Ixodes scapularis 的蜱人工膜饲喂

摘要

本文介绍了一种对蜱虫进行血液饲喂的方法 体外通过 一种人工膜系统，可用于多种蜱虫生活阶段的部分或完全饱血。

摘要

蜱虫及其相关疾病因其对公共卫生和兽医领域的重要影响而成为重要的研究课题。然而，在研究和饲养过程中，蜱虫的取食需求可能限制实验设计的范围，或影响实验室对蜱虫及其相关病原体的研究能力。人工膜饲喂系统可减轻这些问题，并为研究开辟新的途径，而这些研究在传统动物饲喂系统下可能无法实现。本研究描述了一种经过优化的人工膜饲喂系统，可成功实现全生命周期的Ixodes scapularis（肩突硬蜱）的饲喂与饱血。此外，通过简单调整所需膜的厚度，本研究中描述的人工膜饲喂系统还可改造用于其他蜱种。人工膜饲喂系统的优势需与系统的高劳动强度、可能影响饲喂成功率的额外环境因素，以及针对每一种新蜱种和不同发育阶段均需优化技术等挑战相权衡。

引言

蜱传疾病对全球人类和动物的健康造成严重影响，2004年至2016年间在美国导致的病例占所有媒介相关疾病的三分之二以上¹。此外，近年来病例数量持续上升，越来越多的人和家畜受到蜱虫及其相关疾病的侵袭^2,3。尽管病例增长趋势可能由多种因素引起，但气候变化是一个重要因素^3,4。预计蜱传疾病病例数将持续增加，这凸显了开发新工具以研究蜱虫与其传播病原体之间关系的迫切需求。

已知蜱虫在吸血过程中会发生生理和基因表达的变化，这些变化在病原体传播中起着重要作用^5,6。使用动物模型研究完全或部分吸血对病原体传播和获取的影响可能较为困难，尤其是在啮齿类动物模型对特定病原体不易感的情况下。例如，Anaplasma phagocytophilum Variant-1 菌株在自然界中可在Ixodes scapularis蜱和鹿之间传播，但无法感染小鼠，这给实验室中蜱的感染研究带来了困难⁷。人工喂食系统也可用于研究某些病原体，例如通过使用基因缺失导致传播或感染受阻的转基因突变体来研究Borrelia burgdorferi⁸。采用人工喂食系统有助于研究人员分离基因的作用，因为该系统可使感染或传播仅发生在蜱的一侧，从而排除可能干扰研究结果的宿主反应。

类似地，参与疾病传播和动物宿主感染的某些蜱虫生活阶段可能无法在常见的实验室模式动物上诱导吸血。Ixodes scapularis 雌性蜱虫通常需要在较大的动物（如兔子）身上吸血⁹。尽管兔子在实验室实验中较易获得，但其管理和饲养要求高于小型啮齿类动物，可能使部分实验室难以实施。其他蜱种，特别是具有兽医重要性的种类，必须在牛或其他大型动物身上吸血，而这些动物在大多数实验室中并不适合使用。体外喂养与感染方法（如人工膜喂养）为避免使用大型或非常规宿主动物提供了替代方案。

此外，使用人工喂养系统可以实现某些传统动物喂养方法无法完成的分析。例如，通过将血液来源与喂养机制分离，可以研究不同宿主血液在B. burgdorferi传播过程中可能发挥的作用¹⁰。在排除宿主免疫反应的情况下，对宿主血液本身及其作用进行考察，是理解病原体传播循环的重要因素，而人工喂养系统有助于解答这一问题¹¹。此外，还可以在喂养过程中精确量化病原体的传播数量，而不仅仅是观察病原体在宿主体内的传播成功与否及其定植情况^8,12。

20世纪50年代和60年代，为硬蜱开发的一些最早的人工饲喂膜采用动物皮肤或动物源性膜材料制成^13,14。由于这些膜具有生物学特性，在新膜的制备和保存期限方面均存在诸多问题。20世纪90年代，人们开发出完全人工合成的膜，其以网状物、纸张或织物为基底，并浸渍硅酮^15,16。硅酮因其物理特性与皮肤的弹性及轻微黏性相似，且具有非生物惰性，成为理想材料。在此基础上，Krober 和 Guerin（本技术所依据的研究者）描述了一种用于I. ricinus人工饲喂的硅酮浸渍人造纤维膜饲喂技术¹⁷。

对近缘物种 I. scapularis 的方法优化导致了在膜浸渍所用硅胶的硬度、膜制备配方、饲喂腔室尺寸以及附着刺激剂方面存在显著差异。尽管本研究中报道的优化所获得的膜特性与 Andrade 等人报道的结果相似——后者同样基于 Krober 和 Guerin 的方法开发了用于 I. scapularis 的硅胶膜——但在硅胶浸渍步骤上存在差异，这使得本方案可灵活应用于 I. scapularis 的未成熟发育阶段^15,18。本研究还描述了基于该方法反复使用所积累的补充内容和技术改进，包括确保成功饲喂的最佳操作规范，以及对可能出现问题的排查与解决。该方法已被用于饲喂所有活跃发育阶段的蜱虫，感染病原菌，并暴露于多种剂量的抗生素^19,20。尽管文中展示的人工膜饲喂法针对 I. scapularis，但通过微调膜厚度，该方法可轻松适用于其他蜱类物种。

方案

1. 准备受蜱膜室

1. 准备一个平整、无孔的表面，例如臂架的玻璃或陶瓷涂层金属底座，用70%乙醇擦拭后，覆盖一层塑料保鲜膜，确保保鲜膜平整，无气泡或褶皱（见图1A）。
2. 将100%人造丝镜头清洁纸用胶带固定在已准备好的表面上，确保纸张平整并在四边用胶带轻微拉紧。两张4英寸×6英寸的镜头纸可按照步骤1.3所述体积制成膜材料。
   注意：这足以制作最多12个饲喂腔室（见图1B）。若膜用于幼蜱，应使用云龙纸代替镜头清洁纸。
3. 通过量取硅胶试剂盒的A、B组分各5 mL至一次性容器中，先轻轻混合两种液体，再加入1.5 mL正己烷，继续搅拌直至混合物均匀且充分混合，制备00-10硬度的硅胶混合液。
   注意：若制作成蜱用膜，应使用00-50硬度的硅胶。
4. 使用小型刮刀将硅胶混合物均匀涂布于镜头纸上。静置1分钟，确保硅胶充分渗透镜头纸。用刮刀施加轻微向下的压力，稳定地将多余硅胶刮至一侧。再进行第二次刮涂，此次不施加向下压力，以消除硅胶条纹，形成光滑的膜层。
   注意：该步骤可能需要一定练习，以制备出适合各发育阶段的最佳膜厚度（成虫：150–200 µm；若虫：90–120 µm；幼虫：80–100 µm）。在各发育阶段的饲喂耐受范围内，较厚的膜通常效果更佳，可减少腔室内的冷凝并增强膜的自愈特性。
5. 仅针对幼虫，将饲喂腔室顶部多次浸入Fluon氟聚合物树脂（PTFE-30）中，每次浸涂后待其干燥，以形成均匀涂层。
   注意：涂布Fluon可形成类似不粘锅的防粘附氟聚合物树脂层，从而减少幼虫爬至腔室顶部的数量²¹。
6. 将膜置于无尘环境中（如密闭的化学通风柜或生物安全柜）至少固化24小时，再进行下一步操作。参见图1C了解硅胶干燥后人造丝镜头纸的外观。
7. 通过等量混合硅胶A和B组分，制备30硬度的硅胶混合物，用于将腔室固定在膜上。
8. 将聚碳酸酯腔室浸入硅胶混合物约1/4英寸（6 mm），然后放置在膜片上，注意避免与胶带重叠（图1D）。
9. 使粘接用硅胶至少固化24小时后，再进行后续步骤。
10. 使用手术刀，小心地在每个已固定的腔室周围切割膜片，修整边缘，使其能平滑地嵌入6孔板的孔中，避免与孔壁产生过多摩擦（图1E）。腔室外部应保留足够膜材料，以最大化膜的粘附性。
    注意：若外部膜材料过多，反复将腔室从6孔板中取出可能导致膜部分脱离腔室。膜脱离的修复方法见第5节。
11. 从膜片的每个角落及中心位置裁取一小块剩余膜材料，去除其下的塑料保鲜膜。使用千分尺测量这些样品，以确定平均膜厚度。
    注意：若膜厚度不在对应发育阶段的容差范围内（见步骤1.4），应弃用并重新制备。由于云龙纸纤维粗细不均，存在厚区与薄区，其厚度变异性较大。尽管这一特性有助于幼虫寻找最佳厚度区域，但难以准确测定实际膜厚度。
12. 将饲喂腔室及每个腔室配套的一个O型圈放入玻璃烧杯中，于121 °C高压灭菌至少20分钟以实现灭菌。待腔室冷却后再使用。

2. 设置蜱虫饲喂

1. 准备一盏灯或一个房间，使光照持续16小时，随后关闭光源8小时。若使用灯照明，请确保下一步中的水浴在8小时黑暗期间处于无光环境中。
2. 设置一个34 °C的水浴，并配备支撑装置，使6孔板能够放置其中并轻微漂浮。可将小型玻璃烧杯沉入水浴中作为支撑。使用透明盖子覆盖水浴，以维持蜱虫的光-暗循环；如有需要，可使用T型支架和塑料薄膜制作盖子。为降低污染风险，向水浴中加入0.02%的苯扎氯铵，并另设一个36 °C的水浴用于预热冷藏的血液。
3. 取出预先准备并已高压灭菌的膜室，在膜室周围装上O型圈（图1F），然后向每个膜室中加入足量70%乙醇，以完全覆盖膜表面。将膜室置于6孔板的孔中静置5分钟，随后检查膜室与膜之间以及膜本身是否存在泄漏。
   注意：若膜发生泄漏，乙醇会积聚在孔底。有泄漏的膜应予以丢弃。
4. 倒出膜室中的乙醇，然后在生物安全柜或层流罩内自然晾干。
   注意：干燥时间可能需数分钟，具体取决于环境湿度。
5. 在等待期间，将血液在56 °C加热40分钟以灭活补体，并向机械去纤维蛋白的牛血中添加2 g/L葡萄糖。
6. 待膜完全干燥后，向膜室内表面加入约20 µL促吸食剂，通过倾斜膜室使其均匀覆盖整个表面。有关使用蜱虫粪便制备促吸食剂的操作说明，请参见第6节。
7. 待促吸食剂完全干燥后，使用毛刷或镊子将蜱虫转移至膜室内。转移过程中应尽可能迅速，以防蜱虫逃逸。可在转移前将蜱虫置于冰上1–2分钟，以减缓其活动能力。完成转移后，用封口膜密封顶部；切勿过度拉伸封口膜，以免水浴热量导致其破裂。
   注意：镊子适用于若虫和成虫阶段的蜱虫操作，而毛刷则更适合幼虫阶段。
8. 每孔/膜室取5 mL灭活后的血液，加入锥形管中，并置于36 °C水浴中预热。在将蜱虫暴露于血液前，应先将冷藏血液恢复至至少室温。每个6孔板预留四个膜室以便于操作。然而，根据水浴尺寸，应避免在单个板上放置过多膜室，但可增加使用更多板。
9. 向每5 mL血液中加入5 µL 3 mM ATP以及50 µL 100倍浓度的青霉素/链霉素/两性霉素B储备液。
10. 将4.5 mL血液转移至6孔板的一个孔中，然后轻轻将膜室放入孔内，调节膜室上的O型圈高度，使膜浸入血液中，但血液液面在膜室外侧不高于孔壁边缘。将膜室以倾斜角度放入血液中，以避免血液与膜之间形成气泡。
    注意：图2展示了已完成组装的6孔板。
11. 将6孔板的盖子盖在喂养膜室上方，然后将装有膜室的6孔板放入已预热至34 °C的水浴中，并盖上水浴盖。
    ​注意：上方的6孔板盖子有助于防止冷凝水接触封口膜，从而避免孔内血液被稀释。

3. 每12小时更换一次血液以维持喂食蜱虫

1. 将灭活的血液每孔5 mL分装至离心管中，并在36 °C水浴中预热。同时在水浴中解冻ATP以及青霉素/链霉素/制霉菌素混合液。
2. 向每孔血液管中加入5 µL的3 mM ATP和50 µL的100倍浓缩青霉素/链霉素/制霉菌素储备液。将4.5 mL血液转移至新的6孔板的每个孔中。
3. 从水浴中取出带有蜱虫培养室的6孔板。将培养室从孔中取出，用10 mL无菌1×PBS冲洗培养室外壁和膜的外表面，以去除残留血液。
4. 使用经高压灭菌的滤纸轻轻吸干膜和培养室表面，去除多余的PBS。更换培养室顶部的封口膜。若培养室内壁有大量冷凝水，需先用高压灭菌滤纸吸干湿润区域，再用新的封口膜密封。
5. 将蜱虫培养室放入含有新鲜血液的新6孔板中，必要时调整O型圈的高度。对板上每个培养室重复步骤3.3–3.5。将6孔板盖盖在各培养室上方。将新的6孔板放回34 °C水浴中。
6. 每12小时重复一次步骤3.1–3.5，直至蜱虫取食结束。待蜱虫吸血饱和后自然脱离膜表面，或在仍附着于膜时用轻触镊子小心取下，以获得部分吸血的蜱虫。

4. 抗真菌治疗

注意：仅当在膜上观察到真菌生长时进行此操作。如果饲血时间足够长，真菌可能在膜的血液侧形成。真菌污染的最初迹象是膜上出现微小的（1–3 mm）凝结血片。一旦发现真菌污染，可采用抗真菌处理以延长实验持续时间并提高饱血成功率。

1. 将制霉菌素每毫升 10,000 U 溶于蒸馏水中，每个饲喂室加入 5 mL。使用 0.1 µm 注射器滤器过滤除菌。
2. 在新的 6 孔板中，每孔加入 5 mL 制霉菌素溶液，每个饲喂室对应一孔。
3. 将经 PBS 漂洗的饲喂室放入溶液中，静置 10 分钟。
4. 处理后的膜在重新放入新鲜血液前，需用 PBS 漂洗。
5. 每 2–3 天重复一次抗真菌处理（根据真菌污染程度决定），直至实验结束。

5. 使用氰基丙烯酸酯胶水重新粘附脱落的膜

注意：仅在观察到膜脱落时进行。

1. 在从6孔板取出时，膜可能会部分从灌注室脱落。如果发生这种情况，用PBS冲洗膜上的血液。
2. 轻轻擦干受影响区域。不需要完全干燥，但水分的存在会使胶水更快固化。
   注意：重新粘附膜会缩短操作时间，但根据脱落面积的大小，较快的固化时间可能是可取的。
3. 将少量氰基丙烯酸酯胶水挤入膜从灌注室脱离形成的缝隙中。固定约2分钟，使胶水固化。
4. 将灌注室重新放回6孔板的血液中。

6. 制备取食刺激剂

注意：在喂食结束时或在膜喂食开始前进行。

1. 从先前的膜饲法实验或其他喂养蜱虫的来源收集蜱虫粪便。在制备促食剂之前，将粪便储存于 -20 °C。研碎粪便颗粒，每 0.1 g 粪便加入 1 mL 水。添加 1 mM 三肽还原型谷胱甘肽，溶解后充分涡旋混匀。
2. 使用 0.1 µm 注射器滤器过滤除菌。
3. 于 -20 °C 冻存，待用时取出。

结果

成功吸血取决于是否需要部分或完全饱血。成功吸血后的成年I. scapularis会呈现钢灰色，并会自行从膜上脱落。然而，如果蜱虫至少达到豌豆大小，则可在结束喂养时将其从膜上取下。对于I. scapularis的未成熟阶段，完全饱血蜱的大小存在差异，且与成虫不同，它们不会发生明显的颜色变化，因此脱落是判断蜱是否完全饱血的最佳方式。参见图3，了解若虫期I. scapularis在吸血过程中的外观示例。成年I. scapularis蜱从附着到开始从膜上脱落通常需要1周或更长时间；若虫通常在附着后约5天脱落，而幼虫则在首次附着后约3–4天开始脱落。只要能够维持每日两次的血液更换，并且霉菌生长未超出抗真菌处理的控制范围，喂养可继续进行。部分饱血的蜱需手动从膜上取下。

脱离膜的未成熟蜱虫（幼虫和若虫）几乎总能成功蜕皮进入下一生活阶段，只要其吸血充分且体型足够大，即使是在吸血结束时被手动从膜上取下，也能蜕皮。在吸血过程中变为钢灰色的雌性蜱虫通常能成功产卵。然而，与自...

讨论

人工膜饲喂蜱虫为多种实验操作提供了有用的工具，但不太可能在所有应用中取代动物饲喂。若不依赖动物饲喂，通常难以维持涵盖所有生活阶段的大型蜱虫种群。相反，人工饲喂系统在其他方面具有重要价值，例如：用模式宿主无法支持的病原体感染蜱虫，在简化的饲喂环境中评估特定剂量的化合物或微生物对蜱虫的影响，或饲养依赖于实验室中不易获得的宿主动物的小型蜱虫种群^{8,10,11,23,24,25}。与传统的动物饲喂方法相比，人工膜饲喂劳动强度较高，并面临诸多技术挑战^15,24。正因如此，人工膜饲喂并非传统动物饲喂方法的替代方案，而是使那些无法通过传统动物饲喂...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
00-10 硬度硅胶	Smooth-On	Ecoflex 00-10	来自 Smooth-On 商店的试用装
00-50 硬度硅胶	Smooth-On	Ecoflex 00-50	来自 Smooth-On 商店的试用装
30 硬度硅胶	Smooth-On	Mold Star 30	来自 Smooth-On 商店的试用装
6 孔细胞培养板	Corning Incorporated	3516
三磷酸腺苷（ATP）	Millipore Sigma	A1852-1VL	用于配制经 0.2 微米滤膜过滤除菌的 3 mM ATP 水溶液
牛血	HemoStat	DBB500	机械去纤维蛋白处理；通常 500 mL 足以用于一次实验
保鲜膜	Fisherbrand	22-305654
滤纸	Fisherbrand	09-790-2C	使用前需高压灭菌并冷却。也可使用精细级替代中等质量
氟龙（水性聚四氟乙烯）	Bioquip	2871	也可从其他来源获取，例如 https://canada-ant-colony.com/products/fluon-ptfe-10ml
葡萄糖	Millipore Sigma	G8270-100G
己烷	Millipore Sigma	139386-100ML
镜头纸	Fisherbrand	11-995	100% 莱赛尔纤维
制霉菌素	Gold Biotechnology	N-750-10
封口膜	Fisherbrand	S37440
青霉素/链霉素/两性霉素B	Gibco	15240-096	或等效通用产品，浓度如下：青霉素 10,000 单位/mL，链霉素 10,000 µg/mL，两性霉素B 25 µg/mL
取食刺激剂	实验室自制		从前次蜱虫取食中收集获得
聚碳酸酯管	McMaster-Carr	8585K204	切割为 45 mm 长，外径 1.25 英寸，内径 1 英寸。切割需使用切削砂轮锯。
橡胶O型圈	McMaster-Carr	9452K38	厚度 5 mm，内径 1.25 英寸
软头镊子	VWR	470315-238
超级胶水			氰基丙烯酸酯胶
云龙纸	美术用品商店		构树纤维 10 g/m2。购于美国明尼苏达州圣保罗市 Wet Paint 美术用品商店