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方法文章

从单个骨骼肌中分离静息态干细胞群体

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⸱

DOI：

10.3791/64557

⸱

2022年12月9日

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedicine, Aarhus University

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本方案描述了从小鼠单个骨骼肌中分离肌肉干细胞和纤维脂肪形成祖细胞的方法。该方案包括单块肌肉解剖、通过荧光激活细胞分选法分离干细胞、免疫荧光染色评估纯度，以及通过5-乙炔基-2′-脱氧尿苷掺入实验定量检测S期进入情况。

摘要

骨骼肌中含有不同类型的成体干细胞群体，这些细胞参与组织的稳态维持与损伤修复。骨骼肌干细胞（MuSCs）能够生成新的肌肉组织，而纤维-脂肪生成祖细胞（FAPs）则参与间质支持性组织的形成，并具有分化为成纤维细胞和脂肪细胞的能力。MuSCs和FAPs均处于一种长期可逆的细胞周期退出状态，称为静息状态。这种静息状态对其功能至关重要。通常，静息态干细胞是从多个肌肉组织混合后的样本中进行纯化分离的。然而，近期研究表明，来源于不同肌肉的MuSCs在分子表达谱和静息深度上存在显著差异。本实验方案详细描述了从单个骨骼肌中分离和研究MuSCs与FAPs的方法，并提供了对干细胞活化过程进行分子分析的策略。方案中具体说明了如何分离并消化具有不同发育来源、厚度和功能的肌肉组织，例如膈肌、肱三头肌、股薄肌、胫骨前肌（TA）、腓肠肌（GA）、比目鱼肌、趾长伸肌（EDL）以及咬肌。MuSCs和FAPs通过荧光激活细胞分选技术（FACS）进行纯化，并通过免疫荧光染色和5-乙炔基-2'-脱氧尿苷（EdU）掺入实验进行分析。

引言

由于存在肌肉干细胞（MuSCs），骨骼肌具有很强的再生能力。MuSCs 位于肌纤维上，基底膜下方，处于一种长期可逆性退出细胞周期的静息状态1,2,3,4。在肌肉损伤后，MuSCs 被激活并进入细胞周期，产生扩增的前体细胞，这些前体细胞可进一步分化并融合形成新的肌纤维2,5。先前的研究表明，MuSCs 对肌肉再生至关重要6,7,8。此外，单个 MuSC 能够植入并生成新的干细胞以及新的肌纤维9。骨骼肌中还存在一类间充质基质细胞，称为成纤维-脂肪生成前体细胞（FAPs），在肌肉再生过程中对支持 MuSC 功能发挥关键作用6,10,11,12。

由于肌肉干细胞（MuSCs）和纤维脂肪生成祖细胞（FAPs）在调控肌肉再生方面具有潜在作用，人们对其功能机制产生了极大研究兴趣。静息状态的MuSCs特征性表达转录因子Pax7和Sprouty1，以及细胞表面蛋白降钙素受体；而静息状态的FAPs则特征性表达细胞表面蛋白血小板源性生长因子受体α（PDGFRa）10,12,13,14,15。既往研究表明，可通过细胞表面标志物结合荧光激活细胞分选技术（FACS）从骨骼肌中纯化MuSCs和FAPs9,15,16,17,18,19,20,21。尽管这些方案显著提升了研究MuSCs和FAPs的能力，但其局限性在于大多数方法需要从多种肌肉组织混合样本中分离MuSCs。我们团队及他人的近期研究发现，从不同组织来源分离的MuSCs在细胞表型和基因表达水平上存在差异22,23。来自膈肌、肱三头肌和股薄肌的MuSCs比后肢远端肌肉的MuSCs激活速度更快22，而眼外肌来源的MuSCs则比膈肌和后肢远端肌肉来源的MuSCs分化速度更快23。

本方案描述了从单个骨骼肌中分离肌肉干细胞（MuSCs）和纤维-脂肪生成祖细胞（FAPs）的方法（图1）。包括膈肌、肱三头肌、股薄肌、胫骨前肌（TA）、比目鱼肌、趾长伸肌（EDL）、腓肠肌（GA）以及咬肌的解剖分离。解剖获得的肌肉组织随后通过胶原酶II（一种特异性靶向胶原蛋白中Pro-X-Gly-Pro氨基酸序列的蛋白酶，可降解结缔组织并实现组织解离24）和分散酶（dispase，一种可切割纤连蛋白和IV型胶原的蛋白酶，有助于进一步细胞解离25）进行酶消化解离。MuSCs和FAPs通过流式细胞荧光分选（FACS）从单细胞悬液中分离获得。作为下游细胞分析示例，通过检测5-乙炔基-2'-脱氧尿苷（EdU）掺入情况评估干细胞的活化状态，而细胞纯度则通过针对细胞类型特异性标志物Pax7和PDGFRa的免疫荧光染色进行鉴定。

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方案

本方案的实施遵循奥胡斯大学的动物护理准则及当地伦理法规。

注意：务必遵守当地动物实验伦理委员会关于动物实验及啮齿类动物尸体样本处理的相关规定。小鼠可能是过敏原的潜在来源；如有条件，应开启排风装置，并将其置于工作区上方，以避免过度接触过敏原。或者，若需经常进行此类实验，应佩戴面部口罩。本方案涉及锐器操作，建议研究人员熟悉发生割伤时的急救措施及处理流程。

1. 准备（1-2 小时；解剖前一天）

注意：除非另有说明，所有溶液、培养皿和培养基均需在无菌条件下配制，并在使用前经0.45 µm滤膜过滤。配制分散酶（11 U/mL，溶于PBS）和胶原酶II（1.000 U/mL，溶于PBS）的储存液，并于-20 °C保存（表1）。在步骤4.2.6中，将储存液解冻后用于二次消化。

  1. 96孔半面积板的胶原蛋白包被
    1. 制备酸性水。在2 L烧杯中，将5.15 mL冰醋酸加入895 mL经高压灭菌的水中。
    2. 使用0.45 µm、500 mL滤器对溶液进行过滤。将800 mL过滤后的酸性水转移至1 L瓶中。
    3. 向瓶中加入40 mL无菌胶原蛋白储备液。轻轻旋转混匀，置于4 °C避光保存，直至使用。
    4. 使用胶原蛋白对一个或多个96孔半面积板进行包被。每孔加入50 µL胶原蛋白包被液，于4 °C过夜（ON）孵育。
    5. 次日使用真空吸液器吸除胶原蛋白溶液，并用100 µL高压灭菌水洗涤2次，每次均吸除液体。
    6. 将板盖倾斜，于生物安全柜中干燥20–30分钟。
    7. 当板完全干燥后，用铝箔包裹，于4 °C保存直至使用。包被后的板可保存长达4周。
      ​注意：胶原蛋白包被可促进细胞黏附。必须洗去游离的胶原蛋白，因其可能干扰细胞功能和信号传导（例如，V型胶原与肌肉干细胞上的降钙素受体结合）26。

2. 准备（0.5 小时；解剖当天）：

  1. 额外溶液和工作区域的准备
    1. 通过向445 mL HAM's F10培养基中加入50 mL 马血清和5 mL 青霉素-链霉素溶液，配制无菌洗涤液。操作应在超净工作台内进行，以防止污染。
    2. 计算并称取配制消化缓冲液所需的胶原酶II适量。（每只小鼠使用26,000单位胶原酶II，配制成40 mL、浓度为650 U/mL的消化缓冲液）。将称好的粉末加入50 mL锥形管中，并置于冰上保存。
    3. 准备两个10 cm培养皿用于肌肉组织分离。每个培养皿中加入3 mL洗涤液（表1），随后将10 cm培养皿移出超净工作台备用。
    4. 准备肌肉组织消化所需材料。根据样本数量，标记相应数量的50 mL锥形管（每只小鼠8个，每个肌肉组织1个），并放置于实验台上。用70%乙醇喷洒针头、10 mL注射器和40 µm细胞筛网（每只小鼠各8个，每个肌肉组织1套），然后移入超净工作台内。将针头安装至注射器上。
    5. 准备分选所需材料。根据样本数量，用带细胞筛网帽的5 mL圆底管进行标记，并用铝箔覆盖后置于超净工作台内。
    6. 根据待分选的样本数量和细胞群数量，准备相应数量的1.5 mL微量离心管，每管加入500 µL洗涤液用于收集细胞（每只小鼠16管，每块肌肉组织的每个细胞群各1管）。将这些离心管置于冰上保存。

3. 肌肉解剖（20–30 分钟）

注意：本实验步骤在非无菌环境中进行。可使用一只或多只小鼠进行实验，但一只小鼠已足以制备用于分选的样品以及用于设定补偿和FACS门控的对照样本。

  1. 开始肌肉分离
    1. 准备非无菌解剖与肌肉分离工作区。使用70%乙醇对工作台进行消毒，并在工作台上放置无菌一次性防护垫。
    2. 使用永久性记号笔在培养皿盖顶部为每块肌肉画出方框，用于放置后续分离出的肌肉。
    3. 用70%乙醇喷洒手术器械。
    4. 通过吸入CO2和/或颈椎脱位法处死小鼠。
    5. 逐个分离各块肌肉（若使用多只小鼠，则每次处理一只）。用70%乙醇喷洒小鼠体表，润湿毛发并消毒皮肤。将小鼠仰卧置于防护垫上。所有八块肌肉及其相应的解剖位置概览见图2A。
  2. 分离缝匠肌
    1. 使用剪刀在腹部皮肤上做一个0.5 cm的横向切口。
    2. 去除皮肤：双手分别用拇指和食指捏住切口上下两端，向两侧拉扯，撕开躯干和下肢的皮肤。向下拉扯下肢皮肤以暴露双侧后肢（从髋部至脚趾），同样向上拉扯以暴露躯干。
    3. 定位缝匠肌（大腿内侧）。使用弯头镊子夹住缝匠肌并轻轻提起肌肉（图2B）。用剪刀从该处做0.5 cm切口（图2C），将缝匠肌完整剪下并完全分离（图2D）。对另一条腿重复此操作，以分离第二块缝匠肌。
  3. 分离胫前肌（TA）和趾长伸肌（EDL）（后肢下部，腹侧）
    1. 使用解剖刀沿胫骨外侧（后肢最粗的骨骼）做0.5 cm切口以切开筋膜。用弯头镊子夹住筋膜并将其撕除。
      注：当筋膜完全去除后，可在后肢远端观察到肌腱，并可将其分离。
    2. 使用尖端极细的直头镊子插入TA远端肌腱（位于胫骨外侧）与EDL（位于TA下方）之间（图2E-G）。
      注：熟练后可用解剖刀钝端代替直头镊子。
    3. 将镊子向肌肉近端滑动，以分离两块肌肉。
    4. 将直头镊子移回远端。切断远端肌腱。
    5. 用弯头镊子轻轻夹住肌肉远端肌腱，将肌肉提起并越过其近端附着点，尽可能靠近附着点小心切断近端肌腱。切断另一端后，将TA转移至培养皿中。
    6. 使用尖端极细的直头镊子插入EDL远端肌腱下方。
    7. 将镊子向肌肉近端滑动，以分离肌肉。
    8. 将直头镊子移回远端，在不损伤肌肉的前提下切断远端肌腱。
    9. 用弯头镊子轻轻夹住EDL远端肌腱，将肌肉提起并越过其近端附着点，尽可能靠近附着点小心切断近端肌腱。切断另一端后，将EDL转移至培养皿中。对另一侧后肢重复该操作，以分离第二块TA和EDL肌肉。
  4. 分离腓肠肌（GA）和比目鱼肌（soleus）（后肢下部，背侧）
    1. 使用尖端极细的直头镊子插入跟腱与后肢下部骨骼之间。
    2. 将镊子向肌肉近端滑动，以分离肌肉。
    3. 将直头镊子移回远端。切断远端肌腱。
      注：为避免损伤位于GA下方的比目鱼肌，应尽可能靠近其远端跟腱附着点进行切割，使一部分肌腱保留在GA上（图2H）。
    4. 向上并越过腓骨（后肢两骨中最细的一根）提起GA，以暴露并分离比目鱼肌。
      注：比目鱼肌的颜色较深，呈特征性的暗红色，可据此与GA区分（图2I）。
    5. 定位比目鱼肌近端肌腱。使用直头镊子插入比目鱼肌与GA之间。
    6. 将镊子向肌肉远端移动，以分离比目鱼肌与GA。
    7. 先分离比目鱼肌。切断其近端肌腱，用弯头镊子夹住肌腱，小心提起比目鱼肌以暴露其远端肌腱。切断远端肌腱，使比目鱼肌与GA完全分离。将比目鱼肌放入含洗涤液的培养皿中（图2J）。
    8. 切断GA并将其放入培养皿中。对另一条腿重复该操作，以分离第二块比目鱼肌和GA肌肉。
  5. 分离肱三头肌（前肢上部，背侧）
    1. 使用尖端极细的直头镊子插入肱三头肌与肱骨（前肢上部主要骨骼）之间（图2K-M）。
    2. 将镊子向肌肉近端滑动以分离肌肉。切断肌肉近端。
    3. 用弯头镊子夹住肱三头肌近端，将其提起并越过肘部以暴露远端肌腱。切断肱三头肌远端肌腱，将肌肉转移至培养皿中，并对另一侧前肢重复该操作。
  6. 分离咬肌
    1. 去除下颌部的毛发和皮肤。用剪刀做0.5 cm横向切口。双手分别用拇指和食指捏住切口两侧，向上和向下拉扯以去除皮肤。
    2. 定位咬肌的主要肌腱（位于眼后下方）。将平头解剖刀片插入骨与肌肉之间（图2N），切断肌腱。
    3. 用弯头镊子夹住主要咬肌肌腱，用解剖刀片或剪刀沿头侧方向切割，使咬肌与下颌骨分离（图2O，P）。将分离出的咬肌放入培养皿中。对第二块咬肌重复该操作。
  7. 分离膈肌
    注：在分离膈肌时，务必小心切割，避免切到内脏和肠道，以防污染。
    1. 使用剪刀在胸骨中部（位于胸部中央的一块长而扁平的骨骼，连接肋骨）进行胸廓切开术（在肋骨之间做切口），并剪开胸骨（图2Q）。
    2. 环绕肋骨做360°切割，以暴露膈肌。
    3. 将上半身与下半身/腹部分离。使用剪刀切断气管、食管、下腔静脉和腹主动脉。
    4. 将膈肌与下半身分离。在胸骨下方1 cm处使用剪刀进行腹腔切开术（外科手术切口进入腹腔），并做360°环形切割（图2R）。
    5. 将闭合的剪刀置于肋骨与腹腔器官之间并向下按压，轻轻牵拉肋骨以将其与腹腔器官分离（图2S）。
    6. 将膈肌与肋骨分离。用两指轻轻夹住膈肌，用剪刀沿肋骨做360°环形切割，尽可能贴近肋骨切断膈肌。将分离出的膈肌放入培养皿中。
      ​注：在颈椎脱位过程中，膈肌可能破裂并塌陷贴附于肋骨，导致难以定位。此时仍可进行分离。识别塌陷的肌肉，用两指夹住，沿肋骨轮廓做360°环形切割即可。

4. 肌肉组织消化制备单细胞悬液（约1小时35分钟）

注意：以下步骤包括非无菌操作环境（步骤 4.1-4.2）和无菌操作环境（步骤 4.3）。

  1. 机械消化
    1. 将分离的肌肉组织置于一个10 cm培养皿的皿盖中。
    2. 使用弯头镊子逐个夹取分离的肌肉组织。对于比目鱼肌和腓肠肌，去除残余的跟腱部分。
    3. 使用剪刀将分离的肌肉组织逐个剪碎，切成约1 mm3大小的组织块。
  2. 酶消化
    1. 通过将40 mL冷洗涤液加入称量好的II型胶原酶粉末中，配制肌肉解离缓冲液（II型胶原酶：在洗涤液中浓度为650 U/mL）。
      注意：请使用新鲜配制的肌肉解离缓冲液，以确保最佳的酶活性。
    2. 将剪碎的肌肉组织转移至含有5 mL解离缓冲液的15 mL锥形管中。
    3. 将锥形管置于37 °C、60 rpm振荡水浴中孵育35分钟。
    4. 孵育结束后，加入洗涤液至总体积为15 mL。在4 °C条件下，以1,600 × g离心5分钟。
    5. 使用真空抽吸装置将上清液吸除至剩余4 mL体积。为避免扰动沉淀，应从上层缓慢抽吸，并去除任何漂浮的脂肪组织。
    6. 解冻备用的分散酶（dispase）和II型胶原酶分装液。向剩余的4 mL样品中加入500 µL II型胶原酶溶液（储存浓度1,000 U/mL，-20 °C保存）。随后，加入500 µL分散酶溶液（储存浓度11 U/mL，-20 °C保存）。
      注意：分散酶可能产生沉淀。若出现此情况，使用前需将分散酶原液在10,000 × g离心1分钟，然后将澄清的上清液转移至细胞悬液中，注意不要扰动沉淀。
    7. 短暂涡旋振荡样品，使沉淀充分溶解。
    8. 将样品在37 °C、60 rpm振荡水浴中孵育20分钟。
      注意：消化大量肌肉样品耗时较长。对于步骤4.3.1–4.3.6，预计每个样品需耗时2–5分钟。若由两名或更多研究人员并行操作，可显著提高效率。
  3. 样品均质化
    1. 对细胞悬液进行均质化处理。将悬液从15 mL管转移至50 mL管中。使用带有20G针头的10 mL注射器，通过反复抽吸5次使样品充分重悬。
      注意：若未完全消化的肌肉组织堵塞针头，可用纸巾擦拭去除堵塞物。
    2. 将一个40 µm细胞筛网置于一个新的50 mL锥形管上。
    3. 用注射器吸取全部细胞悬液，通过置于新50 mL锥形管上的细胞筛网进行过滤。将全部体积直接排至滤膜上完成过滤。
    4. 为回收所有单核细胞，向空的锥形管中加入20 mL洗涤液，并将其倒入细胞筛网，流入含有滤过样品的50 mL锥形管中。使用P1000移液器回收筛网下方残留的液体体积。
    5. 弃去细胞筛网，将样品在4 °C条件下以1,600 × g离心5分钟。
    6. 使用P1000移液器小心吸除上清液，避免扰动沉淀。
    7. 使用P1000移液器将膈肌沉淀重悬于500 µL洗涤液中，其余肌肉样品则分别重悬于300 µL洗涤液中。
      ​注意：膈肌是所取肌肉中体积最大且干细胞含量最高的组织，因此可用于对照染色实验。

5. 染色与分选（约40分钟 + 每样本30分钟分选时间）

注意：以下步骤需在无菌环境中并在冰上操作。

  1. 取50 μL膈肌细胞悬液，分别加入四个新的2 mL微量离心管中，用于对照染色（每管50 µL）。每管对照管中加入250 µL洗涤液，使终体积达到300 µL。
  2. 向三个对照染色管中各加入3 µL（1:100）荧光减一抗体（FMO对照），留一个管不加抗体（未染色对照）（见表2）。
  3. 向剩余的肌肉单细胞悬液（包括剩余的膈肌样本）中加入3 µL（1:100）抗体（VCAM1-PECy7、CD45-FITC、CD31-FITC和SCA1-PacificBlue）。
  4. 将细胞悬液在4 °C下于翻转振荡器中孵育15分钟。
    注意：对照染色用于确定背景荧光水平并设定流式细胞术的门控参数。可使用不同的抗体，但每种抗体均有特定的工作浓度和孵育时间，需预先测试。若使用不同供应商的抗体，其浓度及稀释比例可能不同。可在染色混合物中加入细胞活力染料，以便在分选过程中排除死细胞或濒死细胞。
  5. 在4 °C下以1,600 × g离心5分钟。用移液器小心吸弃上清液，避免扰动沉淀。
  6. 使用P1000移液器，将每份样本重悬于800 µL洗涤液中。
  7. 使用带细胞筛网帽（40 µm）的FACS管过滤样本，以去除残留的细胞团块（或聚集体）。
  8. 通过再加入800 µL洗涤液冲洗细胞筛网。
  9. 将样本用铝箔覆盖后置于冰上，直至分析。
    注意：若此时细胞悬液因细胞浓度过高而显得浑浊或浓稠，可额外加入800 µL洗涤液以降低细胞密度。
  10. 使用70 µm喷嘴启动FACS仪器。
  11. 利用未染色和FMO对照设定门控策略：MuSCs对CD45-FITC、CD31-FITC和SCA1-PacBlue呈阴性，对VCAM1-PECy7呈阳性；FAPs对CD45-FITC、CD31-FITC、VCAM1-PECy7呈阴性，对SCA1-PacBlue呈阳性。
  12. 使用双路分选模式对染色后的单细胞悬液进行分选，并将MuSCs和FAPs分别收集至含有500 µL洗涤液的收集管中。
    注意：使用配备四个激光器的FACS（配置：70 µm喷嘴，405 nm、488 nm、561 nm、633 nm），所选荧光染料组合无需进行荧光信号补偿。然而，若使用其他流式细胞仪或不同的荧光染料组合，建议额外设置单染对照样本用于补偿。从小块肌肉（EDL、比目鱼肌、TA）中预期可获得约3,000个MuSCs和5,000个FAPs；对于其他较大的肌肉，预期可获得约20,000个MuSCs和FAPs。FACS软件记录的事件数可能与收集管中实际的活细胞数量存在偏差。可通过血细胞计数板进行细胞计数以确认细胞数量。
  13. 在4 °C下以1,600 × g离心已分选的细胞5分钟。通过移液操作小心吸弃上清液，避免扰动细胞沉淀。
  14. 向每份样本中加入100 µL洗涤液，轻柔重悬细胞，避免产生气泡。将100 µL重悬后的细胞悬液转移至胶原包被的半面积96孔板中，每孔接种1,000–3,000个细胞。
    注意：若细胞未充分重悬，可能聚集形成团块，影响后续显微镜分析。
  15. 在显微镜下观察细胞，记录其分布、形态和大小。
  16. 将培养板置于37 °C、5% CO2条件下孵育。细胞将在2小时内贴壁。
    ​注意：建议通过流式细胞术分析（将部分分选后的样本重新上机，记录少量事件）或对贴壁细胞进行抗体染色后显微观察（Pax7是小鼠MuSCs的标志性分子，PDGFRa是小鼠FAPs的标志性分子），以确认所收集细胞群体的纯度。下方第7节起提供了针对Pax7和PDGFRa蛋白水平的细胞染色方案。

6. EdU 掺入实验

注意：在后续步骤中，需在无菌条件下操作，并在处理多聚甲醛（PFA）时使用化学通风橱。EdU 是一种核苷酸类似物，可在细胞通过细胞周期 S 期时掺入 DNA 中。高浓度下具有致突变性。操作 EdU 时务必佩戴手套。请查阅当地关于 EdU 废物处理的相关规定。

  1. EdU 脉冲标记（第1天）
    1. 在新鲜的洗涤培养基中配制2倍浓度的EdU工作液。
    2. 从培养箱中取出含有细胞的96孔板，在显微镜下观察细胞汇合度，并转移至超净工作台中。
    3. 用移液器吸除每孔50 µL培养基，加入50 µL 2倍浓度的EdU工作液，使每孔终体积为100 µL。
    4. 将细胞在37 °C、5% CO2条件下培养预定时间。
      注：EdU脉冲标记的时间和持续时长可根据实验设计调整。通常情况下，静息态MuSCs需要约2天时间才能完全激活并完成首次细胞分裂19。EdU可在细胞分选后接种时立即加入。
  2. 固定（第2天）
    注：PFA 为致癌物，操作时务必小心。请熟悉当地关于PFA操作及废液处理的相关规定。
    1. 从培养箱中取出含有细胞的96孔板，在显微镜下观察细胞状态，并将板转移至通风橱中。
    2. 用移液器吸除培养基，向每孔加入50 µL 4% PFA进行固定。在室温（RT）下于化学通风橱中孵育10分钟。
    3. 用移液器吸除PFA溶液，并将其弃入适当的废液容器中。
    4. 向所有孔中加入100 µL PBS洗涤细胞，用移液器吸除PBS后重复洗涤一次。最后每孔保留100 µL PBS。
      ​注：为避免细胞被冲走，应缓慢地将PBS沿孔壁加入。
  3. EdU标记
    1. 在进行EdU检测前，先去除PBS，每孔加入100 µL含0.5% Triton X-100的PBS溶液以通透细胞。在4 °C下孵育5分钟。
      注：Triton X-100为表面活性剂，可能引起皮肤刺激，操作时需小心并始终佩戴手套。
    2. 5分钟后，吸除Triton X-100溶液，每孔加入100 µL PBS。
    3. 根据制造商说明书配制EdU点击化学反应混合液。
    4. 吸除PBS，每孔加入33 µL EdU点击化学反应混合液，在室温（RT）下避光孵育30分钟。
    5. 吸除EdU点击化学反应混合液，用100 µL PBS洗涤细胞一次。
    6. 吸除PBS，每孔加入含Hoechst（1:2,000）的PBS 100 µL，在室温下避光孵育10分钟。
    7. 吸除Hoechst溶液，加入100 µL PBS洗涤两次。将细胞置于100 µL PBS中，于4 °C避光保存。
    8. 在倒置显微镜下观察细胞。只要孔内液体不干燥，细胞可在避光条件下保存数月。
      ​注：可对细胞进行抗体共染色。此时，应先进行封闭步骤，随后加入一抗孵育。选择带有荧光标记的二抗时，其发射光谱不得与用于检测EdU的荧光染料重叠。同时确保所用二抗的荧光染料不与Hoechst的光谱范围重叠。

7. 免疫荧光染色

注意：本步骤可独立于第6部分进行。若跳过第6部分，请在继续执行下文的步骤7.2之前，先完成步骤6.3.1和6.3.2，以实现细胞通透化。

  1. 取出含有 EdU 标记细胞的培养板。
  2. 向 18 mL PBS 中加入 2 mL 驴血清，配制 20 mL 封闭缓冲液。
  3. 为防止非特异性抗体结合，用 p200 移液器从每个孔中移除 100 µL PBS，并加入 50 µL 封闭缓冲液。将培养板在室温下孵育 30 分钟，避光并用铝箔包裹，以防止荧光标记的 EdU 发生光漂白。
    注意：细胞已固定在孔底，但在移液时若施加过大的力可能导致细胞脱落。
  4. 在封闭样本的同时，配制一抗混合液。将 8.0 µL（1:100 稀释）小鼠抗 Pax7 抗体和兔抗 PDGFRa 抗体加入 800 µL 封闭缓冲液中，用于染色 16 个孔（八份组织，两种细胞类型）。
  5. 封闭结束后，移除驴血清，向每个孔中加入 50 µL 一抗混合液。将培养板在 4 °C 下避光孵育过夜，并用铝箔包裹。
  6. 孵育结束后，移除一抗，向每个孔中加入 50 µL Triton（0.5% 溶于 PBS）。在室温下避光孵育 5 分钟，以洗去未结合的抗体。重复洗涤三次。
  7. 在微量离心管中加入 1,000 µL 封闭缓冲液，再加入 1.0 µL（1:1,000 稀释）驴抗小鼠 Alexa647 和驴抗兔 Alexa555，配制二抗母液。
  8. 向每个孔中加入 33 µL 二抗母液。将培养板在室温下避光孵育 60 分钟。
  9. 用移液器移除多余的二抗，向每个孔中加入 50 µL Triton（0.1% 溶于 PBS），在室温下避光孵育 5 分钟。重复洗涤三次。
  10. 最后，向每个孔中加入 100 µL PBS。根据需要决定是否立即使用配备冷却 CCD 相机的倒置荧光显微镜进行成像，或用封口膜密封培养板边缘后，再用铝箔包裹，于 4 °C 保存以待后续分析。

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结果

遵循单个骨骼肌分离的实验方案（图2)，从三个已从本地繁育计划中淘汰的雄性Swiss远交系小鼠中分离出股薄肌、胫骨前肌、趾长伸肌、腓肠肌、比目鱼肌、肱三头肌、咬肌和膈肌图2）。在组织解离和抗体染色后，通过FACS从各块肌肉中纯化MuSC和FAP图3）。初始设门使用未染色样本进行，以识别细胞并区分单细胞与双联体（图3A）。后续设门使用FMO对照以确定染色阈值（图3B). 对染色后的样本进行CD31/CD45-FITC和Sca1-PacBlue设门分析。SCA1+/CD31-/CD45- 群体（FAPs）被分选至一个独立的收集管中，而双阴性群体则被设门并用于VCAM1-PECy7与前向散射光（FSC）的图示分析。VCAM1+ 群体（MuSCs）被分选至单独的收集...

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讨论

要成功实施本方案并获得较高的细胞得率，有几个关键步骤需要注意。与批量分离方案中使用的肌肉量相比，单个肌肉的体积较小，这可能导致在解剖过程中肌肉暴露而干燥，从而降低得率。为防止这种情况，应在解剖后立即向肌肉中加入培养基。此外，如果解剖耗时较长，可逐侧肢进行皮肤剥离，以减少肌肉暴露于空气中的时间。较小的体积也增加了过度消化的风险。为此，本方法所需的胶原酶II用量较少，且消化时间较短，相较于批量肌肉分离方案有所优化9,16。酶消化的效果还取决于酶的纯度，纯度较低会负面影响细胞得率。此外，机械消化至关重要。若切割不足，表面积减小将阻碍酶的充分作用，导致干细胞得率降低；若切割过度，表面积增大则会引起过度消化，同样降低干细胞得率。振荡水浴可防止消化后肌肉组织沉淀，改善酶的分布，并有助于维持温度均匀，从而整体上缩短孵育时间。因此，本方法相较于其他方法可显著缩短孵育时间。

该方案依赖于细胞解离和纯化。这些操作模拟了组织损伤，从而激活干细胞。与此一致的是，最近的研究表明，肌肉干细胞（...

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披露

作者没有竞争性经济利益，也不存在利益冲突。

致谢

细胞分选在丹麦奥胡斯大学FACS核心实验室完成。图片使用Biorender.com绘制。我们感谢J. Farup博士分享兔抗PDGFRa抗体。本研究得到奥胡斯大学研究基金（AUFF）启动资助以及启动计划资助的支持 诺和诺德基金会资助 E.P.（0071113）和 A.D.M.（0071116）。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1.5 mL 管（PCR 性能测试，聚丙烯材质，30,000 xg，无 DNA/DNase-/RNase，低 DNA 结合，无菌）Sarstedt AG & Co. KG, Hounisen Laboratorieudstyr A/S72.706.7001.5 mL 管
15 mL 管（聚丙烯/高密度聚乙烯，20,000 xg，IVD/CE，IATA，无 DNA/DNase-/RNase，无细胞毒性，无热原，无菌）Sarstedt AG & Co. KG, Hounisen Laboratorieudstyr A/S62.554.50215 mL 管
5 mL 聚苯乙烯圆底管Falcon, Fisher Scientific 352054无滤网帽的 FACS 管
带细胞滤网帽的 5 mL 聚苯乙烯圆底管Falcon, Fisher Scientific  352235带滤网帽的 FACS 管
5 mL 管（聚丙烯材质，非无菌，可高压灭菌）VWR collection525.09465 mL 管
50 mL 管（聚丙烯/高密度聚乙烯，20,000 xg，IVD/CE，ADR，无 DNA/DNase-/RNase，无细胞毒性，无热原，无菌）Sarstedt AG & Co. KG, Hounisen Laboratorieudstyr A/S62.547.25450 mL 管
Alexa Fluor 555 驴抗兔 IgG (H+L)Invitrogen, Thermo Fisher批号：2387458 (货号 # A31572)
Alexa Fluor 647 驴抗小鼠 IgG (H+L)Invitrogen, Thermo Fisher批号：2420713 (货号 #A31571)
ARIA 3BDFACS，奥胡斯大学核心设施
Centrifuge 5810EppendorfEP022628188离心机
Click-iT EdU 细胞增殖成像试剂盒，Alexa Fluor 488 染料Invitrogen, Thermo Fisher批号：2387287 (货号 # C10337)细胞增殖试剂盒
小牛皮胶原 Bioreagent, Sigma Aldrich 来源：SLCK6209 (货号 # C8919)
II 型胶原酶Worthington, Fisher Scientific 批号：40H20248 (货号 # L5004177 )胶原酶
DispaseGibco, Fisher Scientific 批号：2309415 (货号 # 17105-041 )Dispase
驴血清（非无菌）Sigma Aldrich, Merck批号：2826455 (货号 # S30-100mL)
Dumont 号 5，110 mmDumont, Hounisen Laboratorieudstyr A/S1606.327尖端精细的直头镊子
Dumont 号 7，115 mmDumont, Hounisen Laboratorieudstyr A/S1606.335弯头镊子
F-10 培养基（Ham 配方）(1x)，含 L-谷氨酰胺Gibco, Fisher Scientific 批号：2453614 (货号 # 31550-023)
FITC 抗小鼠 CD31BioLegend, NordicBioSiteMEC13.3 (货号 # 102506)
FITC 抗小鼠 CD45BioLegend, NordicBioSite30-F11 (货号 # 103108)
冰醋酸（100%）EMSURE, Merck  K44104563 9(货号 # 1000631000)
微型管旋转混合器（头对头式） Fisher Scientific 15534080 (型号 # 88861052)微型管旋转混合器
马血清Gibco, Fisher Scientific 批号：2482639 (货号 # 10368902 )
Isotemp SWB 15FisherBrand, Fisher Scientific15325887摇动水浴箱
MS2 微型振荡器 IKA 涡旋仪
20 G 针头（0.9 mm x 25 mm）BD microlance, Fisher Scientific 30482720G 针头 
10% 中性福尔马林缓冲液CellPath, Hounisen Laboratorieudstyr A/S批号：03822014 (货号 # HOU/1000.1002)
无热原细胞滤网（40 µM）Sarstedt AG & Co. KG, Hounisen Laboratorieudstyr A/S83.3945.040细胞滤网 
Pacific Blue 抗小鼠 Ly-6A/E (Sca-1)BioLegend, NordicBioSiteD7 (货号 # 108120)
Pax7 一抗DSHB批号：2/3/22-282ug/mL (货号 # AB 528428)
PBS 10x 粉末浓缩液Fisher BioReagents, Fisher ScientificBP665-1
PE/Cy7 抗小鼠 CD106 (VCAM1)BioLegend, NordicBioSite429 (MVCAM.A) (货号 # 105720)
青霉素/链霉素（Pen/strep）Gibco, Fisher Scientific 批号：163589 (货号 # 11548876 )
10 µL 吸头Art tips, 自密封屏障, Thermo Scientific2140-05低吸附，预灭菌，带滤芯吸头
1000 µL 吸头Art tips, 自密封屏障, Thermo Scientific2279-05低吸附，预灭菌，带滤芯吸头
20 µL 吸头Art tips, 自密封屏障, Thermo Scientific2149P-05低吸附，预灭菌，带滤芯吸头
200 µL 吸头Art tips, 自密封屏障, Thermo Scientific2069-05低吸附，预灭菌，带滤芯吸头
防护垫Abena ACTC-7712 60 x 40 cm，8 层
Rainin, pipet-lite XLSMettler Toledo, Thermo Scientific 2140-05, 2149P-05, 2279-05, 2069-05移液器（P10, P20, P200, P1000）
重组抗 PDGFR-alpha 抗体RabMAb, abcamAB134123
手术刀（刀柄编号 3）Hounisen, Hounisen Laboratorieudstyr A/S1902.502手术刀
11 号手术刀片Heinz Herenz, Hounisen Laboratorieudstyr A/S1902.0911手术刀
Scanlaf marsLabogene2 级生物安全柜：Mars超净工作台
ScanROlympus显微镜，奥胡斯大学核心设施
剪刀FST14568-09
Series 8000 DHThermo Scientific3540-MAR培养箱
10 mL 血清移液管VWR612-3700无菌，无热原
5 mL 血清移液管VWR, Avantor 由 VWR 供应612-3702无菌，无热原
5 mL 注射器，鲁尔接头（6%），无菌 BD Emerald, Fisher Scientific307731注射器
TC 培养皿 100，标准型Sarstedt AG & Co. KG, Hounisen Laboratorieudstyr A/S83.3902培养皿 
组织培养（TC）处理表面，黑色聚苯乙烯，平底，无菌，带盖，20 个/包Corning, Sigma Aldrich376496 孔半底板
Triton X-100Sigma Aldrich, Merck来源：SLCJ6163 (货号 # T8787)

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