本文介绍了一种对蜱虫进行血液饲喂的方法 体外通过 一种人工膜系统，可用于多种蜱虫生活阶段的部分或完全饱血。
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本文内容
摘要
摘要
蜱虫及其相关疾病因其对公共卫生和兽医领域的重要影响而成为重要的研究课题。然而，在研究和饲养过程中，蜱虫的取食需求可能限制实验设计的范围，或影响实验室对蜱虫及其相关病原体的研究能力。人工膜饲喂系统可减轻这些问题，并为研究开辟新的途径，而这些研究在传统动物饲喂系统下可能无法实现。本研究描述了一种经过优化的人工膜饲喂系统，可成功实现全生命周期的Ixodes scapularis（肩突硬蜱）的饲喂与饱血。此外，通过简单调整所需膜的厚度，本研究中描述的人工膜饲喂系统还可改造用于其他蜱种。人工膜饲喂系统的优势需与系统的高劳动强度、可能影响饲喂成功率的额外环境因素，以及针对每一种新蜱种和不同发育阶段均需优化技术等挑战相权衡。
引言
蜱传疾病对全球人类和动物的健康造成严重影响，2004年至2016年间在美国导致的病例占所有媒介相关疾病的三分之二以上1。此外，近年来病例数量持续上升，越来越多的人和家畜受到蜱虫及其相关疾病的侵袭2,3。尽管病例增长趋势可能由多种因素引起，但气候变化是一个重要因素3,4。预计蜱传疾病病例数将持续增加，这凸显了开发新工具以研究蜱虫与其传播病原体之间关系的迫切需求。
已知蜱虫在吸血过程中会发生生理和基因表达的变化，这些变化在病原体传播中起着重要作用5,6。使用动物模型研究完全或部分吸血对病原体传播和获取的影响可能较为困难，尤其是在啮齿类动物模型对特定病原体不易感的情况下。例如，Anaplasma phagocytophilum Variant-1 菌株在自然界中可在Ixodes scapularis蜱和鹿之间传播，但无法感染小鼠，这给实验室中蜱的感染研究带来了困难7。人工喂食系统也可用于研究某些病原体，例....
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方案
1. 准备受蜱膜室
- 准备一个平整、无孔的表面，例如臂架的玻璃或陶瓷涂层金属底座，用70%乙醇擦拭后，覆盖一层塑料保鲜膜，确保保鲜膜平整，无气泡或褶皱（见图1A）。
- 将100%人造丝镜头清洁纸用胶带固定在已准备好的表面上，确保纸张平整并在四边用胶带轻微拉紧。两张4英寸×6英寸的镜头纸可按照步骤1.3所述体积制成膜材料。
注意：这足以制作最多12个饲喂腔室（见图1B）。若膜用于幼蜱，应使用云龙纸代替镜头清洁纸。 - 通过量取硅胶试剂盒的A、B组分各5 mL至一次性容器中，先轻轻混合两种液体，再加入1.5 mL正己烷，继续搅拌直至混合物均匀且充分混合，制备00-10硬度的硅胶混合液。
注意：若制作成蜱用膜，应使用00-50硬度的硅胶。 - 使用小型刮刀将硅胶混合物均匀涂布于镜头纸上。静置1分钟，确保硅胶充分渗透镜头纸。用刮刀施加轻微向下的压力，稳定地将多余硅胶刮至一侧。再进行第二次刮涂，此次不施加向下压力，以消除硅胶条纹，形成光滑的膜层。
注意：该步骤可能需要一定练习，以制备出适合各发育阶段的最佳膜厚度（成虫：150–200 µm；若虫：90–120 µm；幼虫：80–100 µm）。在各发育阶段的饲喂耐受范围内，较厚的膜通常效果更佳，可减少腔室内的冷凝并增强膜的自愈特....
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结果
成功摄食取决于是否需要部分或完全饱食。成功摄食后的成年I. scapularis会呈现钢灰色，并会自行从膜上脱落。然而，若其体积至少达到豌豆大小，则可在结束饲喂时手动将其从膜上移除。对于I. scapularis的未成熟阶段，完全饱食蜱虫的大小存在差异，且与成虫不同，它们不会发生明显的颜色变化，因此脱落是判断蜱虫是否完全饱食的最佳方式。参见图3，了解若虫阶段I. scapularis在摄食过程中的外观示例。成年I. scapularis蜱虫从附着到开始脱落通常需要1周或更长时间；若虫通常在附着后约5天脱落，而幼虫则在首次附着后约3–4天开始脱落。只要能够维持每日两次的血液更换，并且霉菌生长程度仍在抗真菌处理可控制范围内，饲喂可继续进行。部分饱食的蜱虫需手动从膜上分离。
脱离膜的未成熟蜱虫（幼虫和若虫）几乎总能成功蜕皮进入下一生活阶段，只要其吸血充分且体型足够大，即使在吸血结束时被手动从膜上取下，也能完成蜕皮。在吸血过程中变为钢灰色的雌性蜱虫通常能够成功.......
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讨论
人工膜饲喂蜱虫为多种实验操作提供了有用的工具，但不太可能在所有应用中取代动物饲喂。若不依赖动物饲喂，通常难以维持涵盖所有生活阶段的大型蜱虫种群。相反，人工饲喂系统在其他方面具有重要价值，例如：用模式宿主无法支持的病原体感染蜱虫，在简化的饲喂环境中评估特定剂量的化合物或微生物对蜱虫的影响，或饲养依赖于实验室中不易获得的宿主动物的小型蜱虫种群8,10,11,23,24,25。与传统的动物饲喂方法相比，人工膜饲喂劳动强度较高，并面临诸多技术挑战15,24。正因如此，人工膜饲喂并非传统动物饲喂方法的替代方案，而是使那些无法通过传统动物饲喂.......
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 00-10 硬度硅胶 | Smooth-On | Ecoflex 00-10 | 来自 Smooth-On 商店的试用装 |
| 00-50 硬度硅胶 | Smooth-On | Ecoflex 00-50 | 来自 Smooth-On 商店的试用装 |
| 30 硬度硅胶 | Smooth-On | Mold Star 30 | 来自 Smooth-On 商店的试用装 |
| 6 孔细胞培养板 | Corning Incorporated | 3516 | |
| 三磷酸腺苷（ATP） | Millipore Sigma | A1852-1VL | 用于配制经 0.2 微米滤膜过滤除菌的 3 mM ATP 水溶液 |
| 牛血 | HemoStat | DBB500 | 机械去纤维蛋白处理；通常 500 mL 足以用于一次实验 |
| 保鲜膜 | Fisherbrand | 22-305654 | |
| 滤纸 | Fisherbrand | 09-790-2C | 使用前需高压灭菌并冷却。也可使用精细级替代中等质量 |
| 氟龙（水性聚四氟乙烯） | Bioquip | 2871 | 也可从其他来源获取，例如 https://canada-ant-colony.com/products/fluon-ptfe-10ml |
| 葡萄糖 | Millipore Sigma | G8270-100G | |
| 己烷 | Millipore Sigma | 139386-100ML | |
| 镜头纸 | Fisherbrand | 11-995 | 100% 莱赛尔纤维 |
| 制霉菌素 | Gold Biotechnology | N-750-10 | |
| 封口膜 | Fisherbrand | S37440 | |
| 青霉素/链霉素/两性霉素B | Gibco | 15240-096 | 或等效通用产品，浓度如下：青霉素 10,000 单位/mL，链霉素 10,000 µg/mL，两性霉素B 25 µg/mL |
| 取食刺激剂 | 实验室自制 | 从前次蜱虫取食中收集获得 | |
| 聚碳酸酯管 | McMaster-Carr | 8585K204 | 切割为 45 mm 长，外径 1.25 英寸，内径 1 英寸。切割需使用切削砂轮锯。 |
| 橡胶O型圈 | McMaster-Carr | 9452K38 | 厚度 5 mm，内径 1.25 英寸 |
| 软头镊子 | VWR | 470315-238 | |
| 超级胶水 | 氰基丙烯酸酯胶 | ||
| 云龙纸 | 美术用品商店 | 构树纤维 10 g/m2。购于美国明尼苏达州圣保罗市 Wet Paint 美术用品商店 |
参考文献
- Rosenberg, R., et al. Vital signs: trends in reported vectorborne disease cases - United States and territories, 2004-2016. Morbidity and Mortality Weekly Report. 67 (17), 496-501 (2018).
- Busch, J. D., et al.
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