电穿孔是一种快速且被广泛采用的方法，用于将外源DNA导入属内 立克次体. 本方案提供了一种有效的电穿孔方法，用于转化专性胞内寄生细菌属中的细菌 立克次体.
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本文内容
摘要
摘要
立克次体病由属于立克次体属的一系列专性细胞内细菌引起 立克次体 可通过受感染的节肢动物媒介叮咬传播给脊椎动物宿主。迄今为止，由于诊断方法有限、缺乏标准化且无法普遍获取，新发或再发的流行性立克次体病仍对公共卫生构成威胁。因未能识别相关体征和症状而导致的误诊，可能延误抗生素治疗并造成不良健康后果。对立克次体病的全面认识 立克次氏体 这些特征最终将有助于改进临床诊断、评估和治疗，从而更好地控制和预防该疾病。
立克次体基因的功能研究对于理解其在致病过程中的作用至关重要。本文描述了一种将穿梭载体pRAM18dSFA通过电穿孔法导入立克次体Tate's Hell株（Rickettsia parkeri）的操作流程，以及在蜱虫细胞培养物中利用抗生素（壮观霉素和链霉素）筛选转化后的R. parkeri的方法。此外，还介绍了一种利用共聚焦免疫荧光显微镜对转化后的R. parkeri在蜱虫细胞内的定位进行检测的技术，该技术可用于验证载体细胞系中的转化效果。类似的方法也适用于其他立克次体的转化研究。
引言
立克次体病由属于立克次体属的一系列专性细胞内细菌引起 立克次体 （立克次体科 Rickettsiaceae，立克次体目 Rickettsiales）。该属 立克次体 根据系统发育特征分为四个主要类群1,2：斑点热群（SFG），包含引起最严重且致命的蜱传立克次体病的立克次体（例如， Rickettsia rickettsii 落基山斑疹热的病原体），斑疹伤寒群（TG，例如， Rickettsia prowazekii，流行性斑疹伤寒的病原体），过渡组（TRG，例如， Rickettsia felis，蚤传斑点热的病原体）以及祖先群组（AG，例如 Rickettsia bellii).
立克次体病是已知最古老的虫媒疾病之一，主要通过受感染的节肢动物媒介（包括蜱、蚤、虱和螨）叮咬传播病原体而获得3,4。尽管有效抗生素的发现已改善了治疗效果，但新发和再发的流行性立克次体病仍在不断挑战传统的预防和控制策略。因此，全面了解立克次体与宿主及媒介之间的相互作用，将为开发防治这些古老疾病的新方法奠定坚实基础。
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方案
1. 从蜱细胞培养物中扩增与纯化R. parkeri
注意：所有细胞培养操作均须在II级生物安全柜中进行。
- 准备感染 R. parkeri 的蜱虫细胞
- 在 25 cm2 细胞培养瓶中，于 34 °C 条件下，使用 5 mL L15C300 培养基17培养 ISE6 细胞，培养基中添加 5% 胎牛血清（FBS）、5% 胰蛋白胨磷酸盐肉汤（TPB）和 0.1% 脂蛋白浓缩物（LPC）。
注：ISE6（Ixodes scapularis 胚胎来源的细胞系）是一种在多个实验室中广泛使用的蜱虫细胞系，因此是研究蜱虫-病原体相互作用的重要模型17,18,19。ISE6 细胞的生长速度较哺乳动物细胞慢，群体倍增时间 ≥72 小时。例如，以 1:5 比例传代的 100% 汇合度 ISE6 细胞需要 3 至 4 周才能重新达到 100% 汇合度。健康的 ISE6 细胞通常呈圆形，具有大量贴附的丝状突起17。 - 使用血细胞计数....
- 在 25 cm2 细胞培养瓶中，于 34 °C 条件下，使用 5 mL L15C300 培养基17培养 ISE6 细胞，培养基中添加 5% 胎牛血清（FBS）、5% 胰蛋白胨磷酸盐肉汤（TPB）和 0.1% 脂蛋白浓缩物（LPC）。
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结果
R. parkeri 经吉姆萨染色后，在光学显微镜下观察 ISE6 细胞中的形态如图1所示。图2显示了在 ISE6 细胞中表达红色荧光蛋白的转化型R. parkeri，采用共聚焦显微镜观察。转化型R. parkeri（红色）在 ISE6 细胞（蓝色，对应细胞核）中的感染率从（A）培养第7天到（B）第10天显著增加。
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讨论
本文演示了一种利用电穿孔法将穿梭质粒pRAM18dSFA上编码的外源DNA导入立克次体的方法。该实验流程包括：从宿主细胞中纯化出无细胞的立克次体，用立克次体穿梭载体对其进行转化，随后将其接种至蜱源细胞以建立感染。同时，本文还描述了一种共聚焦免疫荧光方法，用于检测在蜱源细胞中表达红色荧光蛋白的R. parkeri。类似的方法可适用于其他Rickettsia物种，经过进一步优化后，也可能适用于其他能够维持质粒的专性胞内细菌。
本方案中的成功转化需要三个组分：外源 DNA、 立克次体 种（复数）. 细菌，以及合适类型的宿主细胞22根据具体的研究目标，这些组分可以进行调整。首先，将外源DNA导入 通过 pRAM18dSFA 质粒，含有壮观霉素和链霉素筛选标记，并表达 mKATE（一种远红光荧光蛋白）。该质粒还可赋予氨苄青霉素抗性，用于在 大肠杆菌如先前研究所示，可以替换抗生素抗性标记和荧光蛋白基因13.......
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披露
未声明任何利益冲突。
致谢
感谢 Timothy J. Kurtti 和 Benjamin Cull 提供的深入讨论和建议。本研究得到了美国国立卫生研究院（NIH，项目编号：2R01AI049424）向 U.G.M. 提供的资助，以及明尼苏达农业实验站（Minnesota Agricultural Experiment Station，项目编号：MIN-17-078）向 U.G.M. 提供的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 0.1 cm 间隙基因脉冲电穿孔比色皿 | Bio-Rad | 1652083 | |
| 2 μm 孔径滤膜 | GE Healthcare Life Sciences Whatman | 6783-2520 | |
| 5 mL 鲁尔锁注射器 | BD | 309646 | |
| 60-90 碳化硅磨料 | LORTONE, inc | 591-056 | |
| 无水甲醇 | 菲舍尔科技公司 | A457-4 | |
| 胰蛋白胨磷酸盐肉汤培养基（Bacto tryptose phosphate broth） | BD | 260300 | |
| Cytospin 离心机 Cytospin4 | 赛默飞世尔科技 | A78300003 | 转子可拆卸，因此整个转子可放入生物安全柜中以加载感染性样品 |
| 内毒素去除型质粒大提试剂盒（10 次） | QIAGEN | 12362 | 用于提取无内毒素的 pRAM18dSFA 质粒 |
| 细长尖端移液管 | Perfector Scientific | TP03-5301 | |
| 胎牛血清 | Gemini Bio | 900-108 | 必须对胎牛血清批次进行测试，以确保 ISE6 细胞在其内生长良好 |
| Gene Pulser II 电穿孔仪配 Pulse Controller PLUS | Bio-Rad | 165-2105 & 165-2110 | |
| 血细胞计数板 | 赛默飞世尔科技 | 267110 | |
| HEPES | Millipore-Sigma | H4034 | |
| ImageJ Fiji | 美国国立卫生研究院 | 原始图像编辑 | |
| KaryoMAX 吉姆萨染色液 | 吉布科 | 2021-10-30 | |
| Leibovitz's L-15 培养基 | 吉布科 | 41300039 | |
| 脂蛋白浓缩物 | MP Biomedicals | 191476 | |
| Nikon Diaphot | Nikon | 落射荧光显微镜 | |
| NucBlue Live ReadyProbes 染色试剂 | 赛默飞世尔科技 | R37605 | |
| Olympus Disc Scanning Unit (DSU) 共聚焦显微镜 | Olympus | ||
| Petroff-Hausser 计数板 | Hausser Scientific | Chamber 3900 | |
| 碳酸氢钠 | Millipore-Sigma | S5761 | |
| 涡旋振荡器 | Fisher Vortex Genie 2 | 12-812 |
参考文献
- Gillespie, J. J., et al. Plasmids and rickettsial evolution: Insight from Rickettsia felis. PLoS One. 2 (3), 266(2007).
- Murray, G. G., Weinert, L. A., Rhule, E. L., Welch, J. J. The phylogeny of Rickettsia using different evolutiona....
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重印与许可
