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方法文章

部分坐骨神经结扎：一种用于研究新型疗法镇痛效果的慢性神经病理性疼痛小鼠模型

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DOI：

10.3791/64555

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2022年10月6日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pharmacology, College of Medicine, The University of Arizona, Tucson, 2Department of Anesthesiology, College of Medicine, The University of Arizona, Tucson, 3Neuroscience Graduate Interdisciplinary Program, College of Medicine, The University of Arizona, Tucson, 4Comprehensive Pain and Addiction Center, The University of Arizona, Tucson, 5Department of Anesthesiology and Pain Management, University of Texas Southwestern Medical Center

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

坐骨神经部分结扎可诱导产生持续时间较长的慢性神经病理性疼痛，其特征是对热和机械刺激的反应显著增强。该神经病理性疼痛小鼠模型常用于研究疼痛管理方面的创新疗法。本文详细描述了手术操作步骤，以提高实验的标准化程度和可重复性。

摘要

慢性疼痛的治疗至今仍面临挑战，现有疗法常伴随不良反应，包括耐受性和成瘾性。慢性神经病理性疼痛由躯体感觉系统的损伤或疾病引起。为了研究副作用更少的潜在疗法，动物疼痛模型在临床前研究中被视为金标准。因此，特征明确且描述详尽的动物模型对于创新疗法的开发与验证至关重要。

坐骨神经部分结扎术（pSNL）是一种可在小鼠中诱导慢性神经病理性疼痛的操作，其特征表现为机械性与热性痛觉过敏、持续性疼痛以及肢体温度的改变，因此该模型非常适合用于神经病理性疼痛的临床前研究。pSNL 是研究神经病理性疼痛的有利模型，因其可重现人类神经病理性疼痛患者中观察到的多种症状。此外，该手术操作相对快速且易于实施。对单侧肢体实施 pSNL 可实现同侧与对侧足底的比较，同时也可用于评估中枢敏化现象。

为了诱导慢性神经病理性痛觉过敏，使用9-0不可吸收尼龙线结扎坐骨神经的背侧三分之一。本文描述了该手术操作过程，并通过多种常用的行为学测试对慢性神经病理性疼痛的发展进行表征。鉴于目前有大量创新疗法正在被研究用于治疗慢性疼痛，本文为神经病理性疼痛诱导手术的标准化提供了关键概念，并准确描述了所需手术操作。

引言

慢性疼痛是全球范围内重要的医疗健康问题，也是美国医疗体系中成本最高的健康问题之一。当采用多学科方法结合药物和非药物治疗手段时，慢性疼痛的管理效果更佳1。然而，慢性疼痛的治疗仍具挑战性，在某些情况下无法充分缓解疼痛症状2。因此，亟需开发新的和辅助性的治疗方法以改善慢性疼痛的管理，而动物模型对于探索创新疗法至关重要。

慢性神经病理性疼痛由躯体感觉系统的损伤或疾病引起，包括糖尿病、感染、神经受压或自身免疫性疾病3。神经病理性疼痛依赖于外周和中枢敏化机制，并起源于神经的损伤。这种疼痛的特征包括触觉和热刺激诱发的痛觉过敏和异常性疼痛、持续性疼痛，以及受累肢体温度的改变4。为了更好地理解其机制并推动新疗法的发展，研究人员已在啮齿类动物中建立了多种模型，以模拟神经病理性疼痛的症状和病因5。例如，可通过化疗药物注射、脊神经结扎（SNL）、坐骨神经慢性压迫损伤（CCI）、部分坐骨神经结扎（pSNL）、保留神经损伤、坐骨神经横断或坐骨神经三分支切断等方法诱导神经病理性疼痛6。值得注意的是，坐骨神经结扎可重现人类神经病理性疼痛的多种特征，如机械性和热性高敏感性，以及受累肢体的温度变化，这些特征与复杂性区域疼痛综合征（CRPS）相符7。因此，该模型非常适合用于研究CRPS或任何其他引起慢性神经病理性疼痛的神经损伤相关疾病。该模型最早由Seltzer于1990年建立8，现已被广泛应用于疼痛研究中，用于探索新型镇痛化合物或评估慢性疼痛对认知功能的影响9,10,11,12,13。该模型具有高度可重复性，且部分结扎保留了动物对外周刺激的行为反应能力6。

目前使用的许多模型存在一些在pSNL模型中未观察到的缺陷。CCI模型由于结扎环松紧程度不同，导致每只动物的损伤程度变异较大，且自噬行为会改变后肢足趾，使该模型不适合进行行为学分析6。SNL模型的手术过程更为复杂且耗时较长，不仅需要较高的技术操作水平，还存在较高风险导致严重的运动功能缺陷3。这些缺陷在pSNL模型中均未出现。pSNL模型具有易于重复、手术时间短以及术后运动功能缺陷风险较低等优点，因此在研究外周神经病理性疼痛方面具有重要价值8,14。然而，部分结扎手术本身在不同操作者之间仍可能存在差异，导致结扎的神经纤维数量不一致。因此，详细描述手术操作步骤对于提高不同研究间的可重复性至关重要。

为诱导慢性神经病理性疼痛，使用一根9-0不可吸收尼龙缝线结扎坐骨神经三分之一宽度。术后，动物对热刺激和机械刺激的反应显著增强，从术后第1天开始并持续超过50天8。本研究在28天内采用Hargreaves法、热板实验和von Frey纤维丝测试评估了热觉和机械觉敏感性。所有行为学检测均证实了该模型具有持久性高敏感反应的一致特征。已有研究表明，该模型对吗啡和布洛芬均呈现剂量依赖性反应，表明其非常适合用于临床前镇痛研究。值得注意的是，本文描述了一种独特的手工制作玻璃工具的操作指南，该工具被称为"神经玻璃钩"。该工具可替代镊子用于术中神经操作，以避免造成意外的附加神经损伤。

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方案

所有实验程序均经亚利桑那大学机构动物照护与使用委员会批准，并符合美国国立卫生研究院（NIH 出版物编号 80-23，1966 年）关于实验动物使用指南的规定。使用无病原体的成年 C57Bl6/J 小鼠（测试时体重：22–28 g），将小鼠饲养在标准动物房鼠笼中（每笼五只），环境为温度可控的房间，光照周期为 12 小时明/暗循环，可自由获取食物和水。ad libitum。所有行为学实验均由对处理条件设盲的实验人员进行。

1. 基线：机械敏感性的测量

  1. 小鼠到达后，先在动物房适应环境1周。随后，让动物适应实验人员的抓取操作，适应时间不少于7天。
  2. 将小鼠置于透明的聚甲基丙烯酸甲酯（Plexiglas）盒子中，在测试前1小时适应von Frey测试装置，盒子放置于金属丝网上，位置与测试房间相同——最好在适应期间实验人员也在房间内。
  3. 建立基础的足爪缩回阈值 通过 的 "上下法" 使用 von Frey 纤维丝的方法，如文中所述 补充表 S1，从3.61（3.9 mN）的纤维开始。
    1. 使用一系列校准的精细单丝（von Frey纤维丝）垂直刺激悬置于金属丝网笼中的pSNL模型动物同侧后肢足底中部，测量其缩足反应。通过以下方法评估机械敏感性： "上下法" 方法15通过依次增加或减少刺激强度（对应于细丝的尺寸）来确定缩足阈值。每个细丝依次使用一次。
      注意：为了获得动物之间一致的结果，实验人员必须避免刺激任何足垫。
    2. 例如，如果动物对3.61细丝无反应，则使用更粗的4.08细丝（9.8 mN）（反应表现为受累足爪的回缩、抖动或舔舐，通过肉眼观察记录）；如果动物首次即出现反应，则改用更细的3.22（1.6 mN）细丝。根据动物后续反应为阳性或阴性，分别继续使用逐渐变细或逐渐变粗的细丝进行测试。将阴性和阳性反应记录于所提供的数据表中 补充表 S1首次出现阳性反应后，使用不同的细丝对该只爪子再进行4次测试。

2. 基线：利用哈格雷夫斯试验测量热敏感性

  1. 小鼠到达后，让其在动物房适应环境1周。之后，再让动物适应实验人员的抓取操作，时间不少于7天。
  2. 在测试前1小时，将小鼠置于透明的聚甲基丙烯酸甲酯（Plexiglas）盒子中，放置于与测试房间相同的房间内，最好在适应期间实验人员也在房间内，以使小鼠适应Hargreaves测试装置。
    注意：Hargreaves测试要求动物静止站立数秒。对于小鼠而言，充分的适应是实验成功的关键。因此，若小鼠在适应1小时后仍表现活跃，应根据需要延长其适应时间。
    1. 按照Hargreaves等人所述方法测定足底回缩潜伏期16。将小鼠置于聚甲基丙烯酸甲酯（Plexiglas） enclosure 内，放置于透明的聚甲基丙烯酸甲酯板上进行适应。
    2. 将一束辐射热源（高强度投影灯）聚焦于坐骨神经部分结扎侧（pSNL同侧）后肢足底表面。调节热源强度，使基础足底回缩潜伏期约为10秒。此后，在整个实验过程中保持热源强度恒定。
    3. 当足部回缩时，等待运动探测器自动停止刺激和计时器。设定最长截止时间为33.5秒，以防止组织损伤。
      注意：该截止时间是基于以往实验和文献确定的，旨在避免额外的皮肤损伤11,17,18。在本研究所用Hargreaves装置下，33.5秒对应刺激强度30（50 W），为防止组织损伤所设定的上限。所观察到的行为为反射性行为，而非自主行为。
    4. 使用Hargreaves装置，对pSNL同侧后肢足底表面进行照射，测定基础足底回缩潜伏期。启动热刺激并记录回缩潜伏期。为避免影响热刺激的温度，实验过程中应及时清理尿液。

3. 基线：利用热板试验测量热敏感性

  1. 在测试前将动物置于测试室内适应环境1小时。
    注意：由于室温对热板实验的反应有重要影响，需确保在适应期及测试期间室温始终保持在约22 °C。
  2. 将热板温度设定为52 °C，该温度已被证明可理想地诱发厌恶性热反应19。
  3. 将动物放入测试装置中，并启动计时器。
  4. 观察伤害性防御行为（即抬足、舔足、抖足）。由于pSNL手术影响的是后肢，因此忽略前肢出现的任何行为（尤其是前肢舔舐）。
  5. 一旦观察到伤害性防御行为，立即停止计时。
  6. 将动物从装置中移出，并记录该行为的潜伏期。
    注意：为防止组织损伤，动物在装置中的时间最长不得超过30秒。此外，需注意所观察到的行为属于反射性行为，而非自主行为。
  7. 每只动物测试后，使用70%乙醇清洁测试装置，以减少气味对后续动物行为的影响。为避免影响热刺激的温度，每次测试后需清除装置内残留的尿液。
  8. 为验证实验结果，可在测试过程中录制动物在热板装置内的视频，以便在测试结束后进行回看分析。
    ​注意：通过视频回放分析潜伏期，实验人员可多次观察测试过程，并仔细分析在实时观察中可能遗漏的伤害性防御行为。

4. 术前准备

注意：确保在手术后有干净的笼具用于饲养小鼠。使用70%乙醇清洁手术区域，用70%乙醇对手部进行消毒，佩戴无菌手套，穿戴适当的个人防护装备（PPE）（实验服、发网、鞋套），并在整个手术过程中严格执行无菌操作技术。

  1. 通过预先高压灭菌，准备手术中将使用的工具（补充图 S1）和其他资源（纱布）。
  2. 使用挥发性异氟烷诱导麻醉，并根据需要调整剂量以维持外科手术所需的麻醉深度，确保氧气流量处于适当水平。
  3. 为确认动物已处于麻醉状态，用镊子夹捏后肢脚趾，检查是否存在足部回缩反射，并在涂抹润滑性眼膏前检查角膜眨眼反射。
    ​注意： 本研究中不能使用镇痛剂，因为它们可能改变拟分析的疼痛通路，甚至中和或使依据疼痛研究目标所测量的行为无效20,21,22。
  4. 选定手术侧（此处以左侧为例），剃除动物大腿区域的毛发，范围包括向髌骨方向的下方、向髋关节方向的上方以及股骨上方区域。使用三块独立的纱布，单向交替擦拭3次氯己定溶液和 温热的无菌生理盐水。
    ​注意：后续实验中，应确保所有动物均在同一侧肢体进行手术，以保持一致性。
  5. 将腿穿过一块10 cm × 10 cm无菌洞巾上的切口，以在选定的腿部周围建立无菌区域。

5. 手术步骤

  1. 使用精细的手术剪刀（补充图 S1F），在大腿外侧中线处做一长约2 mm的皮肤切口。将剪刀置于皮肤下方，以环形动作滑动，穿透筋膜并建立通路，扩大切口空间。
  2. 使用结扎钳（补充图 S1H），在大腿肌肉上垂直进行锐性切开，角度为90°，深度为1 cm。
  3. 将精细小剪刀（补充图 S1G）插入同一切口，同样保持90°角，轻轻张开剪刀以分离肌肉组织。持续操作，直至可视坐骨神经。
  4. 定位坐骨神经，其外观可能呈光泽且纤细，沿大腿纵轴从髋部向膝部走行。在继续下一步操作前，将剪刀和结扎钳从体内取出。
  5. 使用超细镊子（补充图 S1D）和神经玻璃钩（补充图 S1E）从下方分离神经。在靠近股骨大转子处（即最接近髋部、离膝部最远的位置），小心地将神经从周围结缔组织中游离出来。
  6. 让神经自然 resting 在玻璃棒上，并确保玻璃棒末端可防止神经滑脱。
  7. 在坐骨神经分出腓总神经、胫神经和腓肠神经分支之前，使用9-0尼龙缝线对神经宽度的1/3处打外科结进行结扎3。
    NOTE: 神经分支发生在坐骨神经向膝部下行过程中，远离髋部。由于这三条神经分支具有不同的支配区域，因此必须在分支前进行结扎，以确保所有动物手术中产生一致的神经功能缺损。
  8. 拉紧缝线时，应注意将线握持在靠近结的位置，避免对神经施加过大的牵拉力，防止神经从玻璃棒上滑脱或造成进一步的牵拉性损伤。
  9. 完成结扎后，小心地将神经从玻璃棒上滑下，并将其复位至肌肉分离层面以下的原始位置。
  10. 使用可吸收性聚乙醇酸5-0缝线缝合肌肉切口；另用不可吸收性聚丙烯6-0缝线缝合皮肤。
  11. 记录手术结束及麻醉停止时间。将小鼠单独置于恢复笼中苏醒，之后再转移至新的清洁笼具中。
    ​NOTE: 手术过程中应定期轻捏动物脚趾，确认麻醉维持充分，并监测其呼吸及体表灌注情况（红色、粉红、苍白）。若呼吸明显减弱或动物出现苍白，应考虑降低麻醉气体流量或增加氧气流量，并准备好装有生理盐水的注射器，以便皮下注射以补充水分。在整个手术过程中，动物下方应始终放置热源以维持体温。

6. 对照动物的假手术操作步骤

  1. 按照手术步骤 5.1-5.11 进行；排除步骤 5.4-5.9。

7. 术后行为学测试

注意：确保实验操作者对任何处理措施保持盲态。慢性神经病理性疼痛将在术后2周内逐渐形成，此后可在给予目标化合物后进行行为学测试。

  1. 使用 von Frey、Hargreaves 或热板实验评估热和机械性痛觉过敏及其可能的逆转情况。
  2. 若动物达到机构动物护理与使用委员会所述的实验终点标准，应将其移出研究。
  3. 行为学测试结束后，按照机构动物护理与使用委员会规定的程序对动物实施安乐死。

8. 数据分析

  1. von Frey：
    1. 采用 Chaplan 及其同事所述的 Dixon 非参数法分析数据23，并将数据表示为平均缩足阈值。
      1. 在所引用软件的主页面（参见材料表），选择研究中使用的所有纤维丝（2.44、2.83、3.22、3.61、4.08、4.31 和 4.56）。在group面板中，选择对应于最后一次测试的纤维丝。在blank框中，记录阳性（X）和阴性（o）反应。记下响应模式左侧框中报告的阈值。
        注意：响应模式及量化示例见补充图 S2。
  2. Hargreaves 和热板实验：
    1. 将潜伏期数据记录于电子表格中，以供进一步的统计分析。
    2. 以时间函数形式绘制敏感性（阈值或潜伏期）的均值结果图。

9. 制作神经玻璃钩的说明

注意：整个操作过程中需注意防火安全。根据需要佩戴适当的防护装备，例如耐热手套或护目镜。

  1. 打开本生灯。
  2. 用一只手握住玻璃棒（A）的一端，将其置于火焰中。当该玻璃棒开始熔化时，用另一只手中的另一根玻璃棒（B）引导并拉伸玻璃棒 A 上熔化的部分。将玻璃棒 A 从火焰中移开，使熔化端自然向内卷曲形成小球状，用玻璃棒 B 辅助引导该形状。

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结果

通过部分结扎C57Bl6/J雄性小鼠的坐骨神经诱导慢性神经病理性疼痛（图1A）。使用von Frey纤维丝和“上下法”评估机械敏感性。利用Hargreaves试验和热板试验评估对热的热敏感性。所有数据均采用重复测量双因素方差分析（ANOVA）并结合Geisser-Greenhouse校正进行分析，以比较pSNL手术与假手术动物随时间的变化，或不同剂量吗啡和布洛芬的作用效果。

在术后28天内，接受pSNL手术的小鼠对机械刺激的阈值低于假手术组动物（图1B）。热敏感性评估也得到类似结果；pSNL动物在受到辐射热刺激后的 paw回缩潜伏期延长（图1C），当动物被放置在52 °C的热板上时，其回缩潜伏期也增加（图1D）。

在手术后14天建立慢性神经病理性疼痛模型后，我们评估了不同剂量的吗啡或布洛芬的...

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讨论

慢性疼痛的治疗通常需要长期用药，这使得疼痛管理具有挑战性。因此，临床前模型是评估依赖药物或非药物方法的创新疗法潜在益处的重要工具。由于不同研究人员在手术技术上的差异较大，现有的多种慢性神经病理性疼痛模型存在变异性增加的问题，导致可重复性降低。因此，有必要在多个经过充分表征且标准化的模型中，对新疗法可能具有的镇痛效果进行系统评价。

本报告表明，采用相对低成本的方法对坐骨神经进行部分结扎，可在小鼠中诱导出长期持续的慢性神经病理性疼痛。部分坐骨神经结扎（pSNL）会增强动物对热刺激和机械刺激的反应，且该模型对常用镇痛药物的反应呈剂量依赖性。因此，pSNL模型似乎是评估新药潜在疗效的一种简便且敏感的模型。神经病理性疼痛的主要特征是痛觉过敏和异常性疼痛。本报告阐述了机械性异常性疼痛和热痛觉过敏如何受到影响，但未测量机械性痛觉过敏。异常性疼痛与痛觉过敏之间存在较大的重叠区域。这两种感觉均属于对感觉刺激普遍过敏的范畴24。因此，受刺激产生的感觉可能被感知为另一种感觉，例如将热感误认为冷痛，或将触觉感知为灼烧感。因此，痛觉过敏与异常性疼痛常常难以区分...

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披露

作者声明无任何利益冲突。本论文的作者均未以任何形式获得报酬、报销或酬金。作者与本研究相关的任何供应商或制药公司均无关联。

致谢

本研究由国家补充与综合健康中心 [R01AT009716, 2017]（M.M.I.）、亚利桑那大学综合慢性疼痛与成瘾中心（M.M.I.）以及亚利桑那大学图森分校医学院医学科学家培训项目（MSTP）资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
5/0，FS-2，30" 未染色PGA聚乙醇酸合成可吸收编织缝线CP Medical421Ahttps://cpmedical.com/suturesearch/product/421a-visorb-50-fs-2-30/
6/0，P-1，18" 蓝色聚丙烯单丝不可吸收缝合线CP Medical8697Phttps://cpmedical.com/suturesearch/product/8697p-polypro-60-p-1-18/
9/0（0.3 克）黑色单丝尼龙缝合线Crestpoint OphthalmicsMANI 1407https://crestpointophthalmics.com/mani-1407-suture-trape-spatula-nylon-black-mono-box-of-12.html
痛觉过敏软件 National Instruments, LabView 2015平均抬足阈值（Von Frey 数据）的量化
C57Bl6/J 小鼠 杰克逊实验室，巴港，缅因州000664https://www.jax.org/strain/000664
Castroviejo持针器Fine Science Tools12565-14https://www.finescience.com/en-US/Products/Wound-Closure/Needle-Holders/Castroviejo-Needle-Holder/12565-14
冷热板试验BiosebBIO-CHPhttps://www.bioseb.com/en/pain-thermal-allodynia-hyperalgesia/563-cold-hot-plate-test.html
用于冯弗雷试验的 elevated 金属网架BiosebBIO-STD2-EVFhttps://www.bioseb.com/en/pain-mechanical-allodynia-hyperalgesia/1689-elevated-metal-mesh-stand-30-cm-height-to-fit-up-to-2-pvf-cages.html
超精细格拉夫镊Fine Science Tools11152-10https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-curved-medium-point-general-purpose-forceps/16100110
精细卡斯特罗维霍持针器Simovision/Geuder17565https://simovision.com/assets/Uploads/Brochure-Geuder-Ophthalmic-Surgical-Instruments-EN2.pdf
精细剪刀（11.5 cm）Fine Science Tools14558-11https://www.finescience.com/en-US/Products/Scissors/Standard-Scissors/Fine-Scissors-Tungsten-Carbide-ToughCut%C2%AE/14558-11
精细剪刀（9 cm）Fine Science Tools14558-09https://www.finescience.com/en-US/Products/Scissors/Standard-Scissors/Fine-Scissors-Tungsten-Carbide-ToughCut%C2%AE/14558-09
虹膜镊精细科学工具11064-07https://www.finescience.com/en-US/Products/Forceps-Hemostats/Fine-Forceps/Iris-Forceps/11064-07
微型Adson镊Fine Science Tools392487https://www.fishersci.com/shop/products/micro-adson-tissue-forceps-1x2-teeth-german-steel/13820072#?keyword=adson%20forceps
用于大鼠和小鼠的模块化笼具支架BiosebBIO-PVFhttps://www.bioseb.com/en/pain-mechanical-allodynia-hyperalgesia/1206-modular-holder-cages-for-rats-and-mice.html
Moretti/Effetre #240 浅钴蓝玻璃棒 4 mmEbayN/Ahttps://www.ebay.com/itm/402389491328?hash=item5db0485e80:g:agYAAOS
w9CtfnIVJ&amdata=enc
%3AAQAHAAAAwCoqvgWRo
NTe5Vq8PWOgfE4ygWeW4tL
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020SGs9LPDXLL5w21un7jrM0
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4w2Iw45QqsSyXH2cuUKRom0
AGBoBaIr%2BbJw1VnlMjGuc9dtx
4fbPbqoBNSWjj3RbZPOPTYS8Q
%3D%3D%7Ctkp%3ABk9SR4q6-
6LfYA
热刺激足底测试 - Hargreaves 仪器Ugo Basile37570https://ugobasile.com/products/categories/pain-and-inflammation/plantar-test-for-thermal-stimulation
触觉测试感觉评估器，20根单丝套装North Coast MedicalNC12775-99https://www.ncmedical.com/products/touch-test-sensory-evaluators_1278.html
持针钳Duckworth & Kent2-504ER8https://duckworth-and-kent.com/product/tying-forceps-9/

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