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方法文章

异常朊蛋白的免疫组织化学检测

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DOI：

10.3791/64560

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2023年5月5日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Animal and Veterinary Research Centre (CECAV), Associate Laboratory for Animal and Veterinary Science-AL4AnimalS, University of Trás-os-Montes and Alto Douro (UTAD), 2Pathology Laboratory, UEISPSA, National Institute for Agricultural and Veterinary Research (INIAV), Oeiras, 3Pathology Laboratory, UEISPSA, National Institute for Agricultural and Veterinary Research (INIAV), Vairão

本文内容

摘要

使用免疫组织化学方案对异常朊蛋白进行免疫标记，需要特定的样本和抗PrP抗体的制备方法。本方案描述了表位去遮蔽的关键步骤，以确保PrP免疫标记的准确性，并最大限度地减少非特异性背景染色。此外，该方法在对朊病毒感染组织进行免疫组织化学研究时，也考虑了相应的生物安全措施。

摘要

异常朊蛋白（PrPSc）是细胞型朊蛋白的致病相关异构体，也是可传播性海绵状脑病（TSEs）的诊断标志物。这类神经退行性疾病影响人类及多种动物，包括羊瘙痒症、具有人畜共患风险的牛海绵状脑病（BSE）、鹿类慢性消耗性疾病（CWD），以及新近发现的骆驼朊蛋白病（CPD）。TSEs的诊断依赖于对脑组织（特别是脑干的延髓水平，即obex水平）应用免疫组织化学（IHC）和蛋白质印迹（WB）方法检测PrPSc。IHC是一种广泛应用的技术，利用 针对组织切片中目标抗原的特异性一抗（单克隆或多克隆抗体）进行检测。抗体与抗原的结合可通过显色反应进行可视化，该反应信号定位于抗体所靶向的组织或细胞区域。因此，在朊蛋白病及其他研究领域中，免疫组织化学不仅用于诊断，也广泛应用于发病机制研究。此类研究通过检测PrPSc的分布模式和类型，并与已知特征进行比对，以识别新型朊病毒株。由于BSE可感染人类，建议在生物安全三级（BSL-3）实验室设施或遵循相应操作规范下处理用于TSE监测的牛、小型反刍动物及鹿类样本。此外，应尽可能使用专用的密闭设备和专用于朊病毒实验的仪器，以减少污染风险。PrPSc的IHC操作流程中包含甲酸处理步骤，该步骤既用于抗原表位暴露（去遮蔽），同时也作为朊病毒失活措施，因为本技术所使用的福尔马林固定、石蜡包埋组织仍具有传染性。在结果判读时，必须谨慎区分非特异性免疫标记与目标特异性标记。为此，应充分认识来自已知TSE阴性对照动物中的免疫标记伪影，以便将其与特异性的PrPSc免疫标记类型区分开来；后者可因TSE毒株、宿主物种及prnp基因型的不同而有所差异，本文将进一步阐述。

引言

根据朊病毒假说，异常异构体（PrPSc）是可传播性海绵状脑病（TSEs）中传染性病原体的主要甚至唯一组分。TSE的诊断确认依赖于对脑组织应用免疫组织化学（IHC）方案和/或蛋白质免疫印迹法（WB）检测PrPSc的免疫学检测1。

免疫组化（IHC）是一种利用单克隆抗体或在某些情况下多克隆抗体（作为一抗）作为免疫染色第一步的方法，用于特异性识别组织切片细胞中特定目标抗原。一抗与抗原的有效结合可通过特异性识别一抗的二抗进行可视化。这些二抗通常与酶（如辣根过氧化物酶（HRP）或碱性磷酸酶（AP））偶联。通过向这些酶添加底物，生成不溶性的有色沉淀物，沉积于一抗与目标抗原结合的区域，从而实现信号可视化。通过复染可进一步增强可视化效果，即使用染料使免疫标记与未免疫标记的组织区域之间形成对比2。

使用福尔马林固定石蜡包埋组织（FFPE）进行免疫组化（IHC）时，福尔马林固定可能因甲醛交联以及石蜡包埋过程中的加热和脱水作用而削弱一抗的有效性。这些处理会改变蛋白质的构象，导致抗原表位被破坏、变性或遮蔽，从而减弱甚至完全阻碍其检测3。因此，必须进行抗原修复（AR）。AR技术可破坏抗原分子中与甲醛相关的化学基团交联，从而恢复或暴露原始的抗原-蛋白构象，进而重建抗体与抗原（表位）之间的亲和力，实现免疫标记。AR的最终效果取决于靶抗原的特性及/或一抗的性质2。

热诱导抗原（表位）修复（HIER）是抗原修复（AR）3的一种方法，本文所述其常规用于PrPSc的免疫组织化学（IHC）检测。免疫组织化学对于疾病诊断至关重要，并在研究实验室中用于确定与病理相关的抗原在组织中的分布情况。该技术广泛应用于癌症、神经科学和传染病等领域的诊断与研究4。对于传染性海绵状脑病（TSEs），IHC在诊断和研究中具有重要作用，可用于确认和分析自然宿主及实验模型中PrPSc的分布情况。IHC有助于朊病毒致病机制的研究，以及PrPSc沉积类型和模式的分析，特别是在神经组织中5，以发现与常规描述感染不同的特征，并识别可能的新型朊病毒株。

由于牛海绵状脑病（BSE）的朊病毒可感染人类，因此涉及BSE操作的某些实验室方案可能需要使用生物安全三级（BSL-3）设施和操作规范6。这些措施包括在机构和实验室内部运输潜在BSE感染组织样本时使用密封的次级容器。此外，应尽可能划定专门的 containment 区域，并配备专用于BSE研究和分析的设备。这样做的目的是防止工作区域以外的污染，并提供一个封闭的空间，因为后续需要进行去污处理。

因此，INIAV病理实验室遵循推荐的生物安全三级（BSL-3）设施与操作规范6，以处理与TSE监测相关的牛、小型反刍动物和鹿类组织中可能含有朊病毒的样本。

用于TSE诊断或研究程序的福尔马林固定和石蜡包埋组织，尤其是中枢神经系统组织，可能具有传染性。因此，在组织处理前，必须使用甲酸处理这些固定组织，以降低其中可能存在的朊病毒的传染性。具体操作是将固定并修整好的组织（厚度约2-4 mm）放入组织处理盒中，然后将处理盒浸入98%甲酸溶液中1小时。浸泡后，将含有组织的处理盒在流动自来水下冲洗30分钟，再放回固定液中，随后进行后续处理。如果在组织处理前未进行此步骤，则切片后的显微切片必须在未稀释的甲酸中浸泡至少5分钟，方可进行组织学染色7。PrPSc的免疫组化（IHC）方案中包含常规的甲酸表位修复步骤，该步骤同时也可使朊病毒失活7。经过上述朊病毒失活处理后，所得的固定组织可在生物安全二级（BSL-2）条件下，采用标准的BSL-2操作规范进行处理。

对纳入TSE监测的任何动物进行TSE诊断时，最低组织采样要求是采集脑干（延髓水平，即obex处）。此外，为检测非典型BSE和痒病，建议同时采集部分小脑组织1,8。对于CWD诊断，应同时检测脑干（obex）和咽后淋巴结，因为PrPSc可在淋巴组织中检出，而obex部位可能无法检测到PrPSc9，Machado等人的综述对此进行了总结10。

脑干的延髓闭合部包含诊断性TSE靶向区域，即迷走神经背核（DVN）、孤束核（STN）以及三叉神经脊束核（V）。这些区域始终呈现双侧PrPSc聚集，即使在牛海绵状脑病（BSE）和经典型羊瘙痒病的早期阶段亦如此。在进展期TSE的临床病例中，脑干内所有灰质区域均显示PrPSc的广泛分布11。

在切片和处理之前，需对脑组织样本进行评估（图1），以确定自溶程度以及是否存在可能影响样本适用于基于免疫组化（IHC）的确认诊断的组织损伤8。为验证制备流程和分析结果的完整性，在每次检测中均需将TSE阳性和阴性组织样本作为对照，与待测病例的组织制备同步进行。

FFPE组织切片制备和免疫检测示意图；步骤包括脱蜡、复水、抗原修复、过氧化物酶失活、抗体结合以及用于显微镜分析的显色反应。
图1：PrPSc 免疫组织化学（IHC）操作流程。 示意图展示了从组织切片脱蜡到最终免疫染色与检测的PrPSc IHC操作步骤（FFPE——福尔马林固定石蜡包埋；Mab——单克隆抗体；DAB——3,3' 二氨基联苯胺）。本图由BioRender.com制作。 请点击此处查看此图的高清大图。

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方案

本文所述免疫组织化学（IHC）程序是研究项目FAIRJ-CT98-7021"建立欧洲反刍动物可传播性海绵状脑病（TSE）监测网络，并对可疑病例的识别流程与标准进行标准化和统一"的组成部分。该程序遵循世界动物卫生组织（WOAH，前身为国际动物卫生组织OIE）1以及欧洲动物TSE参考实验室8,11所定义的诊断标准。自2008年起，该IHC程序已获得NP ISO/IEC 17025（检测和校准实验室能力的通用要求）认证。该认证意味着实验室建立了高质量的管理体系，包括标准操作程序、合格的技术人员、精确校准的设备、严格的数据与试剂控制、参加实验室间能力验证试验、不合格工作的管理以及风险评估，以提升管理体系的有效性，获得更可靠的检测结果，并预防实验室安全隐患。用于实验的朊病毒阳性组织对照样本包括牛海绵状脑病（BSE）、经典型羊瘙痒病、非典型羊瘙痒病和慢性消耗性疾病（CWD），均来自不同来源，经福尔马林固定、石蜡包埋（FFPE）处理。牛和羊的组织切片来自动物TSE监测项目中确诊的病例。CWD组织切片则来源于2003年加拿大食品检验署国家动物疾病中心Stefanie Czub教授慷慨提供的对照样品，以及2008年由欧洲TSE参考实验室（APHA，Weybridge）组织的CWD能力验证测试样品。

1. 组织切片与载玻片制备

  1. 使用切片机对福尔马林固定、石蜡包埋（FFPE）的组织进行切片，厚度为 3–5 µm。
  2. 将切片漂浮于温度比所用石蜡熔点低约 10 ˚C 的纯净水中。将切片从水中转移至经过特殊处理的显微镜载玻片上（参见 材料表）。让水充分从载玻片上流尽。
  3. 将载玻片在 50 ˚C 下孵育过夜，以增强组织在载玻片上的附着性。
    注意：建议为免疫组化（IHC）实验流程使用新鲜切片的组织，尽管TSE阳性和阴性对照切片可预先制备并储存。步骤 2 至 4 必须在化学通风橱中进行。

2. 脱蜡与复水

  1. 将带有组织切片的玻片放入不锈钢染色架中（参见材料表）。将染色架浸入二甲苯浴（不锈钢染色容器）中3分钟，取出后再浸入一次。
  2. 移除二甲苯，并通过将切片浸入无水乙醇浴中3分钟进行再水化。取出后再次浸入无水乙醇浴中。
  3. 将切片在空气中干燥，然后放入90%乙醇浴中1分钟。转移至70%乙醇浴中1分钟，最后转移至50%乙醇浴中1分钟。每次乙醇浴处理时，均需轻轻振荡染色架两次，并在进行下一次转移前将染色架沥干。

3. 抗原表位修复

  1. 将组织切片小心浸入98%甲酸中，室温下处理30分钟。随后用自来水冲洗5分钟，再用蒸馏水冲洗两次。
    警告：甲酸具有强腐蚀性，必须佩戴防护眼镜和手套。
  2. 按照以下步骤进行热诱导抗原修复（HIER）。
    注意：本步骤采用加压高温蒸汽灭菌法，在特定压力舱中于121 °C处理30分钟（参见材料表）。
    1. 将柠檬酸盐缓冲液（10 mM，pH 6.1，参见材料表）置于不锈钢染色容器中，并放入装有500 mL蒸馏水的压力舱内，于98 °C预热约20分钟。
      注意：在本研究中，所用特定设备的程序设定点为1（SP1）。
    2. 当设备报警提示已达到预设时间和温度后，将载玻片篮浸入其中，并启动设定点2程序（121 °C，30分钟）。为质量控制目的，可在篮子上贴一段粘性高压灭菌指示胶带，以监测温度和压力，并记录该程序的初始和最终压力。
    3. 若待免疫染色的载玻片数量未达到篮子容量，请使用洁净的空白载玻片填满空位。程序结束后，让压力舱自然恢复至环境压力（至少30分钟）。
      注意：延长此过程可能有助于降低非特异性背景染色。
    4. 小心将载玻片篮转移至盛有蒸馏水的不锈钢染色容器中，浸泡5分钟。

4. 内源性过氧化物酶的灭活

  1. 将装有样本切片的切片架浸入含3%过氧化氢（H2O2）的甲醇溶液中，孵育30分钟。用流动水冲洗切片（5分钟）。沥干后，将切片浸入1×Tris缓冲盐水（TBS）中，再孵育5分钟。

5. 免疫检测

注意：本研究中的免疫检测采用毛细管间隙法7，并使用市售的载玻片夹具组装系统（参见材料表）。其他免疫组织化学载玻片系统也可适用。

  1. 将每张切片放置于市售的盖板架上（参见材料表），架体预先用TBS润湿，避免产生气泡，组织面朝向架体，切片边缘与架体的两个下端点对齐。
    1. 用拇指和食指夹住切片-架体组件，一指压在样本切片上方，另一指托住架体底部，然后将组件放入系统的染色架槽中。
    2. 为确保组件装配良好，向样本切片与架体之间的孔隙中加入TBS，液体不应立即溢出。自此之后，需确保架体与切片之间始终保留约80 µL的TBS。切勿让组织切片干燥。
  2. 将切片放入系统后，在使用一抗（抗PrP抗体，参见材料表）处理前，为降低背景染色，需用与二抗宿主相同物种的20%正常血清（本实验中为马血清）在TBS中对样本切片进行30分钟的预孵育。
  3. 根据待分析的动物种类、需检测的样本切片数量以及工作稀释液的用量，解冻相应数量的抗体分装液。
    注意：为获得最佳效果，建议在一抗溶液中使用与二抗来源相同物种的10%正常血清。若条件允许，正常血清与二抗的宿主应为同一物种。
  4. 无需洗涤切片，直接将一抗溶液（200 µL）加入切片架组件的每个孔中，在室温下孵育60分钟。
  5. 洗涤时，用TBS充满切片架组件的各孔，静置5分钟，重复此步骤两次。
  6. 将生物素标记的二抗（单克隆抗鼠源马抗体，参见材料表）用含10%马血清的TBS按1:200比例稀释。根据待处理切片的数量准备所需体积。
  7. 将二抗溶液（200 µL）加入切片架组件的每个孔中，在室温下孵育30分钟。
  8. 按步骤5.5所述方法进行洗涤。
  9. 进行链霉亲和素-生物素-过氧化物酶复合物（ABC/HRP复合物，参见材料表）孵育时，需在使用前30分钟配制试剂。将ABC/HRP复合物溶液（200 µL）加入切片架组件的每个孔中，在室温下孵育30分钟。
  10. 按步骤5.5所述方法进行洗涤。

6. 使用DAB发色剂显色

警告：DAB 为潜在致癌物。因此，在使用该试剂时需采取适当的防护措施，包括佩戴护目镜、实验服、手套，并遵循良好的实验室操作规范。废弃物应按照当地法规进行处置。

  1. 使用前立即按照制造商说明（见材料表）稀释显色剂。每孔加入显色剂溶液 400 µL 至玻片板组的每个孔中。
  2. 室温孵育最多 30 分钟。对于 PrPSc 阳性切片，通常孵育 10 分钟即可。
  3. 用蒸馏水洗涤玻片，去除残留的显色剂溶液。将玻片从盖板架中取出，放入盛有蒸馏水的塑料容器中。

7. 苏木精复染

  1. 将装有切片的不锈钢染色篮浸入苏木精溶液浴中（见材料表）1分钟。用流动的冷水轻轻冲洗10分钟，或用温水冲洗5分钟。
  2. 将切片依次置于90%乙醇中1分钟，再置于无水乙醇中1分钟进行脱水。随后将载玻片放入二甲苯浴中1分钟。
  3. 使用市售封片介质对切片进行封片（见材料表）。
    注意：以上步骤均在室温（19 ˚C–24 ˚C）下的化学通风橱中进行。本流程包含一份测试记录表（补充文件1），用于记录所有步骤的完成情况、所用设备及实验技术人员信息。此外，还设计了一份工作表（补充文件2），便于根据每次实验的切片数量、工作稀释度、生产商说明书，以及记录室温、设备和试剂批号，快速计算所需试剂体积。

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结果

鉴于可能存在非特异性靶标免疫标记，确定已知TSE阴性对照动物中非特异性免疫标记的水平至关重要。这是正确解读特异性PrP信号的重要步骤。Sc 免疫标记7 (图2). 抗PrP抗体的非靶向标记表现为神经元内离散的细颗粒状染色（在舌下神经核和副楔束核中更为明显），以及神经组织中不规则的细线状染色（STN、V、橄榄核、副楔束核、外侧被束核、橄榄核背侧网状结构和最后区）。12，某些灰质和白质区域出现弥散性非颗粒状标记，以及神经元胞质的弥散性标记13 (图3).

根据多项研究，特定的靶向 PrPSc 免疫标记可在多种不同类型中被发现，具体类型取决于 TSE 毒株、宿主物种以及 prnp 基因型。目前已描述的 PrPSc 类型包括（Or...

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讨论

TSE 是潜在的人畜共患疾病。自1986年英国出现牛海绵状脑病（BSE）以来，葡萄牙成为欧洲联盟成员国中该病发病率较高的国家之一14,15。为控制该疾病及其他新出现的TSE（包括经典和非典型羊瘙痒病、BSE变异株，以及目前对鹿科动物慢性消耗性疾病开展的监测），葡萄牙食品与兽医总局（DGAV）和国家农业与兽医研究机构（INIAV）建立了监测机制，其中INIAV作为TSE国家兽医实验室负责TSE的诊断工作。该实验室遵循推荐的生物安全三级（BSL-3）设施标准和操作规范6，用于处理与TSE监测相关的牛、小型反刍动物及鹿科动物可能感染朊病毒的组织样本。通过免疫组织化学法（IHC）和/或蛋白质印迹法（WB）对脑组织和淋巴组织中的PrPSc进行免疫检测，是确认TSE诊断的参考方法1。

免疫组织化学技术在兽医和人类医学的诊断及解剖病理学研究中是一种有用的辅助工具。...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本文由FCT（科学技术基金会）—FEDER—Balcão2020资助的项目POCI-01-0145-FEDER-029947"葡萄牙慢性消耗性疾病风险评估"提供资金支持。此外，研究单位CECAV的作者还获得了FCT在项目UIDB/CVT/0772/2020下的资助。我们感谢美国农业部西部区域研究中心研究主任（已退休）Bruce C. Campbell提供的帮助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
无水乙醇 LabchemLB0507-9010未稀释
      用蒸馏水稀释至90%、70%和50%
亲和素-生物素复合物和过氧化物酶
Vectastain Elite ABC试剂盒（过氧化物酶）		Vector LaboratoriesPK-6100根据试剂盒说明书在使用前30分钟配制并轻轻混匀。静置后不得再混合。
生物素化二抗（马抗小鼠IgG H+L） Vector LaboratoriesBA-2000-1.5用含10%马正常血清的TBS以1:200比例稀释。根据切片数量准备所需体积。
显色底物DAB（二氨基联苯胺）-过氧化物酶底物试剂盒 Vector LaboratoriesSK-4100根据试剂盒说明书在使用前配制。
每张切片使用400 µL溶液。
DakoCytomation Pascal加压染色缸DAKOS2800
Ehrlich’s苏木精染液：
苏木精Merck115938将2 g苏木精溶解于100 mL无水乙醇中。加入100 mL蒸馏水、10 mL冰醋酸和15 g明矾，持续搅拌。再加入100 mL甘油。自然氧化过程需2个月，方可使用。
无水乙醇 LabchemLB0507-9010
冰醋酸 Merck101830
明矾Merck1.01047.1000
甘油Merck1.04091.1000
内源性过氧化物酶封闭液（3% H2O2浓度）：40 mL过氧化氢（30% w/w）加入360 mL甲醇中。
使用前配制
过氧化氢（30% w/w）ScharlauHI0136
甲醇 Sigma Aldrich322415-2L
甲酸98%Merck1.00264.1000未稀释
切片机 Shandon-AS325切片机 Shandon-AS325
封片剂EntellanMerck107960即用型。
TBS中的正常血清（20%）封闭液：
马正常血清
Gibco
16050-122 		根据检测中切片数量准备最终体积
（每张切片200 µL溶液）。
一抗抗PrP小鼠单克隆抗体2G11 BIORADMCA2460PrP 146-R154R171182
适用于绵羊（包括非典型痒病）、鹿和猫。不适用于牛。
根据检测中切片数量（每张切片200 µL溶液）和抗体稀释比例，在补充了10%二抗来源物种正常血清（马正常血清）的TBS中配制最终体积
通常抗体稀释比例为2G11 1:100，但每次新批次应确定最佳工作稀释度，以获得最强信号和最低背景。储存时，将至少10 μL分装至无菌微量管中冷冻。每次解冻一份使用。 
一抗抗PrP小鼠单克隆抗体12F10 Cayman  Chemical Company 189710PrP142-160
适用于牛，不适用于绵羊
通常抗体稀释比例为1:200，但工作稀释度也需确定。配制方法同2G11
Shandon CoverplateTM染色室Thermo Scientific 72110017
Shandon Sequenza®免疫染色中心 Thermo Scientific73300001
Shandon Sequenza®免疫染色载片架Thermo Scientific73310017
柠檬酸盐缓冲液（10 mM，pH 6.1）：将2.55 g二水合三钠柠檬酸盐 和0.255 g柠檬酸溶于1升纯化水中。
使用10 mM柠檬酸溶液（1.05 g柠檬酸溶于500 mL纯化水中）调节工作液pH至6.1
在检测当天配制。 
二水合三钠柠檬酸盐Sigma-aldrich S4641-500G
柠檬酸Sigma AldrichC0759
染色缸及染色篮Deltalab 19360
19361
Superfrost Plus显微镜载玻片VWR631-0108
Tris缓冲盐水溶液（TBS）（50 mM TRIZMA BASE；0.8% NaCl；pH 7.6）：10xTBS（储存液：0.5 M TRIZMA BASE；8% NaCl；pH 7.6）：
将60.57 g TRIZMA BASE和80 g NaCl溶于800 mL纯化水中。用37%盐酸调节储存液pH，并用纯化水定容至1升（储存于5± 3 °C，可保存2个月）
检测当天将TBS储存液以1:10比例稀释。 
TRIZMA BASESigma AldrichT6066-1KG
氯化钠（NaCl）Merck106404
二甲苯 Panreac Applied Chem ITW reagents251769未稀释

参考文献

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朊蛋白检测PrPSc 免疫标记可传播性海绵状脑病脑干组织抗体染色甲酸预处理石蜡包埋组织牛海绵状脑病慢性消耗性疾病
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