控制微孔退火颗粒支架中的颗粒分数以用于三维细胞培养

摘要

最大限度地减少颗粒支架中颗粒组分的变异性有助于实现可重复的实验。本研究描述了制备具有可控颗粒组分的颗粒支架的方法 体外 组织工程应用

摘要

微凝胶是多孔退火颗粒（MAP）支架的构建单元，可作为多种应用的平台 体外 细胞培养和 体内 组织修复。在这些颗粒状支架中，微凝胶之间空隙形成的固有孔隙率能够促进细胞的浸润和迁移。控制空隙分数和微粒分数对于MAP支架的设计至关重要，因为孔隙率是细胞的一种生物活性信号。可通过微流控装置制备具有可控尺寸和形状的球形微凝胶，随后采用防止聚合物网络破裂的方法进行冷冻干燥。再水化后，冻干微凝胶可在MAP支架中实现可控的微粒分数。这些微凝胶冻干方法的应用已促成可重复的研究，揭示了微粒分数对大分子扩散和细胞铺展的影响。以下方案将涵盖用于调控MAP支架中微粒分数的微凝胶制备、冻干与再水化步骤，以及通过生物正交交联对微凝胶进行退火处理以用于三维细胞培养。 体外.

引言

微孔退火颗粒（microporous annealed particle, MAP） 支架是一类颗粒材料的子类，其微凝胶（µgel）结构单元通过相互交联形成整体性的多孔支架。由于这类颗粒支架具有独特的微观结构，其交联球形微凝胶之间的空隙所形成的固有孔隙可显著促进细胞的快速浸润与迁移¹。MAP支架的微凝胶结构单元既可通过合成聚合物也可通过天然聚合物经化学修饰后制备²。本文所述方法特别强调使用以透明质酸（hyaluronic acid, HA）为主链、并修饰有功能性降冰片烯（norbornene, NB）基团的微凝胶。HA聚合物上的NB功能基团可支持“点击化学”反应，用于微凝胶的形成及其相互交联，从而构建MAP支架^3,4。目前已有多种方法被用于实现微凝胶之间的交联（即退火），例如酶促¹、光引发^5,6以及无需添加剂的点击化学^3,7反应。本研究采用无需添加剂的点击化学方法，利用四嗪-降冰片烯的逆电子需求Diels-Alder偶联反应实现HA....

方案

1. 微流控器件的制备

1. 软光刻技术
   注意：本方案描述了基于 de Wilson 等人⁹提出的流动聚焦型微流控装置设计的器件制备过程。然而，该方案也可用于 SU-8 晶圆上的任意装置设计。可将晶圆用胶带固定于培养皿上，随后进行硅烷化处理，以防止 PDMS 黏附于晶圆的微结构¹⁵。
   1. 按 10:1 的比例混合聚二甲基硅氧烷（PDMS）弹性体基质与固化剂（见材料表）。准备约 100 g 混合物，以在晶圆上形成约 5 mm 厚的 PDMS 层。将 PDMS 混合物倒入晶圆表面，在真空干燥器中脱气约 30 分钟。待所有气泡完全消除后，置于 60 °C 烘箱中至少固化 2 小时。
   2. 使用刀片沿装置边缘轻轻划线，避免划破晶圆；然后小心地将 PDMS 从晶圆上剥离。使用 1 mm 生物组织穿孔器（见材料表）在 PDMS 上打孔，形成进样口和出样口通道。
      注意：穿孔操作时应轻柔。若进样口或出样口周围出现撕裂或破损，可能导致微凝胶制备过程中发生泄漏。
   3. 使用胶带清除微结构侧表面的灰尘。将 PDMS 装置与洁净的玻璃载片一同置于 135 °C 热板上至少 15 分钟，以去除水分。
   4. 在通风橱内，使用电晕等离子体枪（见....

结果

本实验方案旨在演示如何制备具有生物正交交联体系及可控颗粒分数的微孔退火颗粒（MAP）支架，用于三维细胞培养。首先，透明质酸（HA）被修饰上降冰片烯侧基，用于微凝胶的形成以及后续交联以构建MAP支架。采用该方法，约31%的HA重复单元成功引入了降冰片烯功能基团（图1A）。具有流动聚焦区域的微流控装置（图1B) 被证明可生成 HA-NB µ约50的凝胶 µ米或约100 µ微米直径（图1C,D）。 µ本研究中使用的凝胶平均直径为92 µm（Q1 = 79） µm，Q3 = 103 µm) (图1E).

为了控制颗粒分数， µ凝胶被干燥 通过 冻干图 2A

讨论

已证明，采用微流控技术制备HA-NB微凝胶所获得的微凝胶粒径分布比乳液批量法更窄^3,9。本方案中描述的微凝胶使用了一种基质金属蛋白酶（MMP）可切割交联剂（Ac-GCRDGPQGIWGQDRCG-NH₂）进行交联，以支持材料的降解。 然而，HA-NB微凝胶也可使用其他二巯基交联剂（如二硫苏糖醇，DTT）进行交联，但此类交联剂不可降解。类似地，也可在HA-NB前体溶液中使用其他光引发剂（如Irgacure 2959，即2-羟基-4-(2-羟基乙氧基)-2-甲基苯丙酮）替代LAP，以促进巯基-烯烃交联反应¹⁰。本研究中微凝胶的组成为3.5 wt% HA，该浓度依据先前研究确定，因3.5 wt%前体溶液的黏度适合在微流控平台上通过剪切作用形成液滴⁶。其他研究者也报道过在流动聚焦式微流控装置上使用较低浓度（3 wt% HA-NB）前体溶液制备HA-NB微凝胶的方法^8<.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1 mL 鲁尔锁接头注射器，无菌，一次性使用，聚碳酸酯材质	BD	309628
5 mL 鲁尔锁接头注射器，无菌，一次性使用，聚碳酸酯材质	BD	309646
Alexa Fluor 488 C5 马来酰亚胺	Invitrogen	A10254	用于合成荧光标记的四嗪
Alexa Fluor 647 鬼笔环肽	Invitrogen	A22287	用于细胞培养样品染色
铝箔	VWR	89107-726
带推杆活检打孔器，1.0 mm	Integra Miltex	69031-01
活检打孔器，4 mm	Integra Miltex	33-34
钝头针，23 G 0.5"，非无菌，带帽	SAI Infusion Technologies	B23-50
瓶顶式真空滤器，0.22 μm	Corning	CLS430521
氯化钙	VWR	1B1110	用于微凝胶洗涤缓冲液
正排量移液器用毛细管-活塞组件，最大体积 1000 μL	Rainin	17008609
正排量移液器用毛细管-活塞组件，最大体积 25 μL	Rainin	17008605
正排量移液器用毛细管-活塞组件，最大体积 250 μL	Rainin	17008608
Countess 细胞计数板	Invitrogen	C10228
Countess II FL 全自动细胞计数仪	Invitrogen	AMQAF1000
离心管，15 mL	CELLTREAT	667015B
离心管，50 mL	CELLTREAT	229421
氯仿，ACS 级，玻璃瓶装	Stellar Scientific	CP-C7304	用于合成荧光标记的四嗪
电晕等离子枪，BD-10A 高频发生器	ETP	11011
冻存管，聚丙烯材质，内螺纹带螺旋盖	Nunc	368632
D1 小鼠间充质细胞	ATCC	CRL-12424	用于 MAP 凝胶中培养的示例细胞系
DAPI	Sigma-Aldrich	D9542	用于细胞培养样品染色
重水，99.9 原子% D	Sigma-Aldrich	151882	用于核磁共振波谱分析
透析袋，再生纤维素膜，截留分子量 12–14 kDa	Spectra/Por	132703	用于纯化 HA-NB 和 HA-Tet
乙醚	VWR	BDH1121-4LPC	用于合成荧光标记的四嗪
二甲基甲酰胺	Sigma-Aldrich	277056	用于合成荧光标记的四嗪
4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉氯化物 (DMTMM)	TCI-Chemicals	D2919	用于修饰透明质酸 (HA)
二硫苏糖醇 (DTT)	Thermo Scientific	R0861	不可降解的二巯基连接子（可替代 MMP 可切割肽）
杜尔贝科改良伊格尔培养基 (DMEM)，高糖，含 4500 mg/L 葡萄糖、L-谷氨酰胺、丙酮酸钠和碳酸氢钠，液体，经无菌过滤，适用于细胞培养	Sigma-Aldrich	D6429-500ML	用于 D1 细胞培养
EMS 甲醛，颗粒状	VWR	100504-162	用于配制 4% 多聚甲醛 (PFA)
无水乙醇（200 证明）	KOPTEC	89234-850
胎牛血清 (FBS)	ATCC	30-2020	用于 D1 细胞培养
加热板	Kopf Instruments	HP-4M
血细胞计数板及盖玻片	Daigger Scientific	EF16034F
2-[4-(2-羟乙基)哌嗪-1-基]乙磺酸 (HEPES)	Sigma-Aldrich	H3375
透明质酸钠，平均分子量 79 kDa，由化脓性链球菌 (Streptococcus zooepidemicus) 细菌生产，药用级，微生物污染 <100 CFU/g，细菌内毒素 <0.050 IU/mg	Contipro	N/A	本实验采用平均分子量为 79 kDa 的透明质酸钠用于 HA-Tet 合成，但这些方法也可适用于其他分子量。
IMARIS Essentials 软件包	Oxford Instruments	N/A	显微镜图像分析软件
输注泵，双注射器	Chemyx	N/A
Kimwipe 纸巾	Kimberly-Clark	34120
带支撑夹的实验室支架	Geyer	212100
液氮	Airgas	NI 180LT22
苯基(2,4,6-三甲基苯甲酰)磷酸锂	TCI-Chemicals	L0290
冷冻干燥机	Labconco	N/A	Labconco FreeZone 6 plus 已停产，但其他实验室级冷冻干燥机也可用于本实验方案。
甲基四嗪-PEG4-马来酰亚胺	Kerafast	FCC210	用于合成荧光标记的四嗪
2-(4-吗啉基)乙磺酸 (MES)	Fisher Scientific	BP300-100	用于修饰透明质酸 (HA)
显微盖玻片，24 × 60 mm，1 号	VWR	48393-106
微流控装置 SU8 母版晶圆	FlowJem		定制设计，可在洁净室内部制备或外包生产
矿物油，重质	Sigma-Aldrich	330760
MMP 可切割二巯基交联肽 (Ac-GCRDGPQGIWGQDRCG-NH2)	GenScript	N/A
5-降冰片烯-2-甲胺	TCI-Chemicals	95-10-3	用于 HA-NB 合成
封箱胶带	Scotch	3M 1426
Parafilm 封口膜	Bemis	PM996
PEG(巯基)2	JenKem Technology USA	A4001-1	用于合成荧光标记的四嗪
青霉素-链霉素，10,000 单位/mL	Thermo Fisher Scientific	15140122	用于 D1 细胞培养
培养皿，聚苯乙烯，一次性，直径 × 高 = 150 × 15 mm	Corning	351058
泊洛沙姆 F-127	Sigma-Aldrich	P2443	用于洗涤 HMPs
磷酸盐缓冲液 (PBS) 1×	Gibco	10010023
RainX 玻璃防水处理剂	Grainger	465D20	用于微流控装置处理的合成疏水处理溶液
RGD 肽 (Ac-RGDSPGERCG-NH2)	GenScript	N/A
橡胶圈	Staples	112417
氯化钠	Chem-Impex	30070	用于透析
合成用 Span 80	Sigma-Aldrich	1338-43-8
Sylgard 184 硅酮弹性体	Electron Microscopy Science	4019862	聚二甲基硅氧烷 (PDMS) 弹性体，用于制作微流控装置和组织培养装置
注射器滤器，Whatman Uniflo，0.2 μm PES，直径 13 mm	Cytvia	09-928-066
Tetraview LCD 数码显微镜	Celestron	44347
四嗪-胺盐酸盐	Chem-Impex	35098	用于 HA-Tet 合成
三乙胺	Sigma-Aldrich	471283	用于合成荧光标记的四嗪
三(2-羧乙基)膦 (TCEP)	Millipore Sigma	51805-45-9
吐温 X-100	VWR	97063-864
台盼蓝溶液，0.4%	Thermo Fisher Scientific	15250061
胰蛋白酶 EDTA (0.25%)，含酚红	Fisher Scientific	25-200-056	用于消化贴壁细胞以接种于 MAP 凝胶中
Tygon ND-100-80 非 DEHP 医用导管，针规=23，壁厚=0.020 英寸，内径=0.020 英寸，外径=0.060 英寸	Thomas Scientific	1204G82
紫外光固化系统控制器，LX500 LED	OmniCure	010-00369R
紫外光固化头，LED 点光源紫外	OmniCure	N/A
紫外光强度计，Traceable	VWR	61161-386
真空干燥器	Bel-Art	08-594-15C
X-Acto Z 系列精密美工刀	Elmer's	XZ3601W