部分坐骨神经结扎术:慢性神经性疼痛的小鼠模型，用于研究新疗法的抗伤害感受作用

摘要

坐骨神经部分结扎可诱发长期慢性神经性疼痛，其特征是对热和机械刺激的夸张反应。这种神经性疼痛的小鼠模型通常用于研究疼痛管理的创新疗法。本文详细介绍了提高标准化和可重复性的外科手术。

摘要

直到今天，慢性疼痛的管理仍然具有挑战性，目前的治疗与不良反应有关，包括耐受性和成瘾。慢性神经性疼痛由躯体感觉系统的病变或疾病引起。为了研究减少副作用的潜在疗法，动物疼痛模型是临床前研究的金标准。因此，特征明确且描述良好的模型对于创新疗法的开发和验证至关重要。

坐骨神经部分结扎术（pSNL）是一种诱发小鼠慢性神经性疼痛的手术，其特征是机械和热超敏反应，持续疼痛和肢体温度变化，使该模型非常适合临床前研究神经性疼痛。pSNL是研究神经性疼痛的有利模型，因为它再现了在患有神经性疼痛的人类中观察到的许多症状。此外，外科手术相对快速且直接执行。单侧 pSNL 可比较同侧和对侧爪，以及评估中枢致敏。

为了诱导慢性神经性超敏反应，使用9-0不可吸收的尼龙线连接坐骨神经的背侧三分之一。本文描述了外科手术，并通过多种常用的行为测试来表征慢性神经性疼痛的发展。由于现在正在研究大量用于治疗慢性疼痛的创新疗法，本文提供了标准化的关键概念，并准确描述了诱发神经性疼痛所需的手术。

引言

慢性疼痛是全世界一个重大的医疗保健问题，也是美国最昂贵的健康问题之一。当以多学科方式同时使用药理学和非药理学方式时，慢性疼痛可以得到更好的管理¹。慢性疼痛的管理具有挑战性，在某些情况下，不能充分治疗疼痛²。因此，需要新的补充方法来改善慢性疼痛管理，动物模型对于研究创新疗法至关重要。

慢性神经性疼痛由躯体感觉系统的病变或疾病引起，包括糖尿病、感染、神经压迫或自身免疫性疾病³.神经性疼痛依赖于外周和中枢致敏机制，起源于神经病变。这种疼痛的特征是触觉和热诱发的痛觉过敏和异常性疼痛、持续疼痛以及患肢温度变化⁴.为了更好地了解机制并推进新的治疗方法，已经在啮齿动物中开发了几种模型来模拟神经性疼痛的症状和原因⁵。例如，神经性疼痛可通过化疗药物注射、脊神经结扎术 （SNL）、坐骨神经慢性收缩损伤 （CCI）、pSNL、备用神经损伤、坐骨神经横断和坐骨神经三断⁶ 诱发。值得注意的是，坐骨神经结扎再现了在人类中观察到的神经性疼痛的多种特征，例如机械和热超敏反应，或受影响肢体的温度变化，这是复杂区域疼痛综合征（CRPS^）的特征7。因此，该模型非常适合研究CRPS或任何其他诱发慢性神经性疼痛的神经损伤影响。该模型最初由Seltzer于1990年开发8，广泛用于疼痛研究，以研究新型镇痛化合物或评估慢性疼痛的认知影响⁹，^10，11，^12，13。该模型具有很高的可重复性，部分连接保留了对外周刺激的行为反应⁶。

许多目前使用的模型都有在pSNL中没有观察到的缺点。CCI模型根据收缩器的紧密程度，每只动物之间的损伤变异性要高得多，并且自体切开术改变了后爪手指，使模型不适合行为分析⁶。SNL模型是一种更复杂，更长的手术，不仅需要先进的技术技能，而且还具有严重运动缺陷的高风险³。这些缺点在pSNL模型中没有看到。易于重现、手术持续时间短以及术后运动缺陷风险降低，使该模型对于研究周围神经性疼痛很有价值^8，14。然而，部分连接程序本身可能在实验者之间产生差异，导致连接神经纤维数量的一致性降低。因此，呈现手术的细节对于提高研究的可重复性至关重要。

为了诱发慢性神经病变，使用9-0不可吸收的尼龙缝合线来连接坐骨神经宽度的三分之一。手术后，对热和机械刺激的反应被夸大，从术后第 1 天开始，持续超过 50 天⁸。在这里，使用Hargreaves，热板和von Frey灯丝测试在28天内评估了热和机械灵敏度。所有的行为测定都证明了长期超敏反应的一致性。该模型已被证明具有吗啡和布洛芬的剂量依赖性作用，证实它非常适合临床前疼痛研究。值得注意的是，本文介绍了一种独特的手工玻璃工具的说明，称为"神经玻璃钩"。该工具用于代替镊子来操纵神经并防止手术过程中意外的额外神经损伤。

方案

所有程序均由亚利桑那大学机构动物护理和使用委员会批准，并符合美国国立卫生研究院的实验动物使用指南（NIH出版物编号80-23，1966）。将无病原体的成年C57Bl6 / J小鼠（测试重量:22-28g）饲养在气候控制房间的标准动物饲养小鼠笼（每笼五只小鼠）中，进行12小时的光照/黑暗 循环，并允许随意获取食物和水。所有行为实验均由对治疗条件不知情的实验者进行。

1.基线:机械灵敏度的量度

1. 小鼠到达后，让它们习惯于动物设施1周。然后，让动物习惯于实验者处理≥7天。
2. 在测试之前，通过将小鼠放在与测试室相同的房间的透明Plexiglas盒中，在金属丝网上，使小鼠习惯化1小时 - 最好在习惯化期间实验者在房间里。
3. 使用补充表S1中描述的冯弗雷细丝通过"上下"方法建立基线爪子退出阈值，从3.61（3.9 mN）细丝开始。
   1. 测量用一系列校准的细（von Frey）单丝探测足底中后爪的退出反应。将每根细丝垂直地施加到悬挂在金属丝网笼中的动物的pSNL同侧后爪的足底表面一次。使用"上下"方法¹⁵评估机械灵敏度:通过依次增加或减少对应于灯丝尺寸的刺激强度来确定退出阈值。依次应用每根细丝一次。
      注意:实验者必须避免刺激任何脚垫，以获得动物之间的一致结果。
   2. 例如，如果动物对 3.61 细丝没有反应，请使用较粗的 4.08 细丝 （9.8 mN）（反应在视觉上标记为退出、摇晃或舔受影响的爪子）;如果动物第一次有反应，请使用较细的 3.22 （1.6 mN） 细丝。继续使用逐渐减少或增加粗的细丝，具体取决于动物分别有积极的还是消极的后续反应。在 补充表S1中的数据表中报告否定和阳性响应。在第一个阳性反应后，用不同的细丝测试相同的爪子 4x。

2. 基线:使用哈格里夫斯测试测量热灵敏度

1. 小鼠到达后，让它们习惯于动物设施1周。然后，让动物习惯于实验者处理≥7天。
2. 在测试之前将小鼠习惯于哈格里夫斯测试装置1小时，将它们放在与测试室相同的房间的透明Plexiglas盒中 - 最好在习惯化期间实验者在房间内。
   注意:哈格里夫斯测试要求动物静止几秒钟。对于小鼠来说，习惯化是实验成功的关键。因此，如果小鼠在习惯化1小时后仍然非常活跃，则根据需要让它们适应更长时间。
   1. 确定 Hargreaves等人描述的爪子撤回延迟 ¹⁶.将小鼠置于透明有机玻璃板上Plexiglas外壳内。
   2. 将辐射热源（高强度投影灯）聚焦到与pSNL同侧的后爪足底表面。调整热源的强度以获得大约 10 秒的爪子撤回潜伏期基线。然后，在实验的其余部分保持强度恒定。
   3. 等待运动检测器在爪子抽出时自动停止刺激和计时器。使用最大截止时间为 33.5 秒以防止组织损伤。
      注意:临界值是根据以前的实验和文章确定的，以避免任何额外的皮肤损伤¹¹，^17，18。对于本研究中使用的强度，33.5是临界值，对应于使用哈格里夫斯装置的刺激强度为30（50 W）。观察到的行为是一种反射行为，而不是自愿行为。
   4. 使用哈格里夫斯装置建立基线爪退出潜伏期，并瞄准 pSNL 同侧后爪的足底表面。开始热刺激并记录戒断潜伏期。为避免影响热刺激的温度，请在试验期间清理任何尿液。

3.基线:使用热板测试测量热灵敏度

1. 在测试前将动物习惯在测试室1小时。
   注意:由于室温很重要，并且会影响对热板测试的反应，因此请确保在习惯期间和整个测试期间房间的温度始终保持在22°C左右。
2. 将热板设置为52°C，因为该温度已被证明可以理想地引起厌恶的热响应¹⁹。
3. 将动物放入测试室并启动计时器。
4. 观察伤害性行为（即爪子撤回、舔舐、摇晃）。由于 pSNL 手术会影响后肢，因此请忽略在前肢观察到的任何行为（尤其是前肢舔舐）。
5. 一旦观察到伤害行为，请立即停止计时器。
6. 将动物从腔室中取出并记录此行为的潜伏期。
   注意:最多 30 秒后将动物从腔室中取出，以防止组织损伤。此外，重要的是要注意，观察到的行为是一种反射行为，而不是自愿行为。
7. 在动物之间用70%乙醇清洁测试室，以减少气味的行为影响。为避免影响热刺激的温度，清洁每只被测动物之间的任何尿液装置。
8. 为了确认结果，请在测试期间在热板室中录制动物的视频，以便在动物接受测试后进行审查。
   注意:通过使用视频审查来量化延迟，实验者可以反复观察测试并仔细分析在实时观察过程中可能错过的伤害性行为。

4.术前准备

注意:确保干净的笼子可用于手术后恢复小鼠。用70%乙醇清洁手术区域，用70%乙醇消毒双手，使用无菌手套，穿戴适当的个人防护装备（PPE）（实验室外套，发网，鞋套），并在整个手术过程中练习无菌技术。

1. 通过事先高压灭菌，准备用于手术的工具（补充图S1）和额外资源（纱布）。
2. 使用挥发性异氟醚诱导麻醉，并根据需要进行调整以维持手术平面。确保氧气处于适当的流速。
3. 为确保动物被麻醉，用镊子捏住后爪上的脚趾以确保没有爪反射，并在涂抹润滑性眼药膏之前检查角膜眨眼反射。
   注意:本研究不能提供镇痛药，因为它们可能会改变要分析的疼痛途径，甚至中和和并使根据疼痛研究目标^20，21，22测量的行为无效。
4. 在选择在哪一侧进行手术时（此处演示了左侧），在大腿区域周围剃掉动物的后腿，下部朝髌骨，上部朝向髋部，股骨上方。用洗必泰用三个单独的纱布沿一个方向擦拭 3 次，用温热的无菌盐水交替擦拭。
   注意:展望未来，确保每只动物都在同一侧进行手术，以保持一致性。
5. 将腿滑入 10 cm x 10 cm 无菌窗帘制成的缝隙中，在所选腿周围形成无菌区域。

5. 外科手术

1. 使用精细手术剪刀（补充图S1F），在大腿外侧的中线切开2毫米的小切口。将剪刀以圆周运动滑入皮肤下以突破筋膜并产生间隙，从而扩大切口空间。
2. 使用绑钳（补充图S1H），在大腿肌肉上以90°角垂直创建一个尖锐的切口，深1厘米。
3. 将细小剪刀（补充图S1G）插入同一切口，也呈90°角，然后轻轻张开以分离肌肉。继续这样做，直到坐骨神经可视化。
4. 在髋关节到膝盖的方向找到坐骨神经，该神经可能看起来有光泽和薄，平行于垂直大腿。在继续之前，从身体上取下剪刀和绑钳。
5. 使用超细镊子（补充图S1D）和神经玻璃钩（补充图S1E）将神经从下方隔离。小心地将神经从股骨转子附近的周围结缔组织中解放出来，该部位最靠近髋部，距离膝盖最远。
6. 让神经停留在玻璃棒上，并确保杆的末端防止神经滚落。
7. 在将其分成腓总^神经、胫神经和腓肠神经分支之前，用 9-0 尼龙缝合线打一个手术结，以系紧坐骨神经宽度的 1/3。
   注意:分支发生在坐骨神经沿着膝盖向下移动，远离臀部时。由于神经的这三个分支有三种不同的神经支配，因此必须在分支之前放置手术结，以确保所有动物手术的神经缺陷相同。
8. 拉紧线时要注意将线靠近结，以免用力过猛拉神经，以免将神经从玻璃棒上滑落，避免进一步拉伸损伤。
9. 打结完成后，小心地将神经从玻璃棒上滑落，并将其塞回分离肌肉下方水平的原始位置。
10. 使用可吸收的聚乙醇5-0缝合线缝合肌肉切口。另外，使用不可吸收的聚丙烯6-0缝合线缝合皮肤。
11. 记录手术和麻醉停止时间。让鼠标独自在恢复笼中醒来，然后再将其放回新的干净笼子。
    注意:在整个手术过程中，捏住动物的脚趾以确认充分维持麻醉并监测其呼吸和身体灌注（红色、粉红色、苍白）。如果呼吸明显减少或动物脸色苍白，请考虑减少麻醉流量或增加氧气流量，并准备将装有生理盐水的注射器皮下注射以补充动物水分。在任何时候，动物都应该在它下面放置一个热源，以保持身体温暖。

6.对照动物假手术程序

1. 按照外科手术的步骤5.1-5.11;排除步骤 5.4-5.9。

7. 术后行为测试

注意:确保实验者对任何治疗都持盲法。慢性神经性疼痛将在手术后 2 周内发展，之后可以在施用感兴趣的化合物后进行行为测试。

1. 使用冯弗雷、哈格里夫斯或热板测试来评估热超敏反应和机械超敏反应及其潜在的逆转。
2. 如果任何动物符合机构动物护理和使用委员会描述的终点标准，则将其从研究中移除。
3. 在行为测试结束时，按照机构动物护理和使用委员会描述的程序对动物实施安乐死。

8. 数据分析

1. 冯·弗雷:
   1. 使用Dixon的非参数方法分析数据，如Chaplan及其同事²³所述，并将数据表示为平均退出阈值。
      1. 在参考软件的主页上（见 材料表），选择用于研究的所有细丝（2.44、2.83、3.22、3.61、4.08、4.31 和 4.56）。在 组 面板中，选择与上次模拟对应的灯丝。在 空白 框中，报告 正面 （X ） 和 负面 （o） 响应。记下观察到的响应模式左侧框中报告的阈值。
         注:模式和量化的示例见 补充图S2。
2. 哈格里夫斯和热板:
   1. 在电子表格中报告延迟以进行进一步的统计分析。
   2. 将结果绘制为灵敏度（阈值或延迟）的平均值作为时间的函数。

9.神经玻璃钩的制作说明

注意:在整个过程中实践消防安全。必要时佩戴适当的防护装置，例如耐热手套或眼镜。

1. 打开本生燃烧器。
2. 用一只手将玻璃棒（A）的一端握在火上。当这根玻璃棒熔化时，用另一只手用另一根玻璃棒（B）引导和拉动棒A上的熔化玻璃.从火中取出玻璃棒A，让熔化部分的末端自然向内滚动以形成小球形。使用玻璃棒B来引导此形状。

结果

通过C57Bl6 / J雄性小鼠坐骨神经的部分结扎诱导慢性神经性疼痛（图1A）。使用冯弗雷灯丝和"上下"方法评估机械灵敏度。使用哈格里夫斯和热板测试评估对热的热敏感性。所有数据均通过重复测量的双向方差分析与盖瑟温室校正进行分析，以比较pSNL手术随时间推移对假动物的影响或不同剂量吗啡和布洛芬的影响。

与假动物相比，接受pSNL手术的小鼠在28天内表现出较低的机械刺激阈值（图1B）。热超敏反应评估也获得了类似的结果;pSNL动物暴露于辐射热刺激后的爪子退出潜伏期增加（图1C），以及将动物放在52°C板上时的退出潜伏期（图1D）。

在建立慢性神经性疼痛后，手术后14天，我们评估了不同剂量吗啡或布洛芬的抗伤害感受作用。小鼠腹膜内注射盐水溶液或两种不同剂量的吗啡（1和5mg / kg）。注射吗啡的两...

讨论

慢性疼痛治疗通常需要长期药物治疗，使疼痛管理具有挑战性。因此，临床前模型是评估依赖药物或非药物方法的创新疗法的潜在益处的重要工具。由于不同研究人员之间手术技术的可变性增加，慢性神经性疼痛的众多模型带来了挑战，导致可重复性降低。因此，必须在多种模型中表征新疗法的潜在抗伤害感受作用，这些模型具有良好的特征和标准化。

该报告表明，坐骨神经的部分结扎导致使用相对便宜的方法在小鼠中发展出持久的慢性神经性疼痛。pSNL夸大了对热和机械刺激的反应，并且该模型以剂量依赖性方式响应常用镇痛药的给药。因此，pSNL模型似乎是评估新药潜在益处的方便和灵敏的模型。神经性疼痛的主要特征是痛觉过敏和异常性疼痛。本报告展示了机械性异常性疼痛和热痛觉过敏如何受到影响。然而，没有测量机械性痛觉过敏。异常性疼痛和痛觉过敏之间存在很大的灰色重叠区域。这两种感觉都属于对感觉刺激的一般超敏反应的保护伞²⁴.因此，受刺激的感觉可能被感知为另一种感觉，例如热作为冷痛或触摸作为灼热的感觉。因此，痛觉过敏和异常性疼痛通常难以区分，尤其是在动物疼痛模型中。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
5/0， FS-2， 30" 未染色 PGA 编织聚乙醇酸合成可吸收缝合线	CP Medical	421A	https://cpmedical.com/suturesearch/product/421a-visorb-50-fs-2-30/
6/0， P-1， 18" 蓝色聚丙烯单丝非吸收缝合线	CP Medical	8697P	https://cpmedical.com/suturesearch/product/8697p-polypro-60-p-1-18/
9/0（0.3 公制）尼龙黑色单丝缝合	Crestpoint 眼科	MANI 1407	https://crestpointophthalmics.com/mani-1407-suture-trape-spatula-nylon-black-mono-box-of-12.html
Allodynia Software	National Instruments， LabView 2015		平均戒断阈值的量化（Von Frey 数据）
C57Bl6/J 小鼠	杰克逊实验室，巴港，缅因	000664	https://www.jax.org/strain/000664
Castroviejo 针架	精细科学工具	12565-14	https://www.finescience.com/en-US/Products/Wound-Closure/Needle-Holders/Castroviejo-Needle-Holder/12565-14
冷热板测试	Bioseb	BIO-CHP	https://www.bioseb.com/en/pain-thermal-allodynia-hyperalgesia/563-cold-hot-plate-test.html
用于 Von Frey	Bioseb	BIO-STD2-EVF	https://www.bioseb.com/en/pain-mechanical-allodynia-hyperalgesia/1689-elevated-metal-mesh-stand-30-cm-height-to-fit-up-to-2-pvf-cages.html
超细 Graefe 镊子	Fine Science Tools	11152-10	的高架金属网架https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-curved-medium-point-general-purpose-forceps/16100110
精细卡斯特罗维耶霍针架	Simovision/Geuder	17565	https://simovision.com/assets/Uploads/Brochure-Geuder-Ophthalmic-Surgical-Instruments-EN2.pdf
精细剪刀（11.5 厘米）	精细科学工具	14558-11	https://www.finescience.com/en-US/Products/Scissors/Standard-Scissors/Fine-Scissors-Tungsten-Carbide-ToughCut%C2%AE/14558-11
精细剪刀 （9 cm）	精细科学工具	14558-09	https://www.finescience.com/en-US/Products/Scissors/Standard-Scissors/Fine-Scissors-Tungsten-Carbide-ToughCut%C2%AE/14558-09
鸢尾镊	精细科学工具	11064-07	https://www.finescience.com/en-US/Products/Forceps-Hemostats/Fine-Forceps/Iris-Forceps/11064-07
Micro Adson 镊子	Fine Science Tools	392487	https://www.fishersci.com/shop/products/micro-adson-tissue-forceps-1x2-teeth-german-steel/13820072#?keyword=adson%20forceps
用于大鼠和小鼠的模块化支架笼	Bioseb	BIO-PVF	https://www.bioseb.com/en/pain-mechanical-allodynia-hyperalgesia/1206-modular-holder-cages-for-rats-and-mice.html
Moretti/Effetre #240 浅钴蓝色玻璃棒 4 毫米	Ebay	N/A	https://www.ebay.com/itm/402389491328?hash=item5db0485e80:g:agYAAOS w9CtfnIVJ&amdata=enc %3AAQAHAAAAwCoqvgWRo NTe5Vq8PWOgfE4ygWeW4tL k81J1AFu%2Fkcbsk6pxYtJi6 digE5TL9SzlgMzYUMNDr%2B dku2%2B%2FEvB1qXqFmebE 020SGs9LPDXLL5w21un7jrM0 9xfWYvIz BYQYh6FRWyUJngC uuA9Bkjb9lxtZoYlg5y6PyFR2P 34xFk5xaNC5ib65M1%2Fr%2F 4w2Iw45QqsSyXH2cuUKRom0 AGBoBaIr%2BbJw1VnlMjGuc9dtx 4fbPbqoBNSWjj3RbZPOPTYS8Q %3D%7Ctkp%3ABk9SR4q6- 6LfYA
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