一种通过表达荧光蛋白的穿梭载体在蜱细胞系中转化Rickettsia spp. 的电穿孔方法

摘要

电穿孔是一种快速且被广泛采用的方法，用于将外源DNA导入属内 立克次体. 本方案提供了一种有效的电穿孔方法，用于转化专性胞内寄生细菌属中的细菌 立克次体.

摘要

立克次体病由属于立克次体属的一系列专性细胞内细菌引起 立克次体 可通过受感染的节肢动物媒介叮咬传播给脊椎动物宿主。迄今为止，由于诊断方法有限、缺乏标准化且无法普遍获取，新发或再发的流行性立克次体病仍对公共卫生构成威胁。因未能识别相关体征和症状而导致的误诊，可能延误抗生素治疗并造成不良健康后果。对立克次体病的全面认识 立克次氏体 这些特征最终将有助于改进临床诊断、评估和治疗，从而更好地控制和预防该疾病。

立克次体基因的功能研究对于理解其在致病过程中的作用至关重要。本文描述了一种将穿梭载体pRAM18dSFA通过电穿孔法导入立克次体Tate's Hell株（Rickettsia parkeri）的操作流程，以及在蜱虫细胞培养物中利用抗生素（壮观霉素和链霉素）筛选转化后的R. parkeri的方法。此外，还介绍了一种利用共聚焦免疫荧光显微镜对转化后的R. parkeri在蜱虫细胞内的定位进行检测的技术，该技术可用于验证载体细胞系中的转化效果。类似的方法也适用于其他立克次体的转化研究。

引言

立克次体病由属于立克次体属的一系列专性细胞内细菌引起 立克次体 （立克次体科 Rickettsiaceae，立克次体目 Rickettsiales）。该属 立克次体 根据系统发育特征分为四个主要类群^1,2：斑点热群（SFG），包含引起最严重且致命的蜱传立克次体病的立克次体（例如， Rickettsia rickettsii 落基山斑疹热的病原体），斑疹伤寒群（TG，例如， Rickettsia prowazekii，流行性斑疹伤寒的病原体），过渡组（TRG，例如， Rickettsia felis，蚤传斑点热的病原体）以及祖先群组（AG，例如 Rickettsia bellii).

立克次体病是已知最古老的虫媒疾病之一，主要通过受感染的节肢动物媒介（包括蜱、蚤、虱和螨）叮咬传播病原体而获得^3,4。尽管有效抗生素的发现已改善了治疗效果，但新发和再发的流行性立克次体病仍在不断挑战传统的预防和控制策略。因此，全面了解立克次体与宿主及媒介之间的相互作用，将为开发防治这些古老疾病的新方法奠定坚实基础。

在自然界中，细菌的水平基因转移（HGT）通过接合、转导和转化实现⁵. 体外 细菌转化利用了这些水平基因转移（HGT）的概念，尽管立克次体的细胞内寄生特性带来了一定挑战。不同种类立克次体中有限的培养条件以及尚不明确的接合和转导系统，均使其遗传操作受到限制。 立克次体属物种的特性阻碍了接合和转导方法在立克次体中的应用^6,7,8. 与其他专性胞内细菌属（例如， 沙眼衣原体, Coxiella, 无形体属， 和 埃立克体属），属 立克次体 在细胞质内的生长和复制策略方面存在差异，由于立克次体独特的生活方式特征，这对立克次体的遗传改造带来了特定的挑战⁹.

克服立克次体遗传改造的首要障碍是实现成功的转化。因此，设计一种具有高转化效率的可行方案，对于开发立克次体的遗传操作工具具有重要意义。. 本文重点介绍电穿孔法，这是一种广泛应用的转化方法，已成功用于将外源DNA导入多种立克次体中，包括 Rickettsia prowazekii, Rickettsia typhi, Rickettsia conorii, Rickettsia parkeri, 立克次体 montanensis, Rickettsia bellii, Rickettsia peacockii，以及 Rickettsia buchneri^{10,11,12,13,14,15,16}.

本文描述了一种将穿梭载体 pRAM18dSFA 电穿孔转入 R. parkeri Tate's Hell 菌株（登录号：GCA_000965145.1）的方法。该载体源自立克次体 Rickettsia amblyommatis AaR/SC 菌株质粒 pRAM18，经改造后编码远红光荧光蛋白 mKATE 以及 aadA 基因，后者赋予菌体壮观霉素和链霉素抗性^13,15,20。转化后的 R. parkeri 在蜱虫细胞系中具有活性，并可在抗生素筛选条件下稳定维持。此外，我们还表明，通过共聚焦显微镜观察转化后的 R. parkeri 在活体蜱细胞中的定位，可用于评估载体细胞系的转化效率。

方案

1. 从蜱细胞培养物中扩增与纯化R. parkeri

注意：所有细胞培养操作均须在II级生物安全柜中进行。

1. 准备感染 R. parkeri 的蜱虫细胞
   1. 在 25 cm² 细胞培养瓶中，于 34 °C 条件下，使用 5 mL L15C300 培养基¹⁷培养 ISE6 细胞，培养基中添加 5% 胎牛血清（FBS）、5% 胰蛋白胨磷酸盐肉汤（TPB）和 0.1% 脂蛋白浓缩物（LPC）。
      注：ISE6（Ixodes scapularis 胚胎来源的细胞系）是一种在多个实验室中广泛使用的蜱虫细胞系，因此是研究蜱虫-病原体相互作用的重要模型^17,18,19。ISE6 细胞的生长速度较哺乳动物细胞慢，群体倍增时间 ≥72 小时。例如，以 1:5 比例传代的 100% 汇合度 ISE6 细胞需要 3 至 4 周才能重新达到 100% 汇合度。健康的 ISE6 细胞通常呈圆形，具有大量贴附的丝状突起¹⁷。
   2. 使用血细胞计数板在光学显微镜下对 ISE6 细胞进行计数。使用浓度约为 ~10⁶ 个细胞/mL（100% 汇合度）。
      1. 用培养基轻轻冲洗培养瓶中的细胞，并通过移液吹打使细胞分散，形成均匀的细胞悬液。取 20 µL 细胞悬液滴加于血细胞计数板与盖玻片之间，进行细胞计数。
   3. 将无宿主细胞的野生型 R. parkeri²⁰ （平均数量：5 × 10⁷–10 × 10⁷）加入 25 cm² 细胞培养瓶中的 ISE6 细胞培养物中。将感染的 R. parkeri 细胞培养物在 34 °C 下孵育，使用 5 mL 完全培养基（含 L15C300 培养基、10% FBS、5% TPB、0.1% LPC、0.25% 碳酸氢钠（NaHCO₃）和 25 mM HEPES），直至 90%–100% 的细胞被感染。
      注：R. parkeri 在 ISE6 细胞中的感染率通过吉姆萨染色确定，通常需要 5 至 7 天达到 90%–100% 的感染水平。
   4. 通过吉姆萨染色确定感染率。
      1. 在生物安全柜中，重悬感染的细胞培养物，并将 50 µL 悬液转移至 1.5 mL 微离心管中。
      2. 用完全培养基将悬液稀释（1:5 稀释），取 100 µL 加入载玻片，使用离心机以 113 × g 离心 5 分钟。为确保活的 R. parkeri 被有效封闭，应使用带有密封转子的离心机，该转子可从离心机中整体取出，以便在生物安全柜内外运输密封转子。
         注：由于 R. parkeri 在离心前仍具有活性，样本必须在立克次体被灭活前始终处于封闭状态。因此，用于将 R. parkeri 培养物离心至载玻片的离心机必须配备可整体取出的密封转子。将转子置于层流罩内，将样本装入漏斗-载玻片组件中，重新密封转子，再将其放回离心机。启动离心机后，样本即沉积于载玻片上。离心结束后，将密封转子从离心机中取出并放回层流罩内，在罩内打开转子盖，卸下载玻片组件。待载玻片干燥后，将其浸入无水甲醇中，以灭活所有病原体。漏斗和金属支架则浸入稀释的 DMQ 溶液中，以灭活 R. parkeri。
      3. 将载玻片自然晾干，并在室温（RT）下用无水甲醇固定 5 分钟。
      4. 在 37 °C 条件下，用吉姆萨染液（4% Sørenson 缓冲液，pH 6.6）染色 30 分钟，随后用水冲洗 5 秒。
      5. 通过光学显微镜确定感染百分比（每 100 个细胞中感染立克次体的细胞数）。
         注：图 1 显示了典型的吉姆萨染色结果。
2. 制备无细胞的 R. parkeri
   注：当培养物中 90%–100% 的细胞被感染时，应从 ISE6 细胞中分离立克次体，并进行电穿孔操作。
   1. 将无菌的 60–90 目碳化硅颗粒加入无菌的 2 mL 微离心管中，体积约为 0.2 mL。
   2. 从 100% 感染 R. parkeri 的培养物（步骤 1.1.3）中移除 2 mL 培养基，并将剩余 3 mL 培养基中的细胞重悬。
   3. 将该悬液等量转移至步骤 1.2.1 中准备好的各管中。
   4. 每管以高速涡旋 30 秒，随后置于冰上。通过重力作用使颗粒在数秒内自然沉降。
   5. 在 II 级生物安全柜中，准备一支无菌的 5 mL 鲁尔锁注射器，活塞已推出，并将其末端固定在用于 15 mL 离心管的聚苯乙烯底座上。
   6. 使用装有合适移液器的无菌 1 mL 防污染移液枪头，小心吸取涡旋后细胞裂解物的上清液，避免吸入任何颗粒。将枪头插入注射器接口，轻压将内容物排入注射器中。也可使用带橡胶球的无菌防污染 2 mL 巴斯德吸管代替。
   7. 将灭菌的 2 µm 孔径滤膜连接至注射器接口，将步骤 1.2.6 中的 R. parkeri 培养物过滤至无菌的 1.5 mL 管中。
   8. 在 4 °C 条件下以 13,600 × g 离心 5 分钟收集 R. parkeri，弃去上清液。
   9. 将沉淀用 1.2 mL 冰冷的 300 mM 蔗糖重悬，并在 4 °C 条件下以 13,600 × g 再次离心 5 分钟。重复重悬和离心过程，共进行两次蔗糖洗涤。
   10. 将 R. parkeri 沉淀合并至一个预冷的无菌 1.5 mL 微离心管中，每轮转化加入 50 µL 冰冷的 300 mM 蔗糖。由于一个 25 cm² 培养瓶的 R. parkeri 可满足两到三次转化所需，因此可加入 100–150 µL 的 300 mM 冷蔗糖。
       注：如有需要，可使用 Petroff-Hausser 计数室计算立克次体数量。当初始接种量为 5 × 10⁷–10 × 10⁷ 个无细胞 R. parkeri 时，通常需要 5–7 天达到 90%–100% 感染率，最终可获得约 5 × 10⁷–10 × 10¹⁰ 个无细胞 R. parkeri。
   11. 通过移液轻轻重悬沉淀，直至完全分散。将样本分装至预冷的无菌 1.5 mL 微离心管中，每管 50 µL。
       注：如有需要，可通过荧光染料染色后流式细胞术评估立克次体的活力²¹。

2. 使用 pRAM18dSFA 质粒转化 R. parkeri

1. 在冰上，向每个含有 50 µL R. parkeri 悬液的离心管中加入 3 µg 无内毒素的 pRAM18dSFA 质粒 DNA^13,15,20，并用移液枪头轻轻但充分地混匀。
   注意：制备质粒 DNA 时，应使用包含去内毒素步骤的纯化试剂盒，以获得无内毒素的质粒 DNA²³。我们发现，每 50 µL R. parkeri 悬液中使用 1 µg 至 3 µg 的质粒浓度范围均可实现成功转化，而将质粒用量增加至 10 µg 时会抑制转化效率。
2. 将上述 DNA 与 R. parkeri 的混合物转移至预冷的无菌 0.1 cm 电穿孔比色皿中（轻轻敲击比色皿使混合物均匀分布），并在冰上静置 10–30 分钟。
3. 移除 100% 汇合度 ISE6 细胞培养物中的培养基，并用 1.5 mL 含 NaHCO₃ 和 HEPES 缓冲液的新鲜培养基重悬细胞层（具体配制方法见步骤 1.1.3）。每个转化反应使用一 flask 汇合细胞。
4. 将重悬的细胞转移至无菌的 2 mL 微量离心管中（每 25 cm² ISE6 细胞 flask 使用一管）。
5. 使用电穿孔仪对 R. parkeri/pRAM18dSFA 混合物进行电穿孔，参数设置为 1.8 kV、200 欧姆、25 µF。
6. 使用无菌的细长尖端移液管，将少量 ISE6 细胞悬液（步骤 2.4）加入比色皿中，并轻柔地上下抽吸液体以清洗比色皿。将洗出液转移至含有剩余 ISE6 细胞悬液的 2 mL 微量离心管中，并轻柔混匀转化混合物与细胞。
7. 将转化后的样品在室温下以 700 × g 离心 2 分钟，随后将离心速度提高至 13,600 × g，继续在室温下离心 1 分钟。
   注意：两种离心速度分别促进立克次体与细胞的结合及进入：700 × g 用于沉淀 ISE6 细胞，而 13,600 × g 用于沉淀立克次体。
8. 让样品在室温或 34 °C 下静置 15 分钟至 1 小时。
9. 使用装有无菌 2 mL 防污染枪头的移液器，将转化后的细胞（两至三个样本）在 ISE6 细胞中重悬，并转移至两至三个含有 3.5 mL 含 NaHCO₃ 和 HEPES 缓冲液的新鲜培养基的 25 cm² 细胞培养 flask 中。也可使用带橡胶球的无菌防污染 2 mL 巴斯德吸管操作。
10. 轻轻摇动 flask 使混合物均匀分布，随后在 34 °C 下孵育。
11. 16–24 小时后，向步骤 2.10 中的每个 flask 加入 10 µL 链霉素（50 mg/mL）和 10 µL 斯佩耳丁霉素（50 mg/mL）。

3. 转化后R. parkeri的观察

注意：使用配备罗丹明/TRITC滤光片的落射荧光显微镜观察步骤2.11中制备的培养瓶，观察时间在3至7天后。当培养物中出现明显蚀斑（5至14天）时，可观察到表达红色荧光蛋白mKATE的转化型R. parkeri，该蛋白由pRAM18dSFA质粒编码。

1. 共聚焦显微镜
   1. 重悬步骤 2.11 中的细胞培养物，取 100 µL 细胞培养物与 5 µL Hoechst 33342 溶液混合，在室温避光条件下孵育 10–30 分钟。
      注意：Hoechst 33342 是一种可穿透细胞膜的细胞核复染剂，可结合活蜱细胞的 DNA 并发出蓝色荧光。
   2. 取 50 µL 混合液，使用离心机以 5 × g 离心 3 分钟，将细胞沉淀至载玻片上。
   3. 在载玻片上的细胞区域加入 3 µL 1× PBS，盖上盖玻片，使用共聚焦显微镜（60 倍物镜）观察。荧光成像时采用以下激发和发射参数：4′,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）的激发波长为 350 nm，发射波长为 470 nm；四甲基罗丹明（TRITC）的激发波长为 557 nm，发射波长为 576 nm。

结果

R. parkeri 经吉姆萨染色后，在光学显微镜下观察 ISE6 细胞中的形态如图1所示。图2显示了在 ISE6 细胞中表达红色荧光蛋白的转化型R. parkeri的共聚焦显微镜图像。转化型R. parkeri（红色）在 ISE6 细胞（蓝色，对应细胞核）中的感染率从（A）培养第7天到（B）第10天显著增加。

讨论

本文演示了一种利用电穿孔法将穿梭质粒pRAM18dSFA上编码的外源DNA导入立克次体的方法。该实验流程包括：从宿主细胞中纯化出无细胞的立克次体，用立克次体穿梭载体对其进行转化，随后将其接种至蜱源细胞以建立感染。同时，本文还描述了一种共聚焦免疫荧光方法，用于检测在蜱源细胞中表达红色荧光蛋白的R. parkeri。类似的方法可适用于其他Rickettsia物种，经过进一步优化后，也可能适用于其他能够维持质粒的专性胞内细菌。

本方案中的成功转化需要三个组分：外源 DNA、 立克次体 种（复数）. 细菌，以及合适类型的宿主细胞²²根据具体的研究目标，这些组分可以进行调整。首先，将外源DNA导入 通过 pRAM18dSFA 质粒，含有壮观霉素和链霉素筛选标记，并表达 mKATE（一种远红光荧光蛋白）。该质粒还可赋予氨苄青霉素抗性，用于在 大肠杆菌如先前研究所示，可以替换抗生素抗性标记和荧光蛋白基因^13...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.1 cm 间隙基因脉冲电穿孔比色皿	Bio-Rad	1652083
2 μm 孔径滤膜	GE Healthcare Life Sciences Whatman	6783-2520
5 mL 鲁尔锁注射器	BD	309646
60-90 碳化硅磨料	LORTONE, inc	591-056
无水甲醇	菲舍尔科技公司	A457-4
胰蛋白胨磷酸盐肉汤培养基（Bacto tryptose phosphate broth）	BD	260300
Cytospin 离心机 Cytospin4	赛默飞世尔科技	A78300003	转子可拆卸，因此整个转子可放入生物安全柜中以加载感染性样品
内毒素去除型质粒大提试剂盒（10 次）	QIAGEN	12362	用于提取无内毒素的 pRAM18dSFA 质粒
细长尖端移液管	Perfector Scientific	TP03-5301
胎牛血清	Gemini Bio	900-108	必须对胎牛血清批次进行测试，以确保 ISE6 细胞在其内生长良好
Gene Pulser II 电穿孔仪配 Pulse Controller PLUS	Bio-Rad	165-2105 & 165-2110
血细胞计数板	赛默飞世尔科技	267110
HEPES	Millipore-Sigma	H4034
ImageJ Fiji	美国国立卫生研究院		原始图像编辑
KaryoMAX 吉姆萨染色液	吉布科	2021-10-30
Leibovitz's L-15 培养基	吉布科	41300039
脂蛋白浓缩物	MP Biomedicals	191476
Nikon Diaphot	Nikon		落射荧光显微镜
NucBlue Live ReadyProbes 染色试剂	赛默飞世尔科技	R37605
Olympus Disc Scanning Unit (DSU) 共聚焦显微镜	Olympus
Petroff-Hausser 计数板	Hausser Scientific	Chamber 3900
碳酸氢钠	Millipore-Sigma	S5761
涡旋振荡器	Fisher Vortex Genie 2	12-812