在水凝胶中培养、冷冻、处理和成像整个类器官和球状体

细胞研究和治疗的未来在于3D^{细胞培养1}，^2，3。类器官和球状体模型通过创建更好的模型来模仿人体发育、生理学和疾病，缩小体外实验和动物模型之间的差距⁴，⁵，⁶，⁷，^8，9。然而，这些模型的可重复性和可重复性仍然具有挑战性。此外，使用当前技术处理、收获、转移和离心这些结构会导致类器官和球体在许多情况下丢失或损坏，从而显着影响结果。

尽管有许多用于组织学染色、免疫组织化学染色、免疫荧光标记和冷冻保存的方案，但没有通用的方法可用于标准化实验条件、处理和处理这些脆弱的结构而不会丢失或损坏它们。目前的方案也非常长，从几天到几周不等，包括各种试剂^10，11，¹²，^13，14的复杂程序。此外，在细胞培养容器和冷冻管之间收获、移液、离心和转移 3D 生长结构会导致结构定位和机械力发生变化，并最终影响类器官和球状体的分化和成熟。据报道，组织拓扑结构、细胞定位和机械力显着影响细胞分化和成熟⁶，¹⁵，^16，17。

因此，需要改进现有的常规技术，以生成质量稳定的类器官和球状体。跳过上述离心和其他步骤并在多个过程的开始到结束的单一安全环境中提供材料的方法/设备将有利于获得最一致和可靠的数据。此外，这将减少时间、劳动力和成本限制。

此处描述的多用途器件（MD）为类器官和球状体的多个过程提供了单一的安全环境（补充图 1）。该设备和补充方案消除了收获、移液、转移和离心步骤。类器官和球状体在顺序过程中保持体 外 环境。这种环境主要包括天然或合成的细胞外基质成分，如市售水凝胶。换句话说，这里描述的方法允许在水凝胶滴中处理、检查和冷冻类器官/球状体的全安装样品。

生物相容性装置可耐受60°C至-160°C之间的温度，这使得在-160°C的液氮罐中恢复类器官/类固醇或在60°C下制备用于电子显微镜的树脂块是可行的。 该设备中的壁龛旨在为3D生长结构定义有限的空间，并根据先前的研究¹⁸，^19，20，21，^22，23刺激球状体或类器官的形成。设备的这一部分是透明的，并包含一种特殊的塑料，可提供高光学质量（折射率:1.43;阿贝值:58;厚度:7.8密耳[0.0078英寸或198微米]）。壁龛和周围的"侧面"部分都会引起自发荧光。中间的透明壁龛具有 80 mm 2 区域，而侧面为 600 mm²。容器的深度为15毫米，厚度为1.5毫米。除了设备的尺寸和设计外，这些功能还可以在不同类型的高科技显微镜下进行观察，并为电子显微镜检查准备样品（图2）。设备的关闭系统提供两个位置，一个密封在冰箱中，另一个允许气体在培养箱中流动。与传统的细胞培养皿相比，CCK8增殖和细胞毒性测定对细胞的影响相似（补充图2）。台盼蓝排除试验在MD细胞培养过程中显示出高细胞活力（94%）（图3）。

可以在单个设备中对一个样品执行的过程包括（1）培养，（2）组织学染色，（3）免疫染色，包括免疫组织化学和免疫荧光标记，（4）冷冻，（5）解冻，（6）在光学显微镜下检查，例如明场，暗场，荧光，共聚焦和超分辨率显微镜，（7）直接在扫描电子显微镜下涂覆和检查，或（8）准备透射电子显微镜（图2）。

存在用于组织学染色、免疫组织化学标记或荧光标记类器官和球状体¹⁰、¹¹、^12、13、¹⁴、^24、25 的不同方法。从水凝胶中收获它们是当前技术的第一步，也是主要步骤。在此步骤之后，一些方法允许整体安装免疫标记。收获的类器官嵌入石蜡中，切片，并标记用于其他类器官的染色和免疫染色。但是，这些部分可能不会显示整个示例，并且仅提供与结构的 3D 架构相关的有限数据。此外，对这些3D结构的破坏和抗原性的丧失是这些技术众所周知的副作用。

本文中用于显微镜检查的补充新方案允许分析仍在水凝胶中的整个安装样品。这里描述的方案包括两种新开发的配方:免疫组织化学溶液（S-IHC）和免疫荧光标记溶液（S-IF）。这些解决方案的方法使研究人员能够获得更准确的数据，因为传统工作流程没有有害影响，例如离心、移液和转移精细结构。这里描述的方案还消除了收获，阻断，清除和抗原修复步骤的需要，并将整个过程缩短至6-8小时。此外，该方法允许同时向同一S-IF添加一到三种抗体。因此，即使在多次标记实验之后，也可以在同一天获得结果，这是此处描述的协议的另一个优点;传统的全接口免疫荧光标记方案通常需要3天到数周¹⁰，¹¹，¹²，^13，14。

石蜡包埋是另一个降低抗原性的有害步骤，也被省略了。3D结构从显微镜检查的开始到结束都保持在体外环境中。由于3D结构仍处于其生长状态，因此蛋白质表达和定位数据更好地模拟体内条件。由于该方法消除了影响样品抗原表达的步骤，因此预计结果会更准确。表1和表2展示了与传统工作流程相比，这些新方案如何消除步骤，节省实验室时间和劳动力，并降低成本和浪费产品。

除了上述关键步骤外，另一个问题是提供一种冷冻保存介质和方法，以保存具有更高细胞活力率的样品的3D结构²⁶，²⁷，²⁸，²⁹，^30，31。冷冻保存对于创建稳定的模型系统和实现类器官和球状体的生物样本库至关重要^32，33。生物样本库 整个原始3D结构将允许更忠实地概括健康或疾病的自然状态。关键考虑因素是冷冻保存和类器官/球状体解冻的便利性和可靠性。 在大多数当前技术中，解冻后类器官回收率非常低，通常低于50%。然而，最近的研究表明，存活率提高的结果很有希望²⁶，²⁷，^28，29。Lee等人证明，当他们使用含有15%DMSO 28的威斯康星大学溶液时，⁷⁸%的球状体细胞在冷冻保存后存活。在Arai等人的研究中，细胞存活率增加到83%²⁹。然而，由于3D结构无法保持相同的特性和质量，冷冻保存后的结果会受到显着影响。此外，制药和诊断环境中的良好生产规范需要无血清试剂。 传统的工作流程使用含有胎牛血清（FBS）和二甲基亚砜（DMSO）的培养基进行慢冻方法，这两者都与障碍有关。FBS是一种动物源性产品，可以有批次变化。DMSO是一种非常成功的冷冻保护剂，但长期暴露，特别是在解冻期间，可能会导致细胞毒性作用^30，31。

本文还介绍了整个类器官或球体在水凝胶中的冷冻/解冻方法。该研究使用了两种用于冷冻类器官和球状体的公式:（1）含有传统冷冻溶液（FS）的10%DMSO和（2）不含血清和DMSO的冷冻保存培养基。这种冷冻保存培养基含有细胞外基质成分，与目前的配方不同。细胞外基质包括两大类大分子，蛋白聚糖和纤维蛋白，它们对于细胞成分的物理支架至关重要，但也启动组织形态发生、分化和体内平衡所需的过程³⁴，35，³⁶，^37，38，^39，40.胶原蛋白提供拉伸强度，调节细胞粘附，支持趋化性和迁移性，并指导组织发育³⁷。此外，弹性蛋白纤维为经历重复拉伸的组织提供反冲³⁸。第三种纤维蛋白纤连蛋白指导间质细胞外基质的组织，在介导细胞附着中起着至关重要的作用，并起到细胞外机械调节剂的作用³⁹。Du等人已经证明了鸡胶原蛋白水解物对天然肌动球蛋白模型系统的冷冻保护作用⁴¹。他们的结果表明，胶原蛋白水解物可以抑制冰晶生长，减少蛋白质冻变性和氧化，类似于商业冷冻保护剂，并在冻融循环后提供更好的凝胶结构。 因此，在冷冻保存培养基中添加细胞外基质成分为样品提供了更安全和保护性的环境，并支持活结构在冻融后愈合。

此外，本研究描述了一种简单的方案，当活类器官和球状体仍在水凝胶中时，标记它们的细胞质膜和细胞核。

1. 培养类器官和球状体

1. 将水凝胶放在冰上过夜（在冰箱或冷藏室中）解冻。
2. 在实验前1天将市售的多用途装置（MD;参见 材料表）放入培养箱中（37°C，5%CO₂）加热。
3. 将无菌宽端移液器吸头放入4°C的冰箱中。
   注意:步骤 1.1-1.3 将在第 0 天执行，步骤 1.4-1.11 将在第 1 天执行。
4. 将水凝胶放在层流罩中的冰上15分钟。
   1. 可选:根据制造商的建议在冷细胞培养基中稀释水凝胶。
5. 将含有HepG2细胞沉淀（商业获得的肝细胞癌细胞系;见 材料表）的试管放在冰上。
6. 将 30-35 μL 100% 水凝胶板在预热装置的壁龛内以产生凝胶滴。
7. 将10，000个HepG2细胞放在每个水凝胶滴的顶部中间（图2），并在37°C下孵育15分钟。
8. 用 200 μL Dulbecco 的改良鹰培养基 （DMEM） 和 10% 胎牛血清覆盖水凝胶液滴。
9. 将MD的盖子盖在正确的位置以允许气体流动，然后将设备放入培养箱中。
10. 每隔一天用 200 μL 含有 10% FBS 的 DMEM 喂养细胞。
11. 在倒置显微镜下检查微球的生长（图3）。球体形成在第^3天后 开始。 视频 1 显示了水凝胶圆顶中不同水平的球体位置。
    注意:强烈建议轻轻吸出水凝胶周围的液体，然后将新液体缓慢添加到环境中，以防止损坏水凝胶滴。

2. 水凝胶中全安装类器官/球体的苏木精和曙红染色

1. 加热固定剂（4%多聚甲醛;PFA），PBS和苏木精（见 材料表）至37°C。
2. 用移液管吸出水凝胶液滴周围的培养基，加入100-200μL4%PFA固定，并在37°C孵育15-20分钟。
3. 吸出 4% PFA 并加入 200 μL PBS 在 37 °C 下洗涤 3 次，每次 5 分钟。 然后，吸出PBS并与200μL苏木精溶液在37°C孵育15-20分钟。
4. 吸出苏木精并加入200μLdH₂O，在37°C下洗涤3次，每次10分钟。 吸出dH₂O，并在37°C下与200μL乙醇孵育5-10分钟。
5. 吸出乙醇并与200μL曙红（参见 材料表）在37°C孵育10分钟。 吸出曙红并加入 200 μL dH₂O 在室温 （RT） 下洗涤 5 分钟。
6. 吸出dH₂O并加入100μL甘油以覆盖水凝胶滴作为封片剂。
7. 可选:用盖玻片安装壁龛。可以省略此步骤，以避免挤压相当大的类器官/球体。
8. 用力盖上MD的盖子，以免干燥，直到检查。样本可稳定检查至少 6 个月。

3. 水凝胶中全安装类器官/球状体的免疫组织化学

1. 将商业获得的免疫组织化学溶液（S-IHC;见 材料表）加热至37°C。
2. 将水凝胶中的类器官或球体与3%过氧化氢（H₂O 2）在200μLdH₂ O中在37°C孵育5分钟。
3. 吸出过氧化氢溶液并在37°C下在dH₂O中洗涤5分钟。 吸出dH₂O，并在37°C下用100μLS-IHC孵育两次，每次孵育10分钟。
4. 吸出S-IHC并与在S-IHC中稀释的100μL一抗（参见 材料表）在37°C孵育1-2小时（遵循制造商关于工作稀释的建议）。
5. 吸出一抗溶液，并在37°C下与100μLS-IHC 3x孵育5分钟。
6. 吸出100μLS-IHC并与生物素化的二抗（参见 材料表）在37°C孵育10分钟。
7. 吸出二抗溶液，并在37°C下与100μLS-IHC 3x孵育5分钟。 吸出S-IHC并与100μL辣根过氧化物酶（HRP）标记的链霉亲和素（参见 材料表）在37°C孵育10分钟。
8. 吸出HRP标记的链霉亲和素，并在37°C下与100μLS-IHC 3x孵育5分钟。
9. 吸出S-IHC并与100μLDAB / AEC色原溶液混合物（参见 材料表）在37°C孵育5-10分钟。
10. 在光学显微镜下监测染色强度。
11. 用dH₂O 3x洗涤2分钟。
12. 可选:用100μL苏木精（参见 材料表）在37°C下孵育5分钟。
13. 吸出苏木精并在dH₂O中洗涤5分钟。
14. 吸出dH₂O，并用100μL甘油作为封片剂覆盖水凝胶液滴。
15. 用力关闭MD的盖子，直到显微镜检查。
    注意:由于S-IHC消除了这些步骤，因此本协议省略了抗原修复和蛋白质阻断步骤。

4. 水凝胶中全安装类器官/球状体的免疫荧光标记

1. 将以下材料加热至37°C:4%PFA，PBS，S-IF，S-IF中的一抗溶液，S-IF中的二抗溶液，核染色剂和甘油（见 材料表）。
2. 吸出细胞培养基，并在37°C下用200μL的4%PFA固定15-30分钟。 吸出固定剂并在37°C下在S-IF中洗涤3x，每次10分钟。
3. 在以下步骤中将dH₂O添加到壁龛周围的一侧以提供湿度。
4. 吸出水凝胶液滴周围的S-IF，并将水凝胶液滴与100μL一抗溶液（参见 材料表）在S-IF中孵育30-60分钟，温度为37°C。
5. 吸出一抗溶液并在37°C下在S-IF中洗涤3x10分钟。
6. 吸出S-IF并在S-IF中与100μL二抗溶液（参见 材料表）在37°C黑暗中孵育30-60分钟。
7. 吸出二抗溶液，并在37°C下在黑暗中用PBS 3x洗涤10分钟。
8. 吸出PBS，并在37°C下在黑暗中与100μL含有封片剂或甘油的核DNA染色剂一起孵育。
9. 用甘油填充壁龛以避免干燥。
10. 可选:用盖玻片盖住壁龛。可以省略此步骤以避免挤压类器官/球体。
11. 紧紧关闭 MD。MD中的样品可以在4°C的黑暗中储存至少6个月，荧光损失最小。
12. 使用以下设置进行共聚焦显微镜检查:将所有通道的针孔值设置为 20.1，对于 488 nm，将增益主控保持在 550，对于 550 nm，对于 550 nm，保持 450（对于 594 nm），保持所有实验的激光功率恒定，最低百分比为 2.0。
    注:一抗:抗Na-K ATP酶（1:100），抗精氨酸酶（1:50），抗白蛋白（1:50），抗β-半乳糖苷酶（1:25），抗线粒体抗体（1:100），抗高尔基体抗体（1:50），抗细胞角蛋白5（1:100），Ov6抗体（1:100）。二抗:山羊抗兔IgG（H+L）-488，山羊抗兔IgG（H+L）-550，山羊抗小鼠IgG（H+L）-488，山羊抗小鼠IgG（H+L）-550，山羊抗鸡IgY（H+L）-647。所有二抗的稀释度为1:100。此外，还使用偶联抗体FITC-鬼笔环肽（1:100）（见 材料表）。

5. 水凝胶中活类器官和球状体的质膜和细胞核标记

1. 根据制造商的建议（见 材料表），在Hank的平衡盐溶液（HBSS）中制备含有Alexa氟小麦胚芽凝集素（5.0μg/ mL）和Hoechst（2μM）的标记溶液，并升温至37°C。
2. 吸出细胞培养基并加入 100 μL 标记溶液以覆盖水凝胶液滴。在37°C孵育15-30分钟。
3. 除去标记溶液，并在PBS 2x中在37°C下洗涤两次，每次10分钟。 可选:用 200 μL 4% 甲醛在 37 °C 下固定 15 分钟。
4. 用甘油作为封片剂覆盖水凝胶滴。可选:用盖玻片安装壁龛。
5. 紧紧盖上MD的盖子，并在黑暗中冷藏，直到荧光/共聚焦显微镜检查。它至少稳定6个月。

6. 在水凝胶中冷冻和解冻整个安装类器官/球体

1. 按照以下步骤冷冻类器官。
   1. 将商业获得的冷冻溶液（FS;见 材料表）加热至37°C。
   2. 轻轻吸出水凝胶圆顶周围的细胞培养基。
   3. 轻轻加入 200 μL FS。将样品与FS在37°C孵育1小时。
   4. 盖紧设备盖子并将其放入泡沫盒中。将此泡沫盒放入另一个泡沫盒中，如 补充图3所示。紧紧关闭两个泡沫盒。彼此内部的两个泡沫盒在-20°C冰箱中提供1至2°C / min样品的温度冷却梯度范围。
   5. 将盒子在-20°C放置2小时。将盒子转移到-80°C冰箱中并放置过夜。
   6. 从盒子里拿出样品。MD中的样品可以在-80°C冰箱中保存6个月。
   7. 将含有样品的MD转移到液氮罐中进行长期储存。
2. 按照以下步骤解冻类器官。
   1. 从冷冻室/氮气罐中取出含有样品的MD，并将其直接放入37°C的培养箱中。 在37°C孵育1小时。
   2. 向壁龛中加入200μL温热的培养基（FS与细胞培养基的比例为1:1），并在37°C下孵育30分钟。
   3. 向壁龛中加入更多温热的培养基（FS与细胞培养基的比例为1:2），并在37°C下孵育30分钟。
   4. 轻轻吸出培养基和FS混合物。继续对水凝胶中的全安装类器官/球体进行扫描电子显微镜（步骤7）和透射电子显微镜（步骤8）成像。

7. 全安装类器官/球状体的扫描电子显微镜

1. 将Karnovsky的固定剂和固定后溶液（见 材料表）预热至室温（RT）。
2. 吸出MD中水凝胶周围的细胞培养基。将样品置于MD中的层流罩中的冰上15分钟。
3. 非常轻柔地吸出类器官/球状体周围的液化水凝胶。有限量的基质胶可以留在壁龛中，以避免损坏和丢失样品。
4. 用Karnovsky的固定剂（2%PFA，2.5%戊二醛在0.15M二甲胂酸盐缓冲液中和2mM CaCl₂;参见 材料表）在室温下固定1小时。
5. 轻轻吸出固定剂，用蒸馏水（dH₂O）洗涤3次，每次15分钟。
6. 轻轻吸出dH₂O，并在室温下用固定后溶液（1%四氧化锇水溶液[OsO₄];参见 材料表）固定1小时。
7. 轻轻吸出固定后，用蒸馏水（dH₂O）洗涤3次，每次15分钟。
8. 在分级系列乙醇（30%，50%，70%，80%，90%，96%，100%），乙醇/丙酮（1:1;1:2）和无水丙酮的混合物中脱水，每次15分钟。
9. 用临界点干燥机干燥。
10. 使用溅射镀膜机（见 材料表）在装置中用 6 nm 金/钯涂覆试样 90 秒。
11. 在真空模式（5 x 10-6 mA）下，使用镜头内二次电子检测器在^2-3 kV的扫描电子显微镜下观察。以 8.1-8.2 mm 的工作距离和 675x、1050x 和 1570x 放大倍率拍摄图像。
    注意:所有步骤都在MD中执行。每一步使用 200-250 μL 溶液。

8. 水凝胶中全安装类器官/球体的透射电子显微镜

1. 将卡尔诺夫斯基的固定剂加热至37°C。 吸出MD中水凝胶周围的细胞培养基。
2. 用Karnovsky的固定剂在室温下固定样品1小时。用dH₂O 3x洗涤每个15分钟。
3. 用2%水性_{OsO 4}和2.5%亚铁氰化钾在室温下固定45分钟。用dH₂O 3x洗涤每次10分钟。
4. 在室温下在0.5%硫代碳酰肼（TCH;参见 材料表）中孵育30分钟。用dH₂O 3x洗涤每次10分钟。
5. 在室温下在2%水性_{OsO 4}中孵育30分钟。用dH₂O 3x洗涤每次10分钟。
6. 在室温下在2%乙酸铀酰溶液（参见 材料表）中孵育1小时。
   注意:在此步骤中，球体可以在4°C下保持过夜。
7. 在60°C下在天冬氨酸铅溶液（参见 材料表）中孵育45分钟。用dH₂O 3x洗涤每次10分钟。
8. 在一系列分级乙醇（50%，70%，90%，100%[x2]）和无水丙酮中脱水，每次15分钟。
9. 用（1:1;1:2）丙酮/Epo树脂和纯Epo树脂（见 材料表）的混合物在室温下处理2小时。
10. 将树脂在60°C聚合过夜（至少16小时）。聚合后，从MD中取出树脂块，如 补充图4所示。
11. 用树脂胶将树脂块连接到较大的树脂块上。修剪块并到达类器官或球体的位置。
12. 使用超薄切片机获得半薄（1，000 nm）和超薄切片（60 nm）（参见 材料表）。
13. 将超薄切片放在 100 目铜网格上，并在带有 STEM 检测器的扫描电子显微镜下以 30 kV 的加速电压进行观察。以 44 mm 的工作距离和 2580x、5020x 和 6060x 放大倍率拍摄图像。
    注意:每一步使用 200-250 μL 溶液。步骤 8.1-8.10 在 MD 中执行。

本文代表了一种多用途装置（MD）和补充方法，用于培养，冷冻，解冻，组织学染色，免疫组织化学染色，免疫荧光标记，包被和处理整个类器官或球状体，同时仍然在单一的独特设计环境中的水凝胶中。目前的研究旨在制备35个MD中的35水凝胶滴剂中的HepG2肝癌球状体。 实验一式三份进行以确保准确性。此外，MD中的肺类器官被免疫荧光标记作为一个例子，以证明当前类器官研究方法的结果。

图1 显示了包含水凝胶圆顶的器件的仔细观察。壁龛的大小和形状旨在为含有类器官/球状体的水凝胶提供保护环境，并保存各种过程中使用的试剂。此外，在免疫染色实验期间，围绕壁龛的装置侧面可用作湿度室。进料样品的培养基可能在 100-200 μL 之间变化，具体取决于水凝胶液滴的高度。目前的研究侧重于基于圆顶的方法，因为许多水凝胶，商业细胞外基质成分和基底膜提取物允许用户制备滴剂。然而，也可以用水凝胶填充MD的生态位，然后接种其中的细胞以产生类器官/球状体。如果基质的粘度不允许制备圆顶，或者如果实验包括大量类器官，则可能首选该方法。用于制备滴剂的水凝胶类型和水凝胶/培养基比例可能因细胞类型、实验设计和培养基而异。 图1 还代表了该设备的设计，可以在明场、共聚焦和扫描电子显微镜下研究类器官/微球，而类器官/微球仍处于其天然 体外 环境中。

图2 显示了如何在水凝胶中接种细胞并检查球状体或类器官的发育。该图中还显示了多用途设备的设计和尺寸。 视频 1 演示了 3D 生长球体在水凝胶中的位置。 图 3 表示从第 3 天到第 21 天生长的球体的实时图像。球状体和类器官的形成时间可能因样品的性质而异。例如，来自HepG2细胞和HEK细胞的球状体在3天内形成，而肝脏和胆道类器官的形成在实验期间持续2周。

苏木精和伊红染色的球体如图 4所示。该图像表示保存完好且染色均匀的球体，具有不同大小和球体融合。球状体中心的活细胞值得注意。该图像还展示了来自不同球状体的细胞之间的微妙连接。在传统工作流程之后，这些脆弱的连接无法可视化，因为转移、移液或离心会损坏它们。 图5 显示使用精氨酸酶特异性抗体对球状体进行免疫染色，精氨酸酶是肝细胞癌诊断和预后的最常见标志物之一42，43。显微照片显示同一球状体中分化和未分化的肝癌细胞。该图包含使用和不使用苏木精复染的图像。研究人员可能会选择在难以区分3D结构中的标记区域的情况下省略苏木精复染。

图6 代表了另一种简单的方案，用于水凝胶中活类器官/微球的整体安装可视化:活细胞膜和细胞核染色。该方法允许在外围和中心具有相同的标记密度，显示出完全的试剂渗透。 图7、图 8和 图9 分别显示了用一种、两种或三种抗体标记的微球的代表性图像。在S-IF中同时稀释一到三种一抗。同样，在S-IF中同时稀释一到三个适合实验的匹配二抗。免疫标记方案允许研究人员在4-6小时内标记3D结构，而不会丢失或损坏它们。背景是透明的，这里使用的技术不需要额外的清除、抗原修复或封闭方法/溶液。该方法还允许研究人员在一个步骤中用多种抗体标记标本。换句话说，用户制备一种含有一到三种一抗的溶液和另一种与一到三种二抗匹配的溶液。此处描述的方案消除了传统方法中不同抗体的顺序标记步骤。

图10 表示微球的扫描和透射电子显微镜图像。第一行在扫描电子显微镜下展示了MD中整个球体的图片。第二行包含制备MD中含有全安装球体的树脂块后球体的透射电子显微镜图像，以及切片和染色球体的图像。保存完好的细胞质细胞器和其他细胞的超微结构特征证明了这种简单方案的有效性，该方案可以保护整个样品的3D结构。MD还允许研究人员在水凝胶中冷冻和解冻整个安装样品。 图11 在冷冻前后以更高的放大倍率展示水凝胶圆顶和球体。水凝胶圆顶边界的不规则性值得注意。然而，与冷冻前的球体相比，冷冻保存的球体在解冻后几乎稳定。解冻后48小时还应用活细胞膜和细胞核标记方法，以证明冷冻/解冻过程如何影响3D结构，细胞膜和细胞活力。含有二甲基亚砜的传统冷冻溶液和目前新配制的溶液SF显示出相似的结果。超过75%的3D结构可以在该协议中存活。然而，需要进一步的实验来揭示每种配方对类器官和球状体的长期副作用。

表1和表2根据步骤数、持续时间和废物产生量（即每个工作流程的塑料手套、移液器吸头、血清移液器、离心管、微量离心管、细胞培养容器、冷冻管等）将传统工作流程与此处描述的工作流程进行了比较。

补充图 1 表示可以在单个MD中以示意图方式执行的顺序步骤。 补充图 2 展示了旨在比较MD或传统玻璃底培养皿中HepG2细胞的细胞活力，毒性和增殖速率的实验结果。 补充图 3 显示了用于冷冻MD中样品的泡沫盒。 补充图 4 总结了从MD中取出树脂块的步骤。 补充图 5 包括气道类器官的图像，这些类器官被免疫荧光标记，然后在它们仍在MD中时可视化。同样， 视频 2 展示了 MD 中的两种免疫荧光标记的气道类器官。最后， 补充图 6 是使用传统工作流程和此处描述的工作流程比较冷冻前后活球状体中细胞膜标记强度的平均强度的图表。图像J软件已用于分析。

图 1:多用途细胞培养设备 （MD）。 （A）壁龛（N）是装置的中心部分，旨在为在连续过程中在水凝胶液滴（D）中生长的类器官/球体创造保护环境。侧（S），壁龛的周围部分，可在免疫染色实验期间用作加湿器室。（B）盖子上的透明中心允许用户在关闭设备时观察类器官/球体。（C）MD中含有类器官的水凝胶圆顶可以染色或嵌入树脂块中以进行透射电子显微镜。盖子还包括用于悬挂液滴方法的壁龛（N）。该设备的尺寸和设计允许用户在（D）明场，（E）共聚焦和（F）扫描电子显微镜下检查类器官/微球。请点击此处查看此图的大图。

图2:在水凝胶内接种细胞。（A）将移液器中的细胞沉淀插入圆顶顶部。3-5天后，球体在圆顶中变得可见，特别是在液滴的外围。（B）捕获并合并了圆顶中每个季度生长的球体的四个实时图像。比例尺 = 200 μm。 （C）多用途装置（MD）的设计和尺寸（以厘米为单位）。 请点击此处查看此图的大图。

图 3:从第 3 天到第 21 天在水凝胶滴剂中形成球状体 。比例尺 = 200 μm。 请点击此处查看此图的大图。

图 4:MD 内的苏木精和伊红染色的全安装球体。位于相邻或融合球体中的细胞之间连接的可视化。细胞之间的微妙过程（箭头）是可见的，因为水凝胶中的整个安装样品被固定、染色和检查，而不会损坏 3D 生长结构。比例尺:第 3 天、第 9 天 = 50 μm;第 7 天，第 17 天 = 20 μm。 请点击此处查看此图的大图。

图 5:MD 内水凝胶中全安装球体的免疫组织化学染色。样品用精氨酸酶特异性抗体进行免疫染色。精氨酸酶阳性（红色箭头）和阴性（黑色箭头）细胞可见于微球中。 图像来自两个实验:（A-C）没有和（D-F）用苏木精复染。比例尺 = 20 μm。 请点击此处查看此图的大图。

图6:水凝胶中活类器官的共聚焦图像。用活细胞膜（WGA）和细胞核染色剂（Hoechst）标记活类器官。比例尺 = 20 μm。 请点击此处查看此图的大图。

图 7:具有一种抗体和核染色剂 （Hoechst） 的水凝胶中全膜微球的免疫荧光标记。（A-C）上图显示了一个球状体，该球体标记有细胞膜中Na-K ATP酶特异性抗体。（D-F）下图显示了另一种精氨酸酶特异性抗体（一种肝细胞癌特异性胞质蛋白）在肝癌球状体中的位置。染色方案的持续时间:6小时。比例尺 = 20 μm。 请点击此处查看此图的大图。

图 8:具有两种抗体和一种核染色剂（Hoechst）的水凝胶中全安装球体的免疫荧光标记。 （A-C）上图显示了一个球体，上面标有两种白蛋白和Ov6特异性抗体。比例尺 = 5 μm. （D-F） 下图显示了甲胎蛋白和 Ov6 在肝癌球体中的位置。 比例尺 = 20 μm。染色方案的持续时间:6小时。 请点击这里查看此图的大图。

图 9:具有三种抗体和核染色剂 （Hoechst） 的水凝胶中全安装球体的免疫荧光标记。 （A-E）上图中的球状体标有精氨酸酶、Na-K ATP酶和β-半乳糖苷酶特异性抗体。比例尺 = 10 μm. （F-J） 中间面板展示了一个用 Ov6、β-半乳糖苷酶和甲胎蛋白标记的球状体。比例尺 = 20 μm. （K-O） 下图中的球体已用 FITC-鬼笔环肽、抗线粒体抗体和抗高尔基体抗体标记。比例尺 = 20 μm。请注意标记特异性高和背景减少。染色方案的持续时间:6小时。 请点击这里查看此图的大图。

图10:电子显微镜图像。（A-C）扫描MD中水凝胶中整个微球的电子显微镜图像。比例尺 = 10 μm。 （D-F） 球体中细胞的超微结构特征也在透射电子显微镜下可视化。比例尺: （D） = 4 μm;（E，F） = 2 μm。 请点击此处查看此图的大图。

图 11:冻结前后微球的实时图像。（A-F）冷冻后水凝胶圆顶边界的不规则性很明显。但是，球体的大小和圆度仍然相似。（F）解冻后可以看到培养表面的细胞迁移。（G-L）活细胞膜（WGA）和细胞核染色（Hoechst）在MD的水凝胶中冷冻整个球体之前和之后表现出相似的细胞活力和完整的细胞膜。标尺:（A，B，D，E） = 200 μm;（C，F，G-L） = 20 μm。 请点击此处查看此图的大图。

表 1:短期实验期间传统工作流程和新工作流程之间的步骤数、时间和废物产生比较。

表2:常规免疫标记和新免疫标记方案的比较。

视频1:倒置相衬显微镜下含有球状体的水凝胶不同水平上的时间序列图像。请点击此处下载此视频。

视频 2:用细胞角蛋白 5 和 DAPI 抗体标记的两个气道类器官的 3D 结构。请点击此处下载此视频。

补充图1:实验概述。 该示意图显示了在水凝胶中生长和检查全安装类器官的顺序实验步骤。这里描述的技术可以在不同的显微镜下生长、冷冻、解冻、标记和检查类器官。 请点击此处下载此文件。

补充图2:传统玻璃底培养皿或MD中HepG2细胞的细胞活力，毒性和增殖速率的比较。HepG2细胞在（A）传统的玻璃底细胞培养皿或（B）MD中生长，以比较细胞活力和毒性。（C）使用台盼蓝排除试验来证明其可行性。比例尺 = 20 μm。使用（D-E）CCK8细胞毒性和（F）细胞增殖测定比较结果。请点击此处下载此文件。

补充图3:两个泡沫盒的排列。 在MD中整个类器官或球体的缓慢冷冻过程中，将一个泡沫盒放置在另一个泡沫盒内。*表示两个框。 请点击此处下载此文件。

补充图4:演示如何在树脂聚合后从MD中去除树脂块的步骤。（A）在MD壁龛内制备围绕球体或类器官的树脂块，然后聚合。（乙-四）然后，用适当的细棒推动树脂块以将其从壁龛中移除。（E）接下来，去除树脂块，下面有塑料。（F-G）最后，如果块仍然附着在塑料上，则使用一对镊子将它们分开。（H） 块已准备好进行薄切片。树脂块（*）中的全安装类器官或微球已准备好进行切片以进行透射电子显微镜检查。请点击此处下载此文件。

补充图5:免疫荧光标记的气道类器官，然后在MD中时可视化。（A-C）上图显示了具有中央管腔的环状气道类器官。绿色代表在类器官最外环中表达细胞角蛋白5的气道祖细胞，蓝色代表细胞核。比例尺 = 50 μm。 （D-F） 底部面板显示了 （D） DAPI 和 （E） Alexa 488 过滤器中两个并排类器官的三维图像，以及 （F） 合并图像。比例尺 = 100 μm。 请点击这里下载此文件。

补充图6:细胞活细胞膜上的标记密度比较。 该图使用传统和目前采用的工作流程比较冻结前后的球体。使用图像J图像分析软件进行分析。缩写:IntDen = 积分密度（所选微球中的荧光强度）。CTCF = 校正的总细胞荧光。 请点击此处下载此文件。

Ranan Gulhan Aktas拥有MD，S-IHC，S-IF和FS专利申请。Olgu Enis Tok参与了这些产品的开发。Olgu Enis Tok和Gamze Demirel是Cellorama公司的研发团队成员。Yusuf Mustafa Saatci，Zeynep Akbulut和Ozgecan Kayalar没有任何利益冲突需要声明。