异常朊蛋白的免疫组织化学检测

摘要

使用免疫组织化学方案对异常朊蛋白进行免疫标记，需要特定的样本和抗PrP抗体的制备方法。本方案描述了表位去遮蔽的关键步骤，以确保PrP免疫标记的准确性，并最大限度地减少非特异性背景染色。此外，该方法在对朊病毒感染组织进行免疫组织化学研究时，也考虑了相应的生物安全措施。

摘要

异常朊蛋白（PrP^Sc）是细胞型朊蛋白的致病相关异构体，也是可传播性海绵状脑病（TSEs）的诊断标志物。这类神经退行性疾病影响人类及多种动物，包括羊瘙痒症、具有人畜共患风险的牛海绵状脑病（BSE）、鹿类慢性消耗性疾病（CWD），以及新近发现的骆驼朊蛋白病（CPD）。TSEs的诊断依赖于对脑组织（特别是脑干的延髓水平，即obex水平）应用免疫组织化学（IHC）和蛋白质印迹（WB）方法检测PrP^Sc。IHC是一种广泛应用的技术，利用 针对组织切片中目标抗原的特异性一抗（单克隆或多克隆抗体）进行检测。抗体与抗原的结合可通过显色反应进行可视化，该反应信号定位于抗体所靶向的组织或细胞区域。因此，在朊蛋白病及其他研究领域中，免疫组织化学不仅用于诊断，也广泛应用于发病机制研究。此类研究通过检测PrP^Sc的分布模式和类型，并与已知特征进行比对，以识别新型朊病毒株。由于BSE可感染人类，建议在生物安全三级（BSL-3）实验室设施或遵循相应操作规范下处理用于TSE监测的牛、小型反刍动物及鹿类样本。此外，应尽可能使用专用的密闭设备和专用于朊病毒实验的仪器，以减少污染风险。PrP^Sc的IHC操作流程中包含甲酸处理步骤，该步骤既用于抗原表位暴露（去遮蔽），同时也作为朊病毒失活措施，因为本技术所使用的福尔马林固定、石蜡包埋组织仍具有传染性。在结果判读时，必须谨慎区分非特异性免疫标记与目标特异性标记。为此，应充分认识来自已知TSE阴性对照动物中的免疫标记伪影，以便将其与特异性的PrP^Sc免疫标记类型区分开来；后者可因TSE毒株、宿主物种及prnp基因型的不同而有所差异，本文将进一步阐述。

引言

根据朊病毒假说，异常异构体（PrP^Sc）是可传播性海绵状脑病（TSEs）中传染性病原体的主要甚至唯一组分。TSE的诊断确认依赖于对脑组织应用免疫组织化学（IHC）方案和/或蛋白质免疫印迹法（WB）检测PrP^Sc的免疫学检测¹。

免疫组化（IHC）是一种利用单克隆抗体或在某些情况下多克隆抗体（作为一抗）作为免疫染色第一步的方法，用于特异性识别组织切片细胞中特定目标抗原。一抗与抗原的有效结合可通过特异性识别一抗的二抗进行可视化。这些二抗通常与酶（如辣根过氧化物酶（HRP）或碱性磷酸酶（AP））偶联。通过向这些酶添加底物，生成不溶性的有色沉淀物，沉积于一抗与目标抗原结合的区域，从而实现信号可视化。通过复染可进一步增强可视化效果，即使用染料使免疫标记与未免疫标记的组织区域之间形成对比²。

使用福尔马林固定石蜡包埋组织（FFPE）进行免疫组化（IHC）时，福尔马林固定可能因甲醛交联以及石蜡包埋过程中的加热和脱水作用而削弱一抗的有效性。这些处理会改变蛋白质的构象，导致抗原表位被破坏、变性或遮蔽，从而减弱甚至完全阻碍其检测³。因此，必须进行抗原修复（AR）。AR技术可破坏抗原分子中与甲醛相关的化学基团交联，从而恢复或暴露原始的抗原-蛋白构象，进而重建....

方案

本文所述免疫组织化学（IHC）程序是研究项目FAIRJ-CT98-7021"建立欧洲反刍动物可传播性海绵状脑病（TSE）监测网络，并对可疑病例的识别流程与标准进行标准化和统一"的组成部分。该程序遵循世界动物卫生组织（WOAH，前身为国际动物卫生组织OIE）¹以及欧洲动物TSE参考实验室^8,11所定义的诊断标准。自2008年起，该IHC程序已获得NP ISO/IEC 17025（检测和校准实验室能力的通用要求）认证。该认证意味着实验室建立了高质量的管理体系，包括标准操作程序、合格的技术人员、精确校准的设备、严格的数据与试剂控制、参加实验室间能力验证试验、不合格工作的管理以及风险评估，以提升管理体系的有效性，获得更可靠的检测结果，并预防实验室安全隐患。用于实验的朊病毒阳性组织对照样本包括牛海绵状脑病（BSE）、经典型羊瘙痒病、非典型羊瘙痒病和慢性消耗性疾病（CWD），均来自不同来源，经福尔马林固定、石蜡包埋（FFPE）处理。牛和羊的组织切片来自动物TSE监测项目中确诊的病例。CWD组织切片则来源于2003年加拿大食品检验署国家动物疾病中心Stefanie Czub教授慷慨提供的对照样品，以及2008年由欧洲TSE参考实验室（APHA，Weybridge）组织的CWD能力验证测试样品。

1.....

结果

鉴于可能存在非特异性靶标免疫标记，确定已知TSE阴性对照动物中非特异性免疫标记的水平至关重要。这是正确解读特异性PrP信号的重要步骤。^Sc 免疫标记⁷ (图2). 抗PrP抗体的非靶向标记表现为神经元内离散的细颗粒状染色（在舌下神经核和副楔束核中更为明显），以及神经组织中不规则的细线状染色（STN、V、橄榄核、副楔束核、外侧被束核、橄榄核背侧网状结构和最后区）。¹²，某些灰质和白质区域出现弥散性非颗粒状标记，以及神经元胞质的弥散性标记¹³ (图3).

根据多项研究，特定的靶向 PrP^Sc 免疫标记可在多种不同类型中被发现，具体类型取决于 TSE 毒株、宿主物种以及 prnp 基因型。目前已描述的 PrP^Sc 类型包括（Or.......

讨论

TSE 是潜在的人畜共患疾病。自1986年英国出现牛海绵状脑病（BSE）以来，葡萄牙成为欧洲联盟成员国中该病发病率较高的国家之一^14,15。为控制该疾病及其他新出现的TSE（包括经典和非典型羊瘙痒病、BSE变异株，以及目前对鹿科动物慢性消耗性疾病开展的监测），葡萄牙食品与兽医总局（DGAV）和国家农业与兽医研究机构（INIAV）建立了监测机制，其中INIAV作为TSE国家兽医实验室负责TSE的诊断工作。该实验室遵循推荐的生物安全三级（BSL-3）设施标准和操作规范⁶，用于处理与TSE监测相关的牛、小型反刍动物及鹿科动物可能感染朊病毒的组织样本。通过免疫组织化学法（IHC）和/或蛋白质印迹法（WB）对脑组织和淋巴组织中的PrP^Sc进行免疫检测，是确认TSE诊断的参考方法¹。

免疫组织化学技术在兽医和人类医学的诊断及解剖病理学研究中是一种有用的辅助工具。.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
无水乙醇	Labchem	LB0507-9010	未稀释
			用蒸馏水稀释至90%、70%和50%
亲和素-生物素复合物和过氧化物酶 Vectastain Elite ABC试剂盒（过氧化物酶）	Vector Laboratories	PK-6100	根据试剂盒说明书在使用前30分钟配制并轻轻混匀。静置后不得再混合。
生物素化二抗（马抗小鼠IgG H+L）	Vector Laboratories	BA-2000-1.5	用含10%马正常血清的TBS以1:200比例稀释。根据切片数量准备所需体积。
显色底物DAB（二氨基联苯胺）-过氧化物酶底物试剂盒	Vector Laboratories	SK-4100	根据试剂盒说明书在使用前配制。 每张切片使用400 µL溶液。
DakoCytomation Pascal加压染色缸	DAKO	S2800
Ehrlich’s苏木精染液：
苏木精	Merck	115938	将2 g苏木精溶解于100 mL无水乙醇中。加入100 mL蒸馏水、10 mL冰醋酸和15 g明矾，持续搅拌。再加入100 mL甘油。自然氧化过程需2个月，方可使用。
无水乙醇	Labchem	LB0507-9010
冰醋酸	Merck	101830
明矾	Merck	1.01047.1000
甘油	Merck	1.04091.1000
内源性过氧化物酶封闭液（3% H2O2浓度）：			40 mL过氧化氢（30% w/w）加入360 mL甲醇中。 使用前配制
过氧化氢（30% w/w）	Scharlau	HI0136
甲醇	Sigma Aldrich	322415-2L
甲酸98%	Merck	1.00264.1000	未稀释
切片机	Shandon-AS325	切片机	Shandon-AS325
封片剂Entellan	Merck	107960	即用型。
TBS中的正常血清（20%）封闭液： 马正常血清	Gibco	16050-122	根据检测中切片数量准备最终体积 （每张切片200 µL溶液）。
一抗抗PrP小鼠单克隆抗体2G11	BIORAD	MCA2460	PrP 146-R154R171182 适用于绵羊（包括非典型痒病）、鹿和猫。不适用于牛。 根据检测中切片数量（每张切片200 µL溶液）和抗体稀释比例，在补充了10%二抗来源物种正常血清（马正常血清）的TBS中配制最终体积 通常抗体稀释比例为2G11 1:100，但每次新批次应确定最佳工作稀释度，以获得最强信号和最低背景。储存时，将至少10 μL分装至无菌微量管中冷冻。每次解冻一份使用。
一抗抗PrP小鼠单克隆抗体12F10	Cayman  Chemical Company	189710	PrP142-160 适用于牛，不适用于绵羊 通常抗体稀释比例为1:200，但工作稀释度也需确定。配制方法同2G11
Shandon CoverplateTM染色室	Thermo Scientific	72110017
Shandon Sequenza®免疫染色中心	Thermo Scientific	73300001
Shandon Sequenza®免疫染色载片架	Thermo Scientific	73310017
柠檬酸盐缓冲液（10 mM，pH 6.1）：			将2.55 g二水合三钠柠檬酸盐 和0.255 g柠檬酸溶于1升纯化水中。 使用10 mM柠檬酸溶液（1.05 g柠檬酸溶于500 mL纯化水中）调节工作液pH至6.1 在检测当天配制。
二水合三钠柠檬酸盐	Sigma-aldrich	S4641-500G
柠檬酸	Sigma Aldrich	C0759
染色缸及染色篮	Deltalab	19360
		19361
Superfrost Plus显微镜载玻片	VWR	631-0108
Tris缓冲盐水溶液（TBS）（50 mM TRIZMA BASE；0.8% NaCl；pH 7.6）：			10xTBS（储存液：0.5 M TRIZMA BASE；8% NaCl；pH 7.6）： 将60.57 g TRIZMA BASE和80 g NaCl溶于800 mL纯化水中。用37%盐酸调节储存液pH，并用纯化水定容至1升（储存于5± 3 °C，可保存2个月） 检测当天将TBS储存液以1:10比例稀释。
TRIZMA BASE	Sigma Aldrich	T6066-1KG
氯化钠（NaCl）	Merck	106404
二甲苯	Panreac Applied Chem ITW reagents	251769	未稀释