本方案描述了从小鼠单个骨骼肌中分离肌肉干细胞和纤维脂肪形成祖细胞的方法。该方案包括单块肌肉解剖、通过荧光激活细胞分选法分离干细胞、免疫荧光染色评估纯度，以及通过5-乙炔基-2′-脱氧尿苷掺入实验定量检测S期进入情况。
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摘要
摘要
骨骼肌中含有不同类型的成体干细胞群体，这些细胞参与组织的稳态维持与损伤修复。骨骼肌干细胞（MuSCs）能够生成新的肌肉组织，而纤维-脂肪生成祖细胞（FAPs）则参与间质支持性组织的形成，并具有分化为成纤维细胞和脂肪细胞的能力。MuSCs和FAPs均处于一种长期可逆的细胞周期退出状态，称为静息状态。这种静息状态对其功能至关重要。通常，静息态干细胞是从多个肌肉组织混合后的样本中进行纯化分离的。然而，近期研究表明，来源于不同肌肉的MuSCs在分子表达谱和静息深度上存在显著差异。本实验方案详细描述了从单个骨骼肌中分离和研究MuSCs与FAPs的方法，并提供了对干细胞活化过程进行分子分析的策略。方案中具体说明了如何分离并消化具有不同发育来源、厚度和功能的肌肉组织，例如膈肌、肱三头肌、股薄肌、胫骨前肌（TA）、腓肠肌（GA）、比目鱼肌、趾长伸肌（EDL）以及咬肌。MuSCs和FAPs通过荧光激活细胞分选技术（FACS）进行纯化，并通过免疫荧光染色和5-乙炔基-2'-脱氧尿苷（EdU）掺入实验进行分析。
引言
由于存在肌肉干细胞（MuSCs），骨骼肌具有很强的再生能力。MuSCs 位于肌纤维上，基底膜下方，处于一种长期可逆性退出细胞周期的静息状态1,2,3,4。在肌肉损伤后，MuSCs 被激活并进入细胞周期，产生扩增的前体细胞，这些前体细胞可进一步分化并融合形成新的肌纤维2,5。先前的研究表明，MuSCs 对肌肉再生至关重要6,7,8。此外，单个 MuSC 能够植入并生成新的干细胞以及新的肌纤维9。骨骼肌中还存在一类间充质基质细胞，称为成纤维-脂肪生成前体细胞（FAPs），在肌肉再生过程中对支持 MuSC 功能发挥关键作用6,10,11,
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方案
本方案的实施遵循奥胡斯大学的动物护理准则及当地伦理法规。
注意：务必遵守当地动物实验伦理委员会关于动物实验及啮齿类动物尸体样本处理的相关规定。小鼠可能是过敏原的潜在来源；如有条件，应开启排风装置，并将其置于工作区上方，以避免过度接触过敏原。或者，若需经常进行此类实验，应佩戴面部口罩。本方案涉及锐器操作，建议研究人员熟悉发生割伤时的急救措施及处理流程。
1. 准备（1-2 小时；解剖前一天）
注意：除非另有说明，所有溶液、培养皿和培养基均需在无菌条件下配制，并在使用前经0.45 µm滤膜过滤。配制分散酶（11 U/mL，溶于PBS）和胶原酶II（1.000 U/mL，溶于PBS）的储存液，并于-20 °C保存（表1）。在步骤4.2.6中，将储存液解冻后用于二次消化。
- 96孔半面积板的胶原蛋白包被
- 制备酸性水。在2 L烧杯中，将5.15 mL冰醋酸加入895 mL经高压灭菌的水中。
- 使用0.45 µm、500 mL滤器对溶液进行过滤。将800 mL过滤后的酸性水转移至1 L瓶中。
- 向瓶中加入40 mL无菌胶原蛋白储备液。轻轻旋转混匀，置于4 °C避光保存，直至使用。
- 使用胶原蛋白对一个或多个....
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结果
遵循单个骨骼肌分离的实验方案（图2)，从三个已从本地繁育计划中淘汰的雄性Swiss远交系小鼠中分离出股薄肌、胫骨前肌、趾长伸肌、腓肠肌、比目鱼肌、肱三头肌、咬肌和膈肌图2）。在组织解离和抗体染色后，通过FACS从各块肌肉中纯化MuSC和FAP图3）。初始设门使用未染色样本进行，以识别细胞并区分单细胞与双联体（图3A）。后续设门使用FMO对照以确定染色阈值（图3B). 对染色后的样本进行CD31/CD45-FITC和Sca1-PacBlue设门分析。SCA1+/CD31-/CD45- 群体（FAPs）被分选至一个独立的收集管中，而双阴性群体则被设门并用于VCAM1-PECy7与前向散射光（FSC）的图示分析。VCAM1+ 群体（MuSCs）被分选至单独的收集.......
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讨论
要成功实施本方案并获得较高的细胞得率，有几个关键步骤需要注意。与批量分离方案中使用的肌肉量相比，单个肌肉的体积较小，这可能导致在解剖过程中肌肉暴露而干燥，从而降低得率。为防止这种情况，应在解剖后立即向肌肉中加入培养基。此外，如果解剖耗时较长，可逐侧肢进行皮肤剥离，以减少肌肉暴露于空气中的时间。较小的体积也增加了过度消化的风险。为此，本方法所需的胶原酶II用量较少，且消化时间较短，相较于批量肌肉分离方案有所优化9,16。酶消化的效果还取决于酶的纯度，纯度较低会负面影响细胞得率。此外，机械消化至关重要。若切割不足，表面积减小将阻碍酶的充分作用，导致干细胞得率降低；若切割过度，表面积增大则会引起过度消化，同样降低干细胞得率。振荡水浴可防止消化后肌肉组织沉淀，改善酶的分布，并有助于维持温度均匀，从而整体上缩短孵育时间。因此，本方法相较于其他方法可显著缩短孵育时间。
该方案依赖于细胞解离和纯化。这些操作模拟了组织损伤，从而激活干细胞。与此一致的是，最近的研究表明，肌肉干细胞（.......
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披露
作者没有竞争性经济利益，也不存在利益冲突。
致谢
细胞分选在丹麦奥胡斯大学FACS核心实验室完成。图片使用Biorender.com绘制。我们感谢J. Farup博士分享兔抗PDGFRa抗体。本研究得到奥胡斯大学研究基金（AUFF）启动资助以及启动计划资助的支持 诺和诺德基金会资助 E.P.（0071113）和 A.D.M.（0071116）。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1.5 mL 管（PCR 性能测试，聚丙烯材质，30,000 xg，无 DNA/DNase-/RNase，低 DNA 结合，无菌） | Sarstedt AG & Co. KG, Hounisen Laboratorieudstyr A/S | 72.706.700 | 1.5 mL 管 |
| 15 mL 管（聚丙烯/高密度聚乙烯，20,000 xg，IVD/CE，IATA，无 DNA/DNase-/RNase，无细胞毒性，无热原，无菌） | Sarstedt AG & Co. KG, Hounisen Laboratorieudstyr A/S | 62.554.502 | 15 mL 管 |
| 5 mL 聚苯乙烯圆底管 | Falcon, Fisher Scientific | 352054 | 无滤网帽的 FACS 管 |
| 带细胞滤网帽的 5 mL 聚苯乙烯圆底管 | Falcon, Fisher Scientific | 352235 | 带滤网帽的 FACS 管 |
| 5 mL 管（聚丙烯材质，非无菌，可高压灭菌） | VWR collection | 525.0946 | 5 mL 管 |
| 50 mL 管（聚丙烯/高密度聚乙烯，20,000 xg，IVD/CE，ADR，无 DNA/DNase-/RNase，无细胞毒性，无热原，无菌） | Sarstedt AG & Co. KG, Hounisen Laboratorieudstyr A/S | 62.547.254 | 50 mL 管 |
| Alexa Fluor 555 驴抗兔 IgG (H+L) | Invitrogen, Thermo Fisher | 批号：2387458 (货号 # A31572) | |
| Alexa Fluor 647 驴抗小鼠 IgG (H+L) | Invitrogen, Thermo Fisher | 批号：2420713 (货号 #A31571) | |
| ARIA 3 | BD | FACS，奥胡斯大学核心设施 | |
| Centrifuge 5810 | Eppendorf | EP022628188 | 离心机 |
| Click-iT EdU 细胞增殖成像试剂盒，Alexa Fluor 488 染料 | Invitrogen, Thermo Fisher | 批号：2387287 (货号 # C10337) | 细胞增殖试剂盒 |
| 小牛皮胶原 | Bioreagent, Sigma Aldrich | 来源：SLCK6209 (货号 # C8919) | |
| II 型胶原酶 | Worthington, Fisher Scientific | 批号：40H20248 (货号 # L5004177 ) | 胶原酶 |
| Dispase | Gibco, Fisher Scientific | 批号：2309415 (货号 # 17105-041 ) | Dispase |
| 驴血清（非无菌） | Sigma Aldrich, Merck | 批号：2826455 (货号 # S30-100mL) | |
| Dumont 号 5，110 mm | Dumont, Hounisen Laboratorieudstyr A/S | 1606.327 | 尖端精细的直头镊子 |
| Dumont 号 7，115 mm | Dumont, Hounisen Laboratorieudstyr A/S | 1606.335 | 弯头镊子 |
| F-10 培养基（Ham 配方）(1x)，含 L-谷氨酰胺 | Gibco, Fisher Scientific | 批号：2453614 (货号 # 31550-023) | |
| FITC 抗小鼠 CD31 | BioLegend, NordicBioSite | MEC13.3 (货号 # 102506) | |
| FITC 抗小鼠 CD45 | BioLegend, NordicBioSite | 30-F11 (货号 # 103108) | |
| 冰醋酸（100%） | EMSURE, Merck | K44104563 9(货号 # 1000631000) | |
| 微型管旋转混合器（头对头式） | Fisher Scientific | 15534080 (型号 # 88861052) | 微型管旋转混合器 |
| 马血清 | Gibco, Fisher Scientific | 批号：2482639 (货号 # 10368902 ) | |
| Isotemp SWB 15 | FisherBrand, Fisher Scientific | 15325887 | 摇动水浴箱 |
| MS2 微型振荡器 | IKA | 涡旋仪 | |
| 20 G 针头（0.9 mm x 25 mm） | BD microlance, Fisher Scientific | 304827 | 20G 针头 |
| 10% 中性福尔马林缓冲液 | CellPath, Hounisen Laboratorieudstyr A/S | 批号：03822014 (货号 # HOU/1000.1002) | |
| 无热原细胞滤网（40 µM） | Sarstedt AG & Co. KG, Hounisen Laboratorieudstyr A/S | 83.3945.040 | 细胞滤网 |
| Pacific Blue 抗小鼠 Ly-6A/E (Sca-1) | BioLegend, NordicBioSite | D7 (货号 # 108120) | |
| Pax7 一抗 | DSHB | 批号：2/3/22-282ug/mL (货号 # AB 528428) | |
| PBS 10x 粉末浓缩液 | Fisher BioReagents, Fisher Scientific | BP665-1 | |
| PE/Cy7 抗小鼠 CD106 (VCAM1) | BioLegend, NordicBioSite | 429 (MVCAM.A) (货号 # 105720) | |
| 青霉素/链霉素（Pen/strep） | Gibco, Fisher Scientific | 批号：163589 (货号 # 11548876 ) | |
| 10 µL 吸头 | Art tips, 自密封屏障, Thermo Scientific | 2140-05 | 低吸附，预灭菌，带滤芯吸头 |
| 1000 µL 吸头 | Art tips, 自密封屏障, Thermo Scientific | 2279-05 | 低吸附，预灭菌，带滤芯吸头 |
| 20 µL 吸头 | Art tips, 自密封屏障, Thermo Scientific | 2149P-05 | 低吸附，预灭菌，带滤芯吸头 |
| 200 µL 吸头 | Art tips, 自密封屏障, Thermo Scientific | 2069-05 | 低吸附，预灭菌，带滤芯吸头 |
| 防护垫 | Abena | ACTC-7712 | 60 x 40 cm，8 层 |
| Rainin, pipet-lite XLS | Mettler Toledo, Thermo Scientific | 2140-05, 2149P-05, 2279-05, 2069-05 | 移液器（P10, P20, P200, P1000） |
| 重组抗 PDGFR-alpha 抗体 | RabMAb, abcam | AB134123 | |
| 手术刀（刀柄编号 3） | Hounisen, Hounisen Laboratorieudstyr A/S | 1902.502 | 手术刀 |
| 11 号手术刀片 | Heinz Herenz, Hounisen Laboratorieudstyr A/S | 1902.0911 | 手术刀 |
| Scanlaf mars | Labogene | 2 级生物安全柜：Mars | 超净工作台 |
| ScanR | Olympus | 显微镜，奥胡斯大学核心设施 | |
| 剪刀 | FST | 14568-09 | |
| Series 8000 DH | Thermo Scientific | 3540-MAR | 培养箱 |
| 10 mL 血清移液管 | VWR | 612-3700 | 无菌，无热原 |
| 5 mL 血清移液管 | VWR, Avantor 由 VWR 供应 | 612-3702 | 无菌，无热原 |
| 5 mL 注射器，鲁尔接头（6%），无菌 | BD Emerald, Fisher Scientific | 307731 | 注射器 |
| TC 培养皿 100，标准型 | Sarstedt AG & Co. KG, Hounisen Laboratorieudstyr A/S | 83.3902 | 培养皿 |
| 组织培养（TC）处理表面，黑色聚苯乙烯，平底，无菌，带盖，20 个/包 | Corning, Sigma Aldrich | 3764 | 96 孔半底板 |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich, Merck | 来源：SLCJ6163 (货号 # T8787) |
参考文献
- Mauro, A. Satellite cell of skeletal muscle fibers. The Journal of Biophysical and Biochemical Cytology. 9 (2), 493-495 (1961).
- Relaix, F., et al. Perspectives on skeletal muscle stem cells. Nature Communications. 12 (1), 692(2021).
- Cheung....
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