 屏幕上，为实验选择适当的通道。在这里，将 BF 设置为通道 1，将 Hoechst 设置为通道 7。右键单击某个频道，然后选择" 全部应用"。单击 下一步。
  9. 最后，在 "确认 "屏幕上，单击" 创建实验"。
  10. AI 软件从数据文件加载图像，并使用步骤 3.7 中分配的地面实况影像创建步骤 3.5.3 中定义的模型类。点击 完成。
  11. 创建实验后，将显示五个选项:
    试验:提供试验的详细信息，包括加载的数据文件、选择的通道和定义的地面真实模型类。
    标记:启动标记工具，用户可以通过该工具填充真实数据。
    训练:根据地面真实数据训练模型。
    分类:使用经过训练的模型对数据进行分类。
    结果:提供训练实验和分类实验的结果。

4. 使用 AI 辅助标记工具填充真实数据

  1. 单击 标记 以启动标记工具界面。
    1. 单击缩放工具（放大镜图标）以裁剪图像以便于查看。
    2. 单击滑块以调整图像大小以更改图库中显示的图像数量。
    3. 单击" 显示设置 "选项，然后选择 最小-最大值，这将为识别所有关键事件提供最佳对比度图像。
    4. 单击 设置库显示 将DNA图像的颜色更改为黄色或白色，这将改善小物体（例如MN）的可视化。
  2. 单击 "聚类 "以运行算法，将具有相似形态的对象分组在一起。聚类分析完成后，每个聚类下的各个聚类以及每个聚类的对象数将显示在 "未知种群"下的列表中。选择各个分类以查看分类中的对象，并将这些对象分配给其相应的模型类。
  3. 将至少 25 个对象分配给每个模型类后， 预测 算法将变为可用。单击 预测。
    注意:不适合任何群体的对象仍被归类为 "未知"。随着更多对象被添加到真值总体中，预测精度也会提高。
  4. 继续使用适当的影像填充真实地面模型类，直到每个类中的对象数量达到足够数量。
  5. 将至少 100 个对象分配给每个模型类后，单击屏幕顶部的 "训练 "选项卡。单击 "训练 "按钮，使用随机森林和 CNN 算法创建模型。
    注意:AI 软件使用随机森林和 CNN 算法创建模型，复选框仅允许使用 CNN 算法的随机森林创建模型。

5. 评估模型准确性

  1. 模型训练完成后，单击 查看结果。
  2. 使用结果屏幕评估模型准确性。使用下拉菜单在随机森林和CNN之间切换。
    注意:可以更新真值总体，并且可以重新训练模型或按原样使用模型来对其他数据进行分类。
    1. 要更新真相人口，请单击顶部的 标记 并遵循第 4 节。

6. 使用模型对数据进行分类

  1. 启动 AI 软件。默认屏幕为 "新建实验 "屏幕。使用 "文件夹 "图标选择保存实验的位置并键入实验的名称。
  2. 在实验类型下，单击分类旁边的单选按钮以启动分类实验。单击下一步。
  3. 单击要用于分类的模型，然后单击" 下一步"。
  4. 在 "选择 文件"屏幕上，单击" 添加文件 "并浏览要按 CNN 模型分类的文件。单击 下一步。
  5. 接下来，在" 选择碱基群体" 屏幕上，单击其中一个加载文件中 "非凋亡 群体"旁边的复选框。右键单击 非凋亡 群体，然后单击选择所有匹配群体以从所有加载的文件中 选择此群体 。单击 下一步。
  6. 可选:如果要分类的数据包含真值总体，则可以在选择真值总体屏幕上将其分配给相应的模型类。否则，请单击"下一步"跳过此步骤。
  7. 在"选择通道 " 屏幕上，选择 通道 1 作为明场，选择 通道 7 作为 DNA 染色。右键单击某个频道，然后单击" 全部应用"。然后点击 下一步。
  8. 最后，在 "确认 "屏幕上，单击" 创建实验"。AI软件从所选数据文件中加载所选模型和所有图像。点击 完成。
  9. 单击 分类 以启动分类屏幕。单击 分类 按钮。这将开始使用 RF 和 CNN 模型对其他数据进行分类并标识属于指定模型类的所有对象的过程。
    注意: 复选框可用于选择 RF 型号和/或 CNN 型号。
  10. 分类完成后，单击查看 结果。
  11. 单击 更新 DAF 按钮以显示 使用分类结果更新 DAF 窗口。单击 "确定 "以更新 .daf 文件。

7. 生成分类结果报告

  1. 在" 结果 "屏幕上，单击" 生成报告"。如果需要为每个输入 DAF 提供单独的报告，请选中"为每个 输入 DAF 创建报告 "旁边的复选框。单击 确定。
  2. 完成后，打开保存报告文件的文件夹。在该文件夹中，有一个实验.pdf报表和一个 资源 文件夹。
  3. 打开.pdf以查看报告。该报告包含模型和实验信息、输入 .daf 文件列表、表格和直方图格式的类计数和类百分比，以及汇总所有输入 .daf 文件中预测概率中位数的混淆矩阵。
  4. 打开 "资源 "文件夹，然后打开 CNN 文件夹。此文件夹中.png类计数和百分比条形图的文件，以及混淆矩阵。此外，还有.csv文件，其中包含每个输入文件的类计数和百分比。

8.确定膜性肾病频率和细胞毒性

  1. 计算 MN 频率
    1. 非 Cyt-B 方法:要确定 MN 频率，请打开步骤 7.4 中的class_count.csv文件。对于每个输入文件，将"MN 单核"群体中的计数除以"单核"群体中的计数并乘以 100:
      figure-protocol-1
    2. Cyt-B 方法:要确定 MN 频率，请打开步骤 7.4 中的class_count.csv文件。对于每个输入文件，将"MN 双核"总体中的计数除以"双核"总体中的计数，然后乘以 100:
      figure-protocol-2
  2. 计算细胞毒性
    1. 非Cyt-B方法:
      1. 使用初始细胞计数和处理后细胞计数，首先计算每个样品2 的群体倍增 （PD）:
        figure-protocol-3
      2. 接下来，计算相对总体加倍2:
        figure-protocol-4
      3. 最后，计算每个样品的细胞毒性2 :
        figure-protocol-5
    2. Cyt-B方法:
      1. 要计算细胞分裂-阻断增殖指数 （CBPI）2，请使用 class_count.csv 文件中每个样品的单核、双核和多核类别中的计数:
        figure-protocol-6
      2. 要计算细胞毒性2，请使用对照培养物（C）和暴露培养物（T）的CBPI:
        figure-protocol-7

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结果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

图 1 显示了使用 AI 软件创建 MN 检测模型的工作流程。用户将所需的 .daf 文件加载到 AI 软件中，然后使用 AI 辅助集群（图 2）和预测（图 3）标记算法将对象分配给真实模型类。一旦所有真实模型类都填充了足够的对象，就可以使用 RF 或 CNN 算法训练模型。训练后，可以使用包括类分布直方图、准确性统计和交互式混淆矩阵在内的工具来评估模型的性能（图 4）。从AI软件的结果屏幕中，用户可以返回到工作流的训练部分以增强真实数据，或者，如果已达到足够的精度，则用户可以使用该模型对其他数据进行分类。

使用聚类和预测算法，将总共 285，000 个对象的 190 个段分配给适当的真实地面类，直到所有类填充了 1，500 到 10，000 个图像。总共使用了 31，500 个对象（仅占加载初始对象的 10.5%）用于该模型的训练。深度学习软件...

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讨论

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

这里介绍的工作描述了使用深度学习算法来自动对 MN 测定进行评分。最近的几篇出版物表明，直观的交互式工具允许创建深度学习模型来分析图像数据，而无需深入的计算知识18，19。这项工作中描述的协议使用用户界面驱动的软件包，旨在很好地处理非常大的数据文件，并允许轻松创建深度学习模型。讨论了在AI软件包中创建和训练RF和CNN模型的所有必要步骤，从而可以高度准确地识别和量化Cyt-B版本测定中的所有关键事件。最后，描述了使用这些深度学习模型对其他数据进行分类并评估化学细胞毒性和 MN 频率的步骤。

这项工作中使用的人工智能软件具有方便的用户界面，并且可以轻松处理从IFC系统生成的大型数据集。深度学习模型的训练、评估和增强遵循简单的迭代方法（图 1），只需几个步骤即可应用经过训练的模型对其他数据进行分类。该软件包含独特的集群（图 2）和预测（

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披露

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者受雇于DiaSorin公司Luminex公司，该公司是ImageStream成像流式细胞仪和这项工作中使用的Amnis AI软件的制造商。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
15 mL 离心管Falcon352096
洁面乳 - Coulter Clenz 贝克曼库尔特8546931在容器中装满 200 毫升清洁剂。https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/page/itemDetails?itemNumber=8546931#2/10//0/25/
1/0/asc/2/8546931///0/1//0/
秋水仙碱MilliporeSigma64-86-8
康宁瓶顶真空过滤器 MilliporeSigmaCLS4307690.22 µm 过滤器，500 mL 瓶
细胞松弛素 BMilliporeSigma14930-96-25 mg 瓶
除泡剂 - 70% MilliporeSigma1.3704用 200 mL 除泡剂装满容器 http://www.emdmillipore.com/US/en/product/2-Propanol-70%25-%28V%2FV%29-0.1-%C2%B5m-filtred,MDA_CHEM-137040?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F。
MilliporeSigma67-68-5
Dulbecco 磷酸盐缓冲盐水 1XEMD MilliporeBSS-1006-BPBS Ca++MG++ 免费 
胎牛血清HyCloneSH30071.03
甲醛，10%，不含甲醇，超纯Polysciences， Inc.04018这是用于 4% 和 1% 福尔马林的成分。注意：福尔马林/甲醛吸入和吞咽有毒。刺激眼睛、呼吸系统和皮肤。吸入或皮肤接触可能引起致敏。有严重损伤眼睛的风险。潜在的癌症危害。http://www.polysciences.com/default/catalog-products/life-sciences/histology-microscopy/fixatives/formaldehydes/formaldehyde-10-methanol-free-pure/
Guava Muse 细胞分析仪Luminex0500-3115使用标准配置的 Guava Muse 细胞分析仪。
Hoechst 33342Thermo FisherH357010 mg/mL 溶液
甘露醇MilliporeSigma69-65-8
MEM 非必需氨基酸 100XHyCloneSH30238.01
MIFC - ImageStreamX Mark IILuminex 是一家 DiaSorin 公司100220使用配备 405 nm、488 nm 和 642 nm 激光器的 2 相机 ImageStreamX Mark II。
MIFC 分析软件 - IDEASLuminex，DiaSorin 公司100220"图像分析软件"
MIFC （ImageStreamX MKII） 的配套软件
MIFC 软件 - INSPIRELuminex，DiaSorin 公司100220"图像采集软件"
这是运行 MIFC （ImageStreamX MKII）
Amnis AI 软件Luminex（DiaSorin 公司）的软件100221"AI 软件"
这是允许创建人工智能模型来分析数据的软件
丝裂霉素 CMilliporeSigma50-07-7
NEAA 混合物 100xLonza BioWhittaker13-114E
青霉素/链霉素/谷氨酰胺溶液 100XGibco15070063
氯化钾 （KCl）MilliporeSigmaP9541
冲洗液 - 超纯水或去离子水NANA 使用任何超纯水或去离子水。在容器中装满 900 mL 的冲洗液。
RNaseMilliporeSigma9001-99-4
RPMI-1640培养基1xHyCloneSH30027.01
鞘 - PBSMilliporeSigmaBSS-1006-B这与Dulbecco的磷酸盐缓冲盐水1x相同 Ca++MG++免费。用 900 mL 的护套填充容器。
无菌水HyCloneSH30529.01
灭菌器 - 0.4%–0.7% 次氯酸盐VWRJT9416-1这是大约 10% 的 Clorox 漂白剂，可以通过用水稀释 Clorox 漂白剂制成。用 200 mL 灭菌器填充容器。
T25 培养瓶Falcon353109
T75 培养瓶Falcon353136
TK6 细胞MilliporeSigma95111735
装 装

参考文献

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