最大限度地减少颗粒支架中颗粒组分的变异性有助于实现可重复的实验。本研究描述了制备具有可控颗粒组分的颗粒支架的方法 体外 组织工程应用
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摘要
摘要
微凝胶是多孔退火颗粒（MAP）支架的构建单元，可作为多种应用的平台 体外 细胞培养和 体内 组织修复。在这些颗粒状支架中，微凝胶之间空隙形成的固有孔隙率能够促进细胞的浸润和迁移。控制空隙分数和微粒分数对于MAP支架的设计至关重要，因为孔隙率是细胞的一种生物活性信号。可通过微流控装置制备具有可控尺寸和形状的球形微凝胶，随后采用防止聚合物网络破裂的方法进行冷冻干燥。再水化后，冻干微凝胶可在MAP支架中实现可控的微粒分数。这些微凝胶冻干方法的应用已促成可重复的研究，揭示了微粒分数对大分子扩散和细胞铺展的影响。以下方案将涵盖用于调控MAP支架中微粒分数的微凝胶制备、冻干与再水化步骤，以及通过生物正交交联对微凝胶进行退火处理以用于三维细胞培养。 体外.
引言
微孔退火颗粒（microporous annealed particle, MAP） 支架是一类颗粒材料的子类，其微凝胶（µgel）结构单元通过相互交联形成整体性的多孔支架。由于这类颗粒支架具有独特的微观结构，其交联球形微凝胶之间的空隙所形成的固有孔隙可显著促进细胞的快速浸润与迁移1。MAP支架的微凝胶结构单元既可通过合成聚合物也可通过天然聚合物经化学修饰后制备2。本文所述方法特别强调使用以透明质酸（hyaluronic acid, HA）为主链、并修饰有功能性降冰片烯（norbornene, NB）基团的微凝胶。HA聚合物上的NB功能基团可支持“点击化学”反应，用于微凝胶的形成及其相互交联，从而构建MAP支架3,4。目前已有多种方法被用于实现微凝胶之间的交联（即退火），例如酶促1、光引发5,6以及无需添加剂的点击化学3,7反应。本研究采用无需添加剂的点击化学方法，利用四嗪-降冰片烯的逆电子需求Diels-Alder偶联反应实现HA-NB微凝胶之间的交联。
为了制备MAP支架，用户首先通过反相乳液法在批量系统或微流控装置中生成微凝胶构筑单元，也可采用电液动力喷雾、光刻或机械破碎方法制备。2球形HA-NB微凝胶的制备已通过批量乳液法得到充分描述并有先前报道2 以及微流控液滴生成技术8,9,10,11在此研究中，采用流动聚焦型微流控平台制备了形状和尺寸可控的球形HA-NB微凝胶，方法如前所述。8,9,10纯化后，微凝胶以水相悬浮液形式存在，必须进行浓缩以诱导形成阻塞态。处于阻塞态时，微凝胶表现出剪切稀化特性，使其可作为可注射的填充材料使用1诱导堵塞状态的一种方法是将微凝胶干燥。 通过 冷冻干燥（lyophilization）后，再在受控体积中重新水化干燥产物12. 或者，可从缓冲液中去除过量成分 微凝胶浆液 通过 通过筛网离心或手动移除微凝胶沉淀中的缓冲液（可通过抽吸或使用吸水材料）进行离心。然而，在制备颗粒状支架时，采用离心法干燥微凝胶可能导致颗粒分数和孔隙分数出现高度可变的范围12. 已有研究描述了使用70%异丙醇（IPA）对聚乙二醇（PEG）微凝胶进行冻干的技术13，用于明胶甲基丙烯酰胺（GelMa）微凝胶的氟化油14，以及用于HA微凝胶的70%乙醇12本方案重点介绍使用70%乙醇（一种标准实验室试剂）冻干球形透明质酸（HA）微凝胶的方法，以在干燥过程中保持微凝胶的原始特性。冻干后的HA微凝胶可按用户定义的重量百分比进行称量和再水化，从而调控MAP支架中最终的颗粒组分。12.
MAP支架形成的最后一步依赖于将微凝胶退火，以形成整体性的多孔支架。1通过利用天然的细胞外基质成分并采用生物正交退火策略，MAP支架可作为一种生物相容性平台，适用于两者 体外 细胞培养和 体内 组织修复3通过这些方法，可利用HA-NB构建单元制备具有用户自定义颗粒比例的MAP支架，用于组织工程应用12以下方案描述了通过微流控技术制备HA-NB微凝胶，随后进行冻干与再水化以调控MAP支架中的颗粒组分。最后，介绍了利用生物正交化学对微凝胶进行退火的步骤。 体外 三维细胞培养实验
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方案
1. 微流控器件的制备
- 软光刻技术
注意：本方案描述了基于 de Wilson 等人9提出的流动聚焦型微流控装置设计的器件制备过程。然而，该方案也可用于 SU-8 晶圆上的任意装置设计。可将晶圆用胶带固定于培养皿上，随后进行硅烷化处理，以防止 PDMS 黏附于晶圆的微结构15。- 按 10:1 的比例混合聚二甲基硅氧烷（PDMS）弹性体基质与固化剂（见材料表）。准备约 100 g 混合物，以在晶圆上形成约 5 mm 厚的 PDMS 层。将 PDMS 混合物倒入晶圆表面，在真空干燥器中脱气约 30 分钟。待所有气泡完全消除后，置于 60 °C 烘箱中至少固化 2 小时。
- 使用刀片沿装置边缘轻轻划线，避免划破晶圆；然后小心地将 PDMS 从晶圆上剥离。使用 1 mm 生物组织穿孔器（见材料表）在 PDMS 上打孔，形成进样口和出样口通道。
注意：穿孔操作时应轻柔。若进样口或出样口周围出现撕裂或破损，可能导致微凝胶制备过程中发生泄漏。 - 使用胶带清除微结构侧表面的灰尘。将 PDMS 装置与洁净的玻璃载片一同置于 135 °C 热板上至少 15 分钟，以去除水分。
- 在通风橱内，使用电晕等离子体枪（见材料表）对玻璃载片和 PDMS 装置（暴露微结构面）进行高强度处理约 30 秒，随后迅速将两者键合。轻柔施加压力，确保装置与玻璃载片之间形成良好密封。将键合后的装置置于 60 °C 烘箱中过夜，以增强键合强度。
2. 带有降冰片烯（NB）功能基团的透明质酸（HA）微凝胶的微流控制备
- HA-NB 的合成
注意：HA-降冰片烯（HA-NB）的合成方法参考 Darling 等人3，使用 79 kDa 的钠盐透明质酸（HA），其摩尔当量比为 HA 重复单元 : DMTMM : NMA = 1 : 1.5 : 2.5，其中 DMTMM 为 4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉氯化物，NMA 为 5-降冰片烯-2-甲胺。- 称取反应物。将 HA 溶解于 200 mM MES 缓冲液（pH ~6）中，浓度为 20 mg/mL，在磁力搅拌器上的烧杯或烧瓶中搅拌至完全溶解。溶解后，向 HA 溶液中加入 DMTMM，并在室温下反应约 20 分钟。例如，可使用 1 g HA + 1.09 g DMTMM + 845 µL NMA。
- 将 NMA 逐滴加入 HA/DMTMM 溶液中。用封口膜封闭反应容器开口以减少蒸发，并用铝箔包裹反应容器。继续搅拌，使反应在约 24 小时内完成。
- 24 小时后，将无水乙醇（体积约为反应液体积的 10 倍）预冷。在磁力搅拌器上，将反应液逐滴加入预冷的乙醇中，使 HA-NB 沉淀，并以 200–300 rpm 继续搅拌 20 分钟。
- 将溶液转移至 50 mL 圆底离心管中，于 5,000 × g 离心 10 分钟。倾去上层多余乙醇并作为废液处理。此时，HA-NB 产物应为离心管底部的白色颗粒状沉淀。将 HA-NB 置于干燥器中抽真空，过夜干燥。
- 使用 12–14 kDa 分子量截留的纤维素透析袋纯化 HA-NB（见材料表）。将 HA-NB 溶解于 2 M NaCl 溶液中，并转移至透析袋内。必要时用夹子固定透析袋两端。将装有样品的透析袋置于盛有 5 L 超纯水的容器中，于水中透析过夜。
- 次日，倒掉水相，更换为 1 M NaCl 溶液透析 30 分钟。随后倒掉 NaCl 溶液，再用超纯水透析 3 天，每天更换一次水。
- 使用 0.2 µm 真空驱动滤器过滤透析后的产物，然后将滤液转移至 50 mL 圆底离心管中。
- 向低温容器中加入液氮，将 HA-NB 样品管快速冷冻 10 分钟。然后用镊子取出离心管，迅速打开管盖并用实验室级纸巾覆盖（见材料表）。用橡皮筋固定纸巾，将样品转移至冷冻干燥容器或腔室（见材料表）进行冻干。将冻干产物储存于 -20 °C。
警告：液氮为危险物质。操作时需佩戴适当的个人防护装备。 - 通过将 HA-NB 溶解于 D2O 中（浓度为 10 mg/mL），采用质子核磁共振（via proton NMR）定量分析降冰片烯的修饰程度（图 1A）16。
- 为确定功能化程度，首先将 D2O 溶剂峰校准至 4.8 ppm。积分 HA 的甲基质子峰（δ2.05），并将积分值校准为 3.0。接着积分悬挂降冰片烯基团在 δ6.33 和 δ6.02 处的峰（乙烯基质子，内型）。将这些峰的积分值归一化至相应质子数，以计算平均修饰度3。
- HA-NB 微凝胶前体的制备
- 配制 50 mM HEPES 缓冲液（pH 7.5），并使用 0.2 µm 真空驱动滤器进行无菌过滤。用该 HEPES 缓冲液分别配制 50 mM 的锂苯基（2,4,6-三甲基苯甲酰）次膦酸盐（LAP）光引发剂和三（2-羧乙基）膦（TCEP）还原剂储备液。LAP 溶液需避光保存。
- 用无菌蒸馏水分别配制 50 mM 的双硫醇交联剂和 RGD 肽储备液，以准备其他微凝胶前体组分。称取 HA-NB 并溶于 HEPES 缓冲液中，配制成 10 mg/mL 的储备液。
注意：用户可根据需要选择不同的双硫醇交联剂用于微凝胶内部交联。材料表中列出了可降解（如 MMP 可切割）和不可降解（如二硫苏糖醇或 DTT）两种类型的交联剂。RGD 肽被包含在微凝胶配方中，以促进 MAP 支架中的细胞黏附，但该组分可被移除，并用等体积的 HEPES 缓冲液替代。 - 通过添加额外的 HEPES 缓冲液至目标终体积，将各前体组分混合，终浓度分别为：9.9 mM LAP、0.9375 mM TCEP（4 巯基/TCEP）、2.8 mM 双硫醇交联剂、1 mM RGD 肽和 3.5 wt%（w/v）HA-NB。使用正向置换移液器充分混匀前体溶液。
- 使用 P1000 移液器缓慢吸取全部混合液。将吸头套在 1 mL 注射器末端，并将吸头从移液器上弹出。拉动注射器活塞，将混合液吸入注射器中，然后在注射器末端安装 0.2 µm 滤器，将液体过滤至新的 1.5 mL 微量离心管中。将过滤后的前体溶液离心，以去除过滤过程中产生的气泡。
- 再次使用 P1000 移液器，缓慢吸取过滤后的前体溶液，注意避免产生气泡。若存在气泡，可轻敲吸头使其脱离并上浮至顶部。
- 将吸头套在 1 mL 注射器末端，并从移液器上弹出。保持注射器垂直，缓慢拉动活塞，使全部前体溶液进入注射器。在注射器上安装平头针头，推动前体溶液通过针头。用铝箔包裹注射器以避光。
- 微凝胶夹断溶液的制备
- 配制 5% v/v 的 Span-80 重质白油溶液，充分混匀。置于干燥器中脱气。将表面活性剂/油混合物在室温下用铝箔包裹保存。每次使用前需充分混匀并脱气。
- 使用 5 mL 注射器吸取油/表面活性剂混合物（尽量减少气泡），使活塞与指托之间的距离大致等于前体溶液注射器的长度。在注射器上安装平头针头，并推动液体通过针头。
- 微流控装置的设置
- 在 1 mL 注射器上安装平头针头，并装入合成疏水处理液（见材料表）。缓慢将溶液流经微流控装置，直至其在每个进出口处积聚。将装置置于实验台面上静置约 30 分钟使其自然干燥，然后从出口端抽真空以去除多余溶液。使用夹具将装置固定在台式显微镜上。
- 用铝箔包裹一个 15 mL 圆底离心管，并置于试管架中作为微凝胶收集容器。使用铁架台和夹具将紫外光探头插入收集管开口中。使用紫外检测仪（见材料表）测量紫外光强度，调节探头位置直至达到 20 mW/cm2。暂时关闭紫外光源，待后续步骤使用。
- 裁剪一段长度足以连接微流控装置与收集容器的管路。在一端切成 45° 斜角。小心地将斜角端插入装置的出口通道。
注意：将管路插入微流控装置时应轻柔操作。进/出口通道周围若出现撕裂或破损，可能导致微凝胶制备过程中发生泄漏。 - 将前体溶液和油相注射器固定在双通道注射泵上（见材料表）。再裁剪两段长度足以连接注射器与微流控装置的管路。每根管路的一端切成 45° 斜角。小心地将管路（平头端）分别固定在两个注射器出口上。
- 在泵上设置 1 mL 注射器参数，并输入前体溶液的大致体积。缓慢推动泵，使注射器活塞受压，将油相和前体溶液推至管路末端，排出系统中的空气。在进入步骤 2.4.6 前，让压力平衡 5–10 分钟。
- 将管路的斜角端轻轻插入微流控装置的进样通道，前体溶液接入前端进样口，夹断油接入后端进样口。以小步进方式推动泵，直至装置内开始流动，并在聚焦流区域形成球形微凝胶。以 0.4 µL/min 的流速启动泵，运行至系统稳定。如有需要，可每次微调 ±0.1 µL/min 的流速，以稳定微凝胶生成。
- 当微凝胶生成如图 1B所示趋于稳定后，更换新的收集管，并打开紫外光源。定期检查运行状态，确保在整个过程中微凝胶生成保持稳定。
图1：利用降冰片烯（NB）功能基团微流控法制备透明质酸（HA）微凝胶。 (A通过在重水中的质子核磁共振分析确定，约31%的透明质酸重复单元成功地被NB修饰。 1内型降冰片烯的烯烃质子在 δ6.33 和 δ6.02 处，外型降冰片烯的烯烃质子在 δ6.26 和 δ6.23 ppm 处的核磁共振氢谱（¹H NMR）化学位移，与 HA 甲基基团的 δ2.05 ppm 进行比较，以确定官能化程度。转载自 Anderson 等人。12 经爱思唯尔许可。 (B) 用于生成 HA-NB 的流动聚焦型微流控装置示意图 µgels. (C) 采用共聚焦显微镜的最大强度投影来观察荧光标记的结构 µgels （比例尺 = 500 µm). (D微流控装置上独立实验运行所得微凝胶直径的频率分布表明可对微凝胶尺寸进行调控~50 µm 或 ~100 µm 取决于所使用的设备。 (E微凝胶直径以每次独立实验的平均值和标准差表示。引自 Wilson 等人。9 经 Wiley 允许。 请点击此处以查看此图的放大版本。
3. 微凝胶的纯化与干燥
- 微凝胶的纯化
- 配制微凝胶洗涤缓冲液（300 mM HEPES，50 mM NaCl，50 mM CaCl2），以及在洗涤缓冲液中配制2%（w/v）Pluronic F-127表面活性剂溶液。使用0.2 µm真空驱动滤器对溶液进行灭菌。
- 将微凝胶收集管离心（5,000 × g）5分钟。在无菌操作台中，小心吸除上清油相。将µgels与2% Pluronic F-127表面活性剂溶液按1:1体积比混合，并涡旋充分混匀。再次离心（5,000 × g）5分钟，吸除上清洗涤液。
- 加入相当于微凝胶体积4倍的洗涤缓冲液，并涡旋充分混匀。将混合物离心（5,000 × g）5分钟，吸除洗涤液。重复洗涤4–8次，直至体系中表面活性剂完全去除（即无气泡残留）。
- HA-NB微凝胶的荧光标记
注意：荧光标记四嗪的实验室合成依赖于连续进行的两个碱催化巯基-迈克尔加成反应，该方法已有充分描述并被先前报道3。本研究中，将Alexa Fluor-488与四嗪偶联，用于标记降冰片烯修饰的µgels。冻干产物（Alexa Fluor 488-Tet）溶于二甲基甲酰胺至浓度为1 mg/mL，并于-20 °C保存。- 为对µgels进行荧光标记，首先将1 mg/mL的储备液用无菌1×PBS按1:14稀释，配制工作液。在无菌操作台中，将µgels与工作液按2:1体积比混合。
- 使用移液器充分混匀。室温孵育1小时，或4 °C过夜。
- 离心（5,000 × g）后吸除染色溶液。用1×PBS（按1:1体积比）洗涤µgels两次，以去除未反应的Alexa Fluor 488-Tet。
注意：此时可将荧光标记的µgels在共聚焦显微镜下成像，以定量微凝胶尺寸（图1C-E）9。Roosa等人已对微凝胶尺寸的测量方法进行了详尽描述17。
- HA-NB微凝胶的干燥
- 使用正向置换移液器将纯化的µgels（图2A）转移至耐低温螺口管中。向纯化的µgels中加入终浓度为50%（v/v）的70%乙醇，并用移液器充分混匀。在5,000 × g条件下离心5分钟。
警告：乙醇为高度易燃物质。
注意：建议在加入µgels前称量耐低温螺口管的质量，冻干后再称量一次，以确定µgels的质量。当使用量少于1 mg时，此步骤可有效减少误差。使用前应确保天平已完成内部校准或校正。 - 吸除上清液体，并替换为50%（v/v）的70%乙醇（图2B）。用移液器充分混匀，4 °C过夜孵育。
注意：如需长期保存，微凝胶可在4 °C条件下保存于70%乙醇中，直至进行冻干。冻干后的微凝胶如图2C所示。若需形成冷冻凝胶，此步骤可选用其他冻干介质（图2D）。 - 短暂离心，确保µgels沉降至螺口管底部。向低温容器中加入液氮，随后将装有µgels的管子浸入其中进行速冻。
- 5–10分钟后，用镊子取出装有µgels的管子，迅速打开管盖并用实验室级纸巾覆盖，用橡皮筋固定后转移至冻干容器或冻干室中。
- 按照制造商说明将样品装载至冻干机。在0.066 Torr和-63 °C条件下进行冻干。将冻干后的µgels（lyo-µgels）密封保存于室温环境中。
注意：当管内所有液体均已去除，仅剩干燥产物时，表明冻干完成。有机溶剂可能缩短常用冻干系统中橡胶部件的使用寿命。
- 使用正向置换移液器将纯化的µgels（图2A）转移至耐低温螺口管中。向纯化的µgels中加入终浓度为50%（v/v）的70%乙醇，并用移液器充分混匀。在5,000 × g条件下离心5分钟。
图2：干燥 HA-NB 微凝胶。 (A最大强度投影 µgels 在水溶液中（比例尺 = 100 µm). (B) 纯化的 µgels 可按1:1体积比与所选冻干介质混合后进行冻干。C最大强度投影的干燥冻干样品µgels （比例尺 = 100 µm). (D冻干后微凝胶需重新悬浮。建议使用70%乙醇以保持其原有特性 µgels 在整个冻干过程中；然而，其他介质如异丙醇（IPA）、水和乙腈（MeCN）也可互换使用以促进冷冻凝胶的形成（比例尺 = 100 或 50 µm 如注）。E) HA-NB微凝胶在冻干前（灰色）和冻干后（绿色）于70%乙醇中的粒径测量结果，以三个微凝胶群体的频率分布图表示。引自Anderson等。12 经爱思唯尔许可。 请点击此处查看此图的放大版本。
4. MAP支架的制备
- 四嗪连接子合成
注意：四嗪连接子可用于交联 µgels 含有游离降冰片烯基团（图3A）。HA-tetrazine（HA-Tet）的合成步骤参照Zhang等人的方法进行。18 使用79 kDa的钠型透明质酸，其HA重复单元与DMTMM和四嗪-胺的摩尔比为1:1:0.25图3B)12.- 称量反应物。将HA以20 mg/mL的浓度溶解于200 mM MES缓冲液（pH ~6）中，置于烧杯或烧瓶内，在搅拌器上搅拌至完全溶解。溶解后，向HA溶液中加入DMTMM，并在室温下反应约20分钟。例如，可使用100 mg HA、72.8 mg DMTMM和14.14 mg四嗪-胺。
- 将四嗪-胺以15 mg/mL的浓度溶于200 mM MES缓冲液中，并逐滴加入HA/DMTMM溶液中。参考 图3C 用于 HA-Tet 反应体系的建立。
- 在反应容器开口处覆盖一层Parafilm以减少蒸发，并用铝箔包裹反应容器。继续搅拌，使反应持续进行约24小时。
- 24 h后，将200 proof乙醇（约为反应体积的10倍）预冷。在搅拌器上，将反应液逐滴加入预冷的乙醇中，以沉淀HA-Tet图3D）并继续搅拌20分钟。
- 将溶液转移至50 mL离心管中，然后在5,000 x g 10分钟。倒掉多余的乙醇并作为废液处理。将HA-Tet置于干燥器中抽真空，过夜干燥。本步骤中干燥产物的示例如下所示 图3E.
- 使用透析法纯化HA-Tet。将HA-Tet溶解于2 M NaCl溶液中，转移至截留分子量为12–14 kDa的纤维素透析管内。将装有溶液的透析管置于盛有5 L超纯水的容器中，于水中透析过夜。
- 第二天，移除水并替换为1 M NaCl溶液，处理30分钟。移除NaCl溶液，然后用超纯水透析3天，每天更换水。
- 使用滤膜过滤透析后产物 0.2 µm 真空驱动过滤器过滤，然后将滤过的HA-Tet产物转移至50 mL锥形管中。
- 将锥形管在液氮中速冻10分钟，然后用镊子取出锥形管。迅速打开管盖并用实验室级纱布覆盖，用橡皮筋固定纱布，转移至冻干容器或冻干室中进行冻干。将冻干产物储存于图 3F) 在 -20 °C.
- 通过将 HA-Tet 溶解于 D 中，浓度为 10 mg/mL，以定量四嗪修饰2O 和分析 通过 质子核磁共振（proton NMR）图 3G)16.
- 为确定功能化程度，首先校准 D2将溶剂峰校正至4.8 ppm。积分HA甲基质子峰（δ 2.05），并将积分值校准为3.0。接着，积分悬挂四嗪基团在δ 8.5（2H）和δ 7.7（2H）处的峰（芳香性质子）。将这些峰的积分值归一化至对应的质子数，以确定平均修饰程度。12.
- 交联冻干-µgels 用于形成MAP支架以进行表征
- 制备MAP支架组分（即 µgels，HA-Tet，重悬体积）。称量冻干粉µgels (图4A）并在最终MAP体积的84%的1×PBS中重悬。让微凝胶溶胀约20分钟（图4B, C）。重悬所用的wt% MAP可根据用户对最终颗粒组分的需求自行选择（参见 图 4D，E).
- 将HA-Tet溶解于选定浓度的1×PBS中（见下文注释）。
注意：同时改变填充分数（通过 wt% MAP）以及HA-Tet的浓度将影响整体支架的力学性能。例如，使用0.02 mg/mL HA-Tet（退火比为2.6 mol Tet : mol HA-NB）交联的3.4 wt% MAP支架，可形成剪切储能模量约为700 Pa的MAP支架12. - 使用移液器将 HA-Tet 与 lyo- 混合µgels 并充分混匀。此时，可将混合物转移 通过 移液器将液体转移至载玻片、孔板或用户选定的容器中。静置 µgels 退火至 37 °C 孵育25分钟，然后使用刮铲将MAP支架转移至含有1x PBS的孔板中。在进行表征前，将MAP支架保存在1x PBS中。
- 计算MAP支架颗粒分数
- 为获得更佳的图像质量，使用刮铲将 MAP 支架转移至玻璃盖玻片上。在共聚焦显微镜下，采用 FITC 激发和发射波长对 MAP 支架进行成像。使用 20 倍物镜对 MAP 支架成像，并获取贯穿 250-300 µm 在Z方向上以步长 2.5 µm. 记录下 µm/pixe图像校准
- 将Z轴层扫图像导入分析软件（参见 材料表）。选择 添加新表面 按钮。勾选该复选框以 仅分割感兴趣区域，然后选择蓝色箭头按钮 下一步：感兴趣区域.
- 定义感兴趣区域，记录所分析体积的 X、Y 和 Z 维度。选择蓝色箭头按钮 下一步：源通道.
注意：X 和 Y 维度的单位为像素，而 Z 维度为步数。感兴趣区域的推荐 Z 轴高度应至少包含两步 µgels. - 使用 信号源通道 下拉列表中选择 FITC 通道。勾选旁边的复选框 平滑 并输入表面细节 2.50 µm在“阈值设置”下，选择 绝对强度，然后选择蓝色箭头按钮 下一步：阈值.
- 使用建议的FITC通道阈值。旋转三维投影以评估渲染质量，并根据需要进行调整。选择 下一步：表面分类.
注意： 返回 按钮可用于根据需要编辑流程中的先前步骤，例如 Z 维度。 - 检查是否 体素数量 是 10.0，然后选择绿色双箭头按钮 完成：执行所有创建步骤并终止向导.
注意：体积渲染参数可保存用于批量分析，以便将相同的设置应用于所有支架的分析。 - 要导出数据，请选择 统计学 标签，然后 详细 选项卡。使用第二个下拉框选择变量 体积. 单击软盘按钮 将标签页显示中的统计信息导出至文件 提示时保存为电子表格文件（.xls）。
- 打开文件，对 A 列使用 SUM 函数 体积 以确定总体积（µm3的 µgels 在感兴趣区域。
- 将所分析的兴趣区域的尺寸从像素转换为 µm. 使用 µm/pixel 根据步骤4.3.1中的图像校准，转换X轴和Y轴维度。将Z轴维度（步数）乘以图像的步长，以将Z轴维度转换为实际距离 µm. 计算感兴趣区域的体积（µm3通过将X、Y和Z三个维度相乘。
- 为确定支架的颗粒组分，将颗粒总体积除以支架总体积 µgels 通过步骤4.3.9中获得的兴趣区域体积，除以步骤4.3.8中获得的兴趣区域面积。
图3四嗪连接剂的合成用于制备微孔退火颗粒（MAP）支架。 (A) HA-NB 示意图 µgels 通过四嗪连接子交联形成MAP支架。B) HA-Tet 合成反应示意图。 (CHA-Tet 反应体系配制后，于室温下避光孵育过夜，随后进行（D) HA-Tet 在乙醇中的沉淀。E) 纯化并干燥后，将HA-Tet重新水化并进行冷冻干燥，得到（F一种干燥的淡粉色产品。G质子核磁共振分析显示，11%的透明质酸重复单元成功实现了修饰。转载自 Anderson 等人。12 经爱思唯尔许可。 请点击此处以查看此图的放大版本。
图4冻干微凝胶的再水化用于制备MAP支架。 (A最大强度投影的干燥冻干样品µgels （比例尺 = 100 µm). (B) 冻干后，用重悬液重悬冻干粉µgels 约需20分钟（比例尺 = 100 µm). (C) 冷冻干燥-µgels 可在不同质量百分比的MAP条件下重新水化，以形成阻塞状态 µgels （比例尺 = 100 µm). (D) 增加复水冻干样品时MAP的重量百分比（wt%）µgels 改变了MAP支架中的颗粒组分，如MAP支架的单个Z切片和体积投影所示（比例尺 = 100 µm). (E) 利用这些用户自定义的 wt% MAP 支架，可获得独特的颗粒组分（NL = 非冷冻干燥 µgels). 对样本（n = 3）进行单因素方差分析（One-way ANOVA），并采用Tukey HSD检验进行多重比较，显著性水平设为 p < 0.05（*），p < 0.01 (**)，p < 0.005（***）和 p < 0.001（****）。转载自 Anderson 等。12 经爱思唯尔许可。 请点击此处以查看此图的放大版本。
5. 在 MAP 支架中进行三维细胞培养
- 准备细胞培养装置
- 为了在这些实验中创建一种定制的细胞培养装置（图5A- C），使用CAD文件中的设计，通过3D打印机打印出阴模 补充编码文件 1.
注意：细胞培养装置的尺寸如下：94.9 mm × 94.9 mm × 4.8 mm，总孔高为2.6 mm。内孔和外孔的直径分别为4 mm和6 mm。 - 将聚二甲基硅氧烷（PDMS）弹性体基质与固化剂按10:1的质量比混合。将PDMS混合物倒入一个较大的塑料培养皿中，并在真空干燥器中脱气约30分钟，直至所有气泡完全消失。
- 待所有气泡完全消失后，小心地将3D打印模具放入PDMS中，以尽量减少新气泡的产生。随后置于烘箱中，于 60 °C 至少固化 PDMS 2 小时。
- 使用刀片或剃须刀片轻轻沿培养装置的边缘划线，然后小心移除模具。使用4 mm活检打孔器清除井底部的PDMS。将装置切割至适合放置在玻璃盖玻片上。
注意：细胞培养装置也可与载玻片键合，但使用玻璃盖玻片可改善样本成像效果。 - 使用胶带去除培养装置底面的灰尘。将洁净的玻璃盖玻片和培养装置（底面朝上）放置于加热板上 135 °C 至少15分钟以去除水分。
- 在通风橱中，将电晕等离子体枪调至高功率，对玻璃盖玻片和装置底面各处理30秒，随后迅速将处理过的表面贴合在一起。轻轻施加压力，确保培养装置与玻璃盖玻片之间形成良好密封。
- 对所有设备重复步骤 5.1.6，然后放入 60 °C 烘箱中过夜以确保粘合牢固。使用前对装置进行高压灭菌以达到灭菌效果 体外.
- 为了在这些实验中创建一种定制的细胞培养装置（图5A- C），使用CAD文件中的设计，通过3D打印机打印出阴模 补充编码文件 1.
- 在MAP支架中进行细胞培养
- 制备MAP支架组分（即 µgels，HA-Tet，培养基体积）根据目标颗粒组分确定（参见 图 4D-）。称取冻干粉的重量µgels 在无菌操作台中，根据所选的 wt% MAP，用相当于最终 MAP 体积 84% 的细胞培养基重悬。静置使其溶解。 µgels 膨胀约 20 分钟。
注意：这些方法要求用户称量冻干微凝胶产品以进行重悬。对于较小的质量（1 mg 或以下），建议在添加和冻干前先称量 cryotube 的重量。 µgels，然后在冻干后重新称量试管以确定产物质量，从而尽量减少误差。 - 将HA-Tet溶解于细胞培养基中，体积为最终MAP体积的16%。
注意：根据所使用的细胞类型，以下用于在 MAP 支架中接种细胞的制备步骤可作相应调整。在本方案中，D1 小鼠间充质细胞在添加了 1% 青霉素-链霉素（pen-strep）和 10% 胎牛血清（FBS）的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）中培养（参见 材料表）。这些细胞应遵循标准的贴壁细胞培养方案，培养物需维持在 37 °C 和5% CO2 在经组织培养处理的培养容器中。 - 当D1小鼠间充质细胞达到70%–80%融合度时，吸除培养基，并用1× PBS洗涤细胞。加入足量1%胰蛋白酶-EDTA溶液覆盖培养器皿表面，以消化细胞。于37 °C孵育 37 °C 孵育1-3分钟，然后加入体积为胰蛋白酶-EDTA两倍的DMEM培养基（含1%青霉素-链霉素和10%胎牛血清）以终止消化反应。
- 将细胞悬液在 100 x g 室温下离心5分钟以沉淀细胞。吸除上清液，将细胞重悬于1 mL添加了1%青霉素-链霉素和10%胎牛血清的DMEM培养基中。
- 确保细胞悬液充分混匀，然后转移 20 µL 转移到新的微量离心管中。加入 20 µL 台盼蓝溶液并充分混匀。使用 20 µL 使用血细胞计数板或配备细胞计数板的自动细胞计数仪对上述混合液进行细胞计数。
- 接种所需的细胞数量，使每孔细胞数为 10,000 个/孔µL 转移至新的微量离心管中。以100 x g离心 g 室温下离心5分钟以沉淀细胞。小心吸除细胞沉淀上方的上清液，避免吸出细胞。
- 加入 µgels 使用移液器将交联剂加入细胞沉淀中，充分混匀后接种 10 µL 每孔加入混合液。接种时，用移液器以环形运动方式加样，使混合液在孔内均匀分布。
- 让其静置 µgels 退火至 37 °C 在细胞培养箱中孵育25分钟后，加入细胞培养基至充满各孔（约50 µL 每孔培养基体积）。将三维培养物维持在 37 °C 根据需要更换培养基。更换培养基时，为避免吸走支架，应将移液器枪头沿上层小室的边缘固定以保持稳定。
注意：向培养孔中添加或移除液体时，应将移液器吸头末端靠在MAP支架上方的边缘处，以尽量避免扰动或吸出支架。 - 在预定时间点，通过移除培养基并加入固定液来固定样品 50 µL 每孔加入4%多聚甲醛，室温孵育30分钟。用洗涤液洗涤样本3次。 50 µL 加入1× PBS或首选缓冲液。此时可按照免疫荧光或荧光染色的标准方法进行操作，使用 50 µL 每孔工作体积
注意：这些固定和细胞染色方法专门描述了荧光染料的使用；然而，也可在这些支架中按照制造商说明书，使用一抗和/或二抗偶联物进行免疫染色 50 µL 每孔的工作体积。 - 在共聚焦显微镜下使用20倍物镜对MAP支架中的细胞进行成像，并获取贯穿200-250 µm 在Z方向上以步长 2.5 µmDAPI（核染色剂，用含0.15% Triton-X的1×PBS缓冲液按1:1000稀释）和鬼笔环肽-647（F-肌动蛋白染色剂，用含0.15% Triton-X的1×PBS缓冲液按1:40稀释）荧光染色示例见于 图5E，F 在MAP支架中培养3天的固定D1细胞。
注意：玻璃表面的等离子处理会增加其亲水性，这已被证明可增强细胞黏附。在细胞培养孔底部可能会观察到细胞铺展，但在评估细胞对 MAP 支架的响应时，这些细胞不应被纳入细胞计数或细胞体积定量分析。
- 制备MAP支架组分（即 µgels，HA-Tet，培养基体积）根据目标颗粒组分确定（参见 图 4D-）。称取冻干粉的重量µgels 在无菌操作台中，根据所选的 wt% MAP，用相当于最终 MAP 体积 84% 的细胞培养基重悬。静置使其溶解。 µgels 膨胀约 20 分钟。
图5在MAP支架中进行细胞培养。 (A用于制备细胞培养孔的模具可通过3D打印并用PDMS浇铸成型。整个模具直径为95 mm，大孔直径为6 mm，小内孔直径为4 mm。B将细胞培养装置用PDMS浇铸后，通过等离子体键合技术将其与盖玻片结合，以提升显微成像性能。C细胞培养孔的横截面显示了培养基的储存区（~50 µL）以及一个较小的储液池，用于将细胞接种到MAP支架上（~10 µL). (D) 将细胞接种至MAP支架的过程首先依赖于冻干支架的再水化µgels 按用户所需的 wt% 配制，随后与细胞及交联剂混合以实现交联 µgels. (E细胞可被包封于不同质量百分比（wt%）的MAP支架（绿色）中。代表性图像来自MAP支架中D1细胞培养的第5天（比例尺 = 100 µm). (F单个Z平面图像显示了在含有不同质量百分比MAP的支架中细胞生长的差异（比例尺 = 50 µm）。转载自 Anderson 等人。12 经爱思唯尔许可。 请点击此处以查看此图的放大版本。
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结果
本实验方案旨在演示如何制备具有生物正交交联体系及可控颗粒分数的微孔退火颗粒（MAP）支架，用于三维细胞培养。首先，透明质酸（HA）被修饰上降冰片烯侧基，用于微凝胶的形成以及后续交联以构建MAP支架。采用该方法，约31%的HA重复单元成功引入了降冰片烯功能基团（图1A）。具有流动聚焦区域的微流控装置（图1B) 被证明可生成 HA-NB µ约50的凝胶 µ米或约100 µ微米直径（图1C,D）。 µ本研究中使用的凝胶平均直径为92 µm（Q1 = 79） µm，Q3 = 103 µm) (图1E).
为了控制颗粒分数， µ凝胶被干燥 通过 冻干图 2A
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讨论
已证明，采用微流控技术制备HA-NB微凝胶所获得的微凝胶粒径分布比乳液批量法更窄3,9。本方案中描述的微凝胶使用了一种基质金属蛋白酶（MMP）可切割交联剂（Ac-GCRDGPQGIWGQDRCG-NH2）进行交联，以支持材料的降解。 然而，HA-NB微凝胶也可使用其他二巯基交联剂（如二硫苏糖醇，DTT）进行交联，但此类交联剂不可降解。类似地，也可在HA-NB前体溶液中使用其他光引发剂（如Irgacure 2959，即2-羟基-4-(2-羟基乙氧基)-2-甲基苯丙酮）替代LAP，以促进巯基-烯烃交联反应10。本研究中微凝胶的组成为3.5 wt% HA，该浓度依据先前研究确定，因3.5 wt%前体溶液的黏度适合在微流控平台上通过剪切作用形成液滴6。其他研究者也报道过在流动聚焦式微流控装置上使用较低浓度（3 wt% HA-NB）前体溶液制备HA-NB微凝胶的方法8<...
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披露
ARA 和 TS 已针对此项技术提交了临时专利申请。
致谢
作者感谢美国国立卫生研究院、美国国立神经疾病与卒中研究所（1R01NS112940、1R01NS079691、R01NS094599）以及美国国家过敏与传染病研究所（1R01AI152568）的支持。本研究部分工作在杜克大学共享材料仪器设施（SMIF）完成，该设施是北卡罗来纳研究三角园纳米技术网络（RTNN）的成员，由美国国家科学基金会（资助编号ECCS-2025064）资助，属于国家纳米技术协调基础设施（NNCI）的一部分。作者感谢实验室前博士后Lucas Schirmer博士以及Ethan Nicklow在制备用于细胞培养实验的3D打印装置过程中提供的帮助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1 mL 鲁尔锁接头注射器，无菌，一次性使用，聚碳酸酯材质 | BD | 309628 | |
| 5 mL 鲁尔锁接头注射器，无菌，一次性使用，聚碳酸酯材质 | BD | 309646 | |
| Alexa Fluor 488 C5 马来酰亚胺 | Invitrogen | A10254 | 用于合成荧光标记的四嗪 |
| Alexa Fluor 647 鬼笔环肽 | Invitrogen | A22287 | 用于细胞培养样品染色 |
| 铝箔 | VWR | 89107-726 | |
| 带推杆活检打孔器，1.0 mm | Integra Miltex | 69031-01 | |
| 活检打孔器，4 mm | Integra Miltex | 33-34 | |
| 钝头针，23 G 0.5"，非无菌，带帽 | SAI Infusion Technologies | B23-50 | |
| 瓶顶式真空滤器，0.22 μm | Corning | CLS430521 | |
| 氯化钙 | VWR | 1B1110 | 用于微凝胶洗涤缓冲液 |
| 正排量移液器用毛细管-活塞组件，最大体积 1000 μL | Rainin | 17008609 | |
| 正排量移液器用毛细管-活塞组件，最大体积 25 μL | Rainin | 17008605 | |
| 正排量移液器用毛细管-活塞组件，最大体积 250 μL | Rainin | 17008608 | |
| Countess 细胞计数板 | Invitrogen | C10228 | |
| Countess II FL 全自动细胞计数仪 | Invitrogen | AMQAF1000 | |
| 离心管，15 mL | CELLTREAT | 667015B | |
| 离心管，50 mL | CELLTREAT | 229421 | |
| 氯仿，ACS 级，玻璃瓶装 | Stellar Scientific | CP-C7304 | 用于合成荧光标记的四嗪 |
| 电晕等离子枪，BD-10A 高频发生器 | ETP | 11011 | |
| 冻存管，聚丙烯材质，内螺纹带螺旋盖 | Nunc | 368632 | |
| D1 小鼠间充质细胞 | ATCC | CRL-12424 | 用于 MAP 凝胶中培养的示例细胞系 |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | 用于细胞培养样品染色 |
| 重水，99.9 原子% D | Sigma-Aldrich | 151882 | 用于核磁共振波谱分析 |
| 透析袋，再生纤维素膜，截留分子量 12–14 kDa | Spectra/Por | 132703 | 用于纯化 HA-NB 和 HA-Tet |
| 乙醚 | VWR | BDH1121-4LPC | 用于合成荧光标记的四嗪 |
| 二甲基甲酰胺 | Sigma-Aldrich | 277056 | 用于合成荧光标记的四嗪 |
| 4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉氯化物 (DMTMM) | TCI-Chemicals | D2919 | 用于修饰透明质酸 (HA) |
| 二硫苏糖醇 (DTT) | Thermo Scientific | R0861 | 不可降解的二巯基连接子（可替代 MMP 可切割肽） |
| 杜尔贝科改良伊格尔培养基 (DMEM)，高糖，含 4500 mg/L 葡萄糖、L-谷氨酰胺、丙酮酸钠和碳酸氢钠，液体，经无菌过滤，适用于细胞培养 | Sigma-Aldrich | D6429-500ML | 用于 D1 细胞培养 |
| EMS 甲醛，颗粒状 | VWR | 100504-162 | 用于配制 4% 多聚甲醛 (PFA) |
| 无水乙醇（200 证明） | KOPTEC | 89234-850 | |
| 胎牛血清 (FBS) | ATCC | 30-2020 | 用于 D1 细胞培养 |
| 加热板 | Kopf Instruments | HP-4M | |
| 血细胞计数板及盖玻片 | Daigger Scientific | EF16034F | |
| 2-[4-(2-羟乙基)哌嗪-1-基]乙磺酸 (HEPES) | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| 透明质酸钠，平均分子量 79 kDa，由化脓性链球菌 (Streptococcus zooepidemicus) 细菌生产，药用级，微生物污染 <100 CFU/g，细菌内毒素 <0.050 IU/mg | Contipro | N/A | 本实验采用平均分子量为 79 kDa 的透明质酸钠用于 HA-Tet 合成，但这些方法也可适用于其他分子量。 |
| IMARIS Essentials 软件包 | Oxford Instruments | N/A | 显微镜图像分析软件 |
| 输注泵，双注射器 | Chemyx | N/A | |
| Kimwipe 纸巾 | Kimberly-Clark | 34120 | |
| 带支撑夹的实验室支架 | Geyer | 212100 | |
| 液氮 | Airgas | NI 180LT22 | |
| 苯基(2,4,6-三甲基苯甲酰)磷酸锂 | TCI-Chemicals | L0290 | |
| 冷冻干燥机 | Labconco | N/A | Labconco FreeZone 6 plus 已停产，但其他实验室级冷冻干燥机也可用于本实验方案。 |
| 甲基四嗪-PEG4-马来酰亚胺 | Kerafast | FCC210 | 用于合成荧光标记的四嗪 |
| 2-(4-吗啉基)乙磺酸 (MES) | Fisher Scientific | BP300-100 | 用于修饰透明质酸 (HA) |
| 显微盖玻片，24 × 60 mm，1 号 | VWR | 48393-106 | |
| 微流控装置 SU8 母版晶圆 | FlowJem | 定制设计，可在洁净室内部制备或外包生产 | |
| 矿物油，重质 | Sigma-Aldrich | 330760 | |
| MMP 可切割二巯基交联肽 (Ac-GCRDGPQGIWGQDRCG-NH2) | GenScript | N/A | |
| 5-降冰片烯-2-甲胺 | TCI-Chemicals | 95-10-3 | 用于 HA-NB 合成 |
| 封箱胶带 | Scotch | 3M 1426 | |
| Parafilm 封口膜 | Bemis | PM996 | |
| PEG(巯基)2 | JenKem Technology USA | A4001-1 | 用于合成荧光标记的四嗪 |
| 青霉素-链霉素，10,000 单位/mL | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | 用于 D1 细胞培养 |
| 培养皿，聚苯乙烯，一次性，直径 × 高 = 150 × 15 mm | Corning | 351058 | |
| 泊洛沙姆 F-127 | Sigma-Aldrich | P2443 | 用于洗涤 HMPs |
| 磷酸盐缓冲液 (PBS) 1× | Gibco | 10010023 | |
| RainX 玻璃防水处理剂 | Grainger | 465D20 | 用于微流控装置处理的合成疏水处理溶液 |
| RGD 肽 (Ac-RGDSPGERCG-NH2) | GenScript | N/A | |
| 橡胶圈 | Staples | 112417 | |
| 氯化钠 | Chem-Impex | 30070 | 用于透析 |
| 合成用 Span 80 | Sigma-Aldrich | 1338-43-8 | |
| Sylgard 184 硅酮弹性体 | Electron Microscopy Science | 4019862 | 聚二甲基硅氧烷 (PDMS) 弹性体，用于制作微流控装置和组织培养装置 |
| 注射器滤器，Whatman Uniflo，0.2 μm PES，直径 13 mm | Cytvia | 09-928-066 | |
| Tetraview LCD 数码显微镜 | Celestron | 44347 | |
| 四嗪-胺盐酸盐 | Chem-Impex | 35098 | 用于 HA-Tet 合成 |
| 三乙胺 | Sigma-Aldrich | 471283 | 用于合成荧光标记的四嗪 |
| 三(2-羧乙基)膦 (TCEP) | Millipore Sigma | 51805-45-9 | |
| 吐温 X-100 | VWR | 97063-864 | |
| 台盼蓝溶液，0.4% | Thermo Fisher Scientific | 15250061 | |
| 胰蛋白酶 EDTA (0.25%)，含酚红 | Fisher Scientific | 25-200-056 | 用于消化贴壁细胞以接种于 MAP 凝胶中 |
| Tygon ND-100-80 非 DEHP 医用导管，针规=23，壁厚=0.020 英寸，内径=0.020 英寸，外径=0.060 英寸 | Thomas Scientific | 1204G82 | |
| 紫外光固化系统控制器，LX500 LED | OmniCure | 010-00369R | |
| 紫外光固化头，LED 点光源紫外 | OmniCure | N/A | |
| 紫外光强度计，Traceable | VWR | 61161-386 | |
| 真空干燥器 | Bel-Art | 08-594-15C | |
| X-Acto Z 系列精密美工刀 | Elmer's | XZ3601W |
参考文献
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