本方案描述了从小鼠单个骨骼肌中分离肌肉干细胞和纤维脂肪形成祖细胞的方法。该方案包括单块肌肉解剖、通过荧光激活细胞分选法分离干细胞、免疫荧光染色评估纯度,以及通过5-乙炔基-2′-脱氧尿苷掺入实验定量检测S期进入情况。
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本方案描述了从小鼠单个骨骼肌中分离肌肉干细胞和纤维脂肪形成祖细胞的方法。该方案包括单块肌肉解剖、通过荧光激活细胞分选法分离干细胞、免疫荧光染色评估纯度,以及通过5-乙炔基-2′-脱氧尿苷掺入实验定量检测S期进入情况。
骨骼肌中含有不同类型的成体干细胞群体,这些细胞参与组织的稳态维持与损伤修复。骨骼肌干细胞(MuSCs)能够生成新的肌肉组织,而纤维-脂肪生成祖细胞(FAPs)则参与间质支持性组织的形成,并具有分化为成纤维细胞和脂肪细胞的能力。MuSCs和FAPs均处于一种长期可逆的细胞周期退出状态,称为静息状态。这种静息状态对其功能至关重要。通常,静息态干细胞是从多个肌肉组织混合后的样本中进行纯化分离的。然而,近期研究表明,来源于不同肌肉的MuSCs在分子表达谱和静息深度上存在显著差异。本实验方案详细描述了从单个骨骼肌中分离和研究MuSCs与FAPs的方法,并提供了对干细胞活化过程进行分子分析的策略。方案中具体说明了如何分离并消化具有不同发育来源、厚度和功能的肌肉组织,例如膈肌、肱三头肌、股薄肌、胫骨前肌(TA)、腓肠肌(GA)、比目鱼肌、趾长伸肌(EDL)以及咬肌。MuSCs和FAPs通过荧光激活细胞分选技术(FACS)进行纯化,并通过免疫荧光染色和5-乙炔基-2'-脱氧尿苷(EdU)掺入实验进行分析。
由于存在肌肉干细胞(MuSCs),骨骼肌具有很强的再生能力。MuSCs 位于肌纤维上,基底膜下方,处于一种长期可逆性退出细胞周期的静息状态1,2,3,4。在肌肉损伤后,MuSCs 被激活并进入细胞周期,产生扩增的前体细胞,这些前体细胞可进一步分化并融合形成新的肌纤维2,5。先前的研究表明,MuSCs 对肌肉再生至关重要6,7,8。此外,单个 MuSC 能够植入并生成新的干细胞以及新的肌纤维9。骨骼肌中还存在一类间充质基质细胞,称为成纤维-脂肪生成前体细胞(FAPs),在肌肉再生过程中对支持 MuSC 功能发挥关键作用6,10,11,12。
由于肌肉干细胞(MuSCs)和纤维脂肪生成祖细胞(FAPs)在调控肌肉再生方面具有潜在作用,人们对其功能机制产生了极大研究兴趣。静息状态的MuSCs特征性表达转录因子Pax7和Sprouty1,以及细胞表面蛋白降钙素受体;而静息状态的FAPs则特征性表达细胞表面蛋白血小板源性生长因子受体α(PDGFRa)10,12,13,14,15。既往研究表明,可通过细胞表面标志物结合荧光激活细胞分选技术(FACS)从骨骼肌中纯化MuSCs和FAPs9,15,16,17,18,19,20,21。尽管这些方案显著提升了研究MuSCs和FAPs的能力,但其局限性在于大多数方法需要从多种肌肉组织混合样本中分离MuSCs。我们团队及他人的近期研究发现,从不同组织来源分离的MuSCs在细胞表型和基因表达水平上存在差异22,23。来自膈肌、肱三头肌和股薄肌的MuSCs比后肢远端肌肉的MuSCs激活速度更快22,而眼外肌来源的MuSCs则比膈肌和后肢远端肌肉来源的MuSCs分化速度更快23。
本方案描述了从单个骨骼肌中分离肌肉干细胞(MuSCs)和纤维-脂肪生成祖细胞(FAPs)的方法(图1)。包括膈肌、肱三头肌、股薄肌、胫骨前肌(TA)、比目鱼肌、趾长伸肌(EDL)、腓肠肌(GA)以及咬肌的解剖分离。解剖获得的肌肉组织随后通过胶原酶II(一种特异性靶向胶原蛋白中Pro-X-Gly-Pro氨基酸序列的蛋白酶,可降解结缔组织并实现组织解离24)和分散酶(dispase,一种可切割纤连蛋白和IV型胶原的蛋白酶,有助于进一步细胞解离25)进行酶消化解离。MuSCs和FAPs通过流式细胞荧光分选(FACS)从单细胞悬液中分离获得。作为下游细胞分析示例,通过检测5-乙炔基-2'-脱氧尿苷(EdU)掺入情况评估干细胞的活化状态,而细胞纯度则通过针对细胞类型特异性标志物Pax7和PDGFRa的免疫荧光染色进行鉴定。
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本方案的实施遵循奥胡斯大学的动物护理准则及当地伦理法规。
注意:务必遵守当地动物实验伦理委员会关于动物实验及啮齿类动物尸体样本处理的相关规定。小鼠可能是过敏原的潜在来源;如有条件,应开启排风装置,并将其置于工作区上方,以避免过度接触过敏原。或者,若需经常进行此类实验,应佩戴面部口罩。本方案涉及锐器操作,建议研究人员熟悉发生割伤时的急救措施及处理流程。
1. 准备(1-2 小时;解剖前一天)
注意:除非另有说明,所有溶液、培养皿和培养基均需在无菌条件下配制,并在使用前经0.45 µm滤膜过滤。配制分散酶(11 U/mL,溶于PBS)和胶原酶II(1.000 U/mL,溶于PBS)的储存液,并于-20 °C保存(表1)。在步骤4.2.6中,将储存液解冻后用于二次消化。
2. 准备(0.5 小时;解剖当天):
3. 肌肉解剖(20–30 分钟)
注意:本实验步骤在非无菌环境中进行。可使用一只或多只小鼠进行实验,但一只小鼠已足以制备用于分选的样品以及用于设定补偿和FACS门控的对照样本。
4. 肌肉组织消化制备单细胞悬液(约1小时35分钟)
注意:以下步骤包括非无菌操作环境(步骤 4.1-4.2)和无菌操作环境(步骤 4.3)。
5. 染色与分选(约40分钟 + 每样本30分钟分选时间)
注意:以下步骤需在无菌环境中并在冰上操作。
6. EdU 掺入实验
注意:在后续步骤中,需在无菌条件下操作,并在处理多聚甲醛(PFA)时使用化学通风橱。EdU 是一种核苷酸类似物,可在细胞通过细胞周期 S 期时掺入 DNA 中。高浓度下具有致突变性。操作 EdU 时务必佩戴手套。请查阅当地关于 EdU 废物处理的相关规定。
7. 免疫荧光染色
注意:本步骤可独立于第6部分进行。若跳过第6部分,请在继续执行下文的步骤7.2之前,先完成步骤6.3.1和6.3.2,以实现细胞通透化。
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遵循单个骨骼肌分离的实验方案(图2),从三个已从本地繁育计划中淘汰的雄性Swiss远交系小鼠中分离出股薄肌、胫骨前肌、趾长伸肌、腓肠肌、比目鱼肌、肱三头肌、咬肌和膈肌图2)。在组织解离和抗体染色后,通过FACS从各块肌肉中纯化MuSC和FAP图3)。初始设门使用未染色样本进行,以识别细胞并区分单细胞与双联体(图3A)。后续设门使用FMO对照以确定染色阈值(图3B). 对染色后的样本进行CD31/CD45-FITC和Sca1-PacBlue设门分析。SCA1+/CD31-/CD45- 群体(FAPs)被分选至一个独立的收集管中,而双阴性群体则被设门并用于VCAM1-PECy7与前向散射光(FSC)的图示分析。VCAM1+ 群体(MuSCs)被分选至单独的收集...
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要成功实施本方案并获得较高的细胞得率,有几个关键步骤需要注意。与批量分离方案中使用的肌肉量相比,单个肌肉的体积较小,这可能导致在解剖过程中肌肉暴露而干燥,从而降低得率。为防止这种情况,应在解剖后立即向肌肉中加入培养基。此外,如果解剖耗时较长,可逐侧肢进行皮肤剥离,以减少肌肉暴露于空气中的时间。较小的体积也增加了过度消化的风险。为此,本方法所需的胶原酶II用量较少,且消化时间较短,相较于批量肌肉分离方案有所优化9,16。酶消化的效果还取决于酶的纯度,纯度较低会负面影响细胞得率。此外,机械消化至关重要。若切割不足,表面积减小将阻碍酶的充分作用,导致干细胞得率降低;若切割过度,表面积增大则会引起过度消化,同样降低干细胞得率。振荡水浴可防止消化后肌肉组织沉淀,改善酶的分布,并有助于维持温度均匀,从而整体上缩短孵育时间。因此,本方法相较于其他方法可显著缩短孵育时间。
该方案依赖于细胞解离和纯化。这些操作模拟了组织损伤,从而激活干细胞。与此一致的是,最近的研究表明,肌肉干细胞(...
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作者没有竞争性经济利益,也不存在利益冲突。
细胞分选在丹麦奥胡斯大学FACS核心实验室完成。图片使用Biorender.com绘制。我们感谢J. Farup博士分享兔抗PDGFRa抗体。本研究得到奥胡斯大学研究基金(AUFF)启动资助以及启动计划资助的支持 诺和诺德基金会资助 E.P.(0071113)和 A.D.M.(0071116)。
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| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1.5 mL 管(PCR 性能测试,聚丙烯材质,30,000 xg,无 DNA/DNase-/RNase,低 DNA 结合,无菌) | Sarstedt AG & Co. KG, Hounisen Laboratorieudstyr A/S | 72.706.700 | 1.5 mL 管 |
| 15 mL 管(聚丙烯/高密度聚乙烯,20,000 xg,IVD/CE,IATA,无 DNA/DNase-/RNase,无细胞毒性,无热原,无菌) | Sarstedt AG & Co. KG, Hounisen Laboratorieudstyr A/S | 62.554.502 | 15 mL 管 |
| 5 mL 聚苯乙烯圆底管 | Falcon, Fisher Scientific | 352054 | 无滤网帽的 FACS 管 |
| 带细胞滤网帽的 5 mL 聚苯乙烯圆底管 | Falcon, Fisher Scientific | 352235 | 带滤网帽的 FACS 管 |
| 5 mL 管(聚丙烯材质,非无菌,可高压灭菌) | VWR collection | 525.0946 | 5 mL 管 |
| 50 mL 管(聚丙烯/高密度聚乙烯,20,000 xg,IVD/CE,ADR,无 DNA/DNase-/RNase,无细胞毒性,无热原,无菌) | Sarstedt AG & Co. KG, Hounisen Laboratorieudstyr A/S | 62.547.254 | 50 mL 管 |
| Alexa Fluor 555 驴抗兔 IgG (H+L) | Invitrogen, Thermo Fisher | 批号:2387458 (货号 # A31572) | |
| Alexa Fluor 647 驴抗小鼠 IgG (H+L) | Invitrogen, Thermo Fisher | 批号:2420713 (货号 #A31571) | |
| ARIA 3 | BD | FACS,奥胡斯大学核心设施 | |
| Centrifuge 5810 | Eppendorf | EP022628188 | 离心机 |
| Click-iT EdU 细胞增殖成像试剂盒,Alexa Fluor 488 染料 | Invitrogen, Thermo Fisher | 批号:2387287 (货号 # C10337) | 细胞增殖试剂盒 |
| 小牛皮胶原 | Bioreagent, Sigma Aldrich | 来源:SLCK6209 (货号 # C8919) | |
| II 型胶原酶 | Worthington, Fisher Scientific | 批号:40H20248 (货号 # L5004177 ) | 胶原酶 |
| Dispase | Gibco, Fisher Scientific | 批号:2309415 (货号 # 17105-041 ) | Dispase |
| 驴血清(非无菌) | Sigma Aldrich, Merck | 批号:2826455 (货号 # S30-100mL) | |
| Dumont 号 5,110 mm | Dumont, Hounisen Laboratorieudstyr A/S | 1606.327 | 尖端精细的直头镊子 |
| Dumont 号 7,115 mm | Dumont, Hounisen Laboratorieudstyr A/S | 1606.335 | 弯头镊子 |
| F-10 培养基(Ham 配方)(1x),含 L-谷氨酰胺 | Gibco, Fisher Scientific | 批号:2453614 (货号 # 31550-023) | |
| FITC 抗小鼠 CD31 | BioLegend, NordicBioSite | MEC13.3 (货号 # 102506) | |
| FITC 抗小鼠 CD45 | BioLegend, NordicBioSite | 30-F11 (货号 # 103108) | |
| 冰醋酸(100%) | EMSURE, Merck | K44104563 9(货号 # 1000631000) | |
| 微型管旋转混合器(头对头式) | Fisher Scientific | 15534080 (型号 # 88861052) | 微型管旋转混合器 |
| 马血清 | Gibco, Fisher Scientific | 批号:2482639 (货号 # 10368902 ) | |
| Isotemp SWB 15 | FisherBrand, Fisher Scientific | 15325887 | 摇动水浴箱 |
| MS2 微型振荡器 | IKA | 涡旋仪 | |
| 20 G 针头(0.9 mm x 25 mm) | BD microlance, Fisher Scientific | 304827 | 20G 针头 |
| 10% 中性福尔马林缓冲液 | CellPath, Hounisen Laboratorieudstyr A/S | 批号:03822014 (货号 # HOU/1000.1002) | |
| 无热原细胞滤网(40 µM) | Sarstedt AG & Co. KG, Hounisen Laboratorieudstyr A/S | 83.3945.040 | 细胞滤网 |
| Pacific Blue 抗小鼠 Ly-6A/E (Sca-1) | BioLegend, NordicBioSite | D7 (货号 # 108120) | |
| Pax7 一抗 | DSHB | 批号:2/3/22-282ug/mL (货号 # AB 528428) | |
| PBS 10x 粉末浓缩液 | Fisher BioReagents, Fisher Scientific | BP665-1 | |
| PE/Cy7 抗小鼠 CD106 (VCAM1) | BioLegend, NordicBioSite | 429 (MVCAM.A) (货号 # 105720) | |
| 青霉素/链霉素(Pen/strep) | Gibco, Fisher Scientific | 批号:163589 (货号 # 11548876 ) | |
| 10 µL 吸头 | Art tips, 自密封屏障, Thermo Scientific | 2140-05 | 低吸附,预灭菌,带滤芯吸头 |
| 1000 µL 吸头 | Art tips, 自密封屏障, Thermo Scientific | 2279-05 | 低吸附,预灭菌,带滤芯吸头 |
| 20 µL 吸头 | Art tips, 自密封屏障, Thermo Scientific | 2149P-05 | 低吸附,预灭菌,带滤芯吸头 |
| 200 µL 吸头 | Art tips, 自密封屏障, Thermo Scientific | 2069-05 | 低吸附,预灭菌,带滤芯吸头 |
| 防护垫 | Abena | ACTC-7712 | 60 x 40 cm,8 层 |
| Rainin, pipet-lite XLS | Mettler Toledo, Thermo Scientific | 2140-05, 2149P-05, 2279-05, 2069-05 | 移液器(P10, P20, P200, P1000) |
| 重组抗 PDGFR-alpha 抗体 | RabMAb, abcam | AB134123 | |
| 手术刀(刀柄编号 3) | Hounisen, Hounisen Laboratorieudstyr A/S | 1902.502 | 手术刀 |
| 11 号手术刀片 | Heinz Herenz, Hounisen Laboratorieudstyr A/S | 1902.0911 | 手术刀 |
| Scanlaf mars | Labogene | 2 级生物安全柜:Mars | 超净工作台 |
| ScanR | Olympus | 显微镜,奥胡斯大学核心设施 | |
| 剪刀 | FST | 14568-09 | |
| Series 8000 DH | Thermo Scientific | 3540-MAR | 培养箱 |
| 10 mL 血清移液管 | VWR | 612-3700 | 无菌,无热原 |
| 5 mL 血清移液管 | VWR, Avantor 由 VWR 供应 | 612-3702 | 无菌,无热原 |
| 5 mL 注射器,鲁尔接头(6%),无菌 | BD Emerald, Fisher Scientific | 307731 | 注射器 |
| TC 培养皿 100,标准型 | Sarstedt AG & Co. KG, Hounisen Laboratorieudstyr A/S | 83.3902 | 培养皿 |
| 组织培养(TC)处理表面,黑色聚苯乙烯,平底,无菌,带盖,20 个/包 | Corning, Sigma Aldrich | 3764 | 96 孔半底板 |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich, Merck | 来源:SLCJ6163 (货号 # T8787) |
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