在水凝胶中完整培养、冻存、处理及成像类器官与球状体

摘要

本研究描述了在多功能装置内，使类球体和类器官保持在水凝胶中完整状态的情况下，对其进行培养、冷冻、解冻、处理、染色、标记以及在各种显微镜下观察的方法学。

摘要

类器官和球状体是细胞培养实验室中生长的三维结构，与二维培养模型相比，其作为研究模型的优势正日益受到认可，因为它们能更好地模拟人体环境，并且相较于动物实验具有诸多优点。然而，这类研究通常面临可重复性和一致性方面的难题。在漫长的实验过程中，类器官和球状体需在不同细胞培养容器之间转移，并经历移液和离心等操作，这些脆弱且敏感的三维生长结构常常因此受损或丢失。最终结果受到显著影响，因为三维结构无法维持原有的特性和质量。本文所述方法最大限度地减少了这些对结构造成压力的操作步骤，确保类器官和球状体在整个处理流程中始终处于稳定且一致的环境中，且无需脱离其所处的水凝胶及多功能装置。研究人员可在同一多功能装置中完成类器官或球状体的培养、冷冻、解冻、处理、染色、标记，并随后利用多种高科技仪器（从共聚焦显微镜到电子显微镜）对其结构进行观察。该技术在处理过程中为三维生长结构提供了稳定且受保护的环境，从而提高了研究的可重复性、可靠性和有效性。此外，省去繁琐的操作步骤还可最大限度减少人为操作误差、缩短实验时间，并降低污染风险。

引言

细胞研究与治疗的未来在于三维细胞培养^1,2,3类器官和球状体模型缩小了体外与体内研究之间的差距 体外 通过构建更接近人体发育、生理和疾病特征的模型，改进实验和动物模型^4,5,6,7,8,9然而，这些模型的可重复性和可再现性仍然面临挑战。此外，在多种情况下，使用现有技术对这些结构进行操作、收获、转移和离心会导致类器官和球状体的丢失或损伤，从而显著影响实验结果。

尽管已有多种组织学染色、免疫组织化学染色、免疫荧光标记和冷冻保存的实验方案，但目前尚无通用方法用于标准化实验条件，以及在不丢失或损伤这些精细结构的前提下进行操作和处理。现有的实验方案通常极为耗时，从数天到数周不等，且涉及多种试剂的复杂操作步骤

方案

1. 类器官和球状体的培养

1. 将水凝胶置于冰上过夜（在冰箱或冷室中）以解冻。
2. 将市售的多功能装置（MD；参见 材料表) 在实验前一天将样品放入培养箱中（37 °C，5% CO₂升温。
3. 将无菌宽头移液器吸头置于4℃冰箱中 °C.
   注意：步骤 1.1–1.3 应在第 0 天进行，步骤 1.4–1.11 应在第 1 天进行。
4. 将水凝胶置于超净台中的冰上孵育15分钟。
   1. 可选：根据制造商的建议，用冷的细胞培养基稀释水凝胶。
5. 将含有HepG2细胞沉淀的离心管（购自商业来源的肝细胞癌细胞系；参见 材料表置于冰上。
6. 接种30-35孔 µ在预热装置的腔室内加入 L 的 100% 水凝胶，形成凝胶液滴。
7. 将10,000个HepG2细胞置于每个水凝胶液滴顶部中央图2），在37℃孵育15分钟 °C.
8. 用200覆盖水凝胶液滴 µ含10%胎牛血清的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）L
9. 将微流控装置（MD）的盖子正确盖好以允许气体流通，并将装置放入培养箱中。
10. 给细胞....

结果

本文介绍了一种多功能装置（MD）及其配套方法，可在单一特制环境中，对仍处于水凝胶中的完整类器官或球状体进行培养、冷冻、解冻、组织学染色、免疫组织化学染色、免疫荧光标记、包被以及处理。本研究旨在利用35个MD中的35个水凝胶液滴制备HepG2肝癌球状体。实验设置三个重复组以确保准确性。此外，以MD中的肺类器官进行免疫荧光标记为例，展示了当前方法在类器官研究中的应用效果。

图1 展示了含有水凝胶圆顶的装置的特写。该微环境的尺寸和形状设计旨在为含有类器官/球状体的水凝胶提供保护性环境，并减少各种操作过程中试剂的消耗。此外，装置中环绕微环境的侧边部分可在免疫染色实验中用作保湿室。培养样品所用的培养基体积可在100–200 µL，具体取决于水凝胶液滴的高度。本研究重点介绍基于液滴的方法，因为许多水凝胶、商用细胞外基质组分和基底膜提取物均允许使用者制备液滴。然而，也可先将水凝胶填充至微孔板（MD）的孔穴中，再将细胞接种于其中，以生成类器官或球状体。当基质的黏度过高而无法形成液滴，或实验需要大量类器官时，后一种方法可能更为适用。水凝胶的.......

讨论

MD 与本文所述的配方和方案相辅相成，可在更受控的环境中促进类器官和球状体快速且自发地进行三维生长，并可在相同条件下持续开展实验。样品在整个过程中始终处于同一环境，近 100% 的三维生长结构在容器中保持完整。这提高了连续实验过程中的均一性，并支持更长的培养周期。此外，与传统工作流程相比，类器官和球状体处理步骤显著减少。图4），从而最大限度地减少操作时间、人为误差和污染风险。此外，由于在整个实验过程中保持稳定的实验条件，并在单一环境中保护3D生长结构，因此提高了实验的可靠性与有效性。该方法有助于节省实验室的时间和人力，同时提升准确性、可靠性和有效性。同时，它还允许在整个连续过程中对单个3D生长结构进行追踪。利用该装置，可检测培养过程中3D结构的大小和位置变化，以及其对不同化合物的反应。这提供了一个卓越的 体外 用于重现人体发育及疾病发生过程的实验模型。研究人员可探究类球体和类器官融合过程中的各个阶段，这一机制对于疾病进展和正常发育中的细胞迁移至关重要^44,.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
无水乙醇（EtOH）	默克	8187602500	用 dH₂O 稀释2O 配制 30%、50%、70%、80%、90% 和 96% 溶液，并于室温保存
丙酮	默克	8222512500	室温保存
Alexa Fluor 小麦胚芽凝集素和 Hoechst  在Hank's平衡盐溶液（HBSS）中	Invitrogen	I34406	Image-IT LIVE 细胞质膜与细胞核标记试剂盒，-20 保存 °C
甲胎蛋白（AFP）浓缩及预稀释多克隆抗体	Biocare Medical	CP 028 A	4°C 保存 °C
抗白蛋白抗体	Abcam	EPR20195	4°C 保存 °C，稀释比例：1:50
抗β-半乳糖苷酶抗体，鸡多克隆	Abcam	134435	4°C 保存 °C，稀释比例：1:25
抗细胞角蛋白5	Abcam	53121	4°C 保存 °C，稀释比例：1:100
精氨酸酶-1 浓缩型及预稀释型兔单克隆抗体	Biocare Medical	ACI 3058 A，B	4°C 保存 °C，稀释比例：1:50
氯化钙（CaCl2)	Sigma	C1016-500G	用Karnovsky固定液溶解，配制成2 mM CaCl2；室温保存
细胞计数试剂盒8（WST-8 / CCK8）	Abcam	ab228554
15 mL 离心管	巢	601051
50 mL 离心管	巢	602052
II级生物安全柜 Bio II Advance Plus	Telstar	EN12469
CO2 培养箱	松下	KM-CC17RU2
铜网	电子显微镜科学公司	G100-Cu	载网上的超薄切片；100线/英寸方格网
临界点干燥仪	Leica	EM CPD300	用于在纯丙酮中干燥适用于扫描电镜的生物样品
DAB/AEC显色液混合物	Sigma Aldrich	AEC101	4°C 保存 °C
金刚石刀	硅藻	Ultra 45°，40-US	用于透射电子显微镜的超薄切片
分子生物学用二甲基亚砜	Biofroxx	67-68-5
一次性塑料巴斯德吸管	巢
DMEM - 达尔伯克改良伊格尔培养基	Gibco	41966-029	4°C 保存 °C
伊红Y醇溶液	明亮幻灯片	2.BS01-105-1000
Epon 树脂	Sigma	45359-1EA-F	环氧树脂包埋试剂盒，4°C 保存 °C
含添加剂增强剂的胎牛血清	Pan Biotech	P30-3304	4°C 保存 °C
冷冻液（FS）	Cellorama	CellO-F	4°C 保存 °C
玻璃刀制备器	Leica	EM KMR3	用于制作8 mm厚度的玻璃刀
玻璃刀片条（尺寸 8 mm × 25.4 mm × 400 mm）	Leica	7890-08	用于透射电子显微镜的超薄或半薄切片
25% 戊二醛水溶液，电镜级	电子显微镜科学公司	16210	用 dH₂O 稀释2O，配制2.5%溶液，于+4℃保存 °C
甘油溶液	Sigma Aldrich	56-81-5	-20 °C 保存，稀释比例：1:100
山羊抗鸡 IgY（H+L）二抗，Alexa Fluor 647	Invitrogen	A32933	室温保存
山羊抗小鼠IgG（H+L）二抗，DyLight 488	Invitrogen	35502	4°C 保存 °C,  稀释比例：1:50
山羊抗小鼠 IgG（H+L）二抗，DyLight 550	Invitrogen	84540	4°C 保存 °C,  稀释比例：1:50
DyLight 488 标记山羊抗兔 IgG（H+L）二抗	Invitrogen	35552	4°C 保存 °C,  稀释比例：1:50
山羊抗兔IgG（H+L）二抗，DyLight 550	Invitrogen	84541	4°C 保存 °C
Harris 苏木精	明亮载玻片	2.BS01-104-1000
HepG2 细胞	ATCC	HB-8065	储存在氮气罐中
人/大鼠 OV-6 抗体 单克隆小鼠 IgG1 克隆 # OV-6	R&D Systems	MAB2020	-20℃保存 °C
水凝胶	康宁	354248	Matrigel，高浓度（HC）无LDEV型基底膜基质，10 mL，-20储存 °C
水凝胶	康宁	354234	Matrigel，无LDEV基底膜基质，10 mL，-20℃保存 °C
水凝胶	赛默飞世尔科技	A1413201	Geltrex，无LDEV低生长因子基底膜基质
水凝胶	Biotechne, R&D Systems	BME001-01	Cultrex Ultramatrix RGF BME，储存于 -20 °C
卡诺夫斯基固定液			2% PFA，2.5% 戊二醛溶于0.15 M卡考基酸缓冲液，含2 mM CaCl₂2；现配；用于透射电镜 &和扫描电镜样品
L-天冬氨酸	Sigma	11189-100G	室温保存
铅天冬氨酸溶液			将40 mg天冬氨酸溶解于10 mL ddH₂O中2O，并加入66 mg硝酸铅。溶液在60 ℃下稳定 °C，并调节pH至5；现配现用
硝酸铅	电子显微镜科学公司	17900	室温保存
徕卡共聚焦显微镜	Leica	DMi8
LSM 700 激光扫描共聚焦显微镜	蔡司
酶标仪	Biotek Synergy
多功能装置（MD）	Cellorama	CellO-M
细胞核DNA染料	Invitrogen	H3569	Hoechst 33258，五水合物（双苯并咪唑）－ 水溶液，10 mg/mL，4 °C 保存 °C
细胞核DNA染料	ThermoFischer Scientific	62248	DAPI 溶液，于 +4 ℃ 保存 °C
四氧化锇（OsO₄）4) ,4%	电子显微镜科学公司	19190	用 dH₂O 稀释2O 以配制 2% 溶液；于 +4 ℃ 保存 °在密闭容器中于2-8°C避光保存
Ov6 抗体	R&研发系统	MAB2020	4°C 保存 °C
4% 甲醛溶液（PFA）	Sigma	1.04005.1000	将4% PFA溶解于dH₂O中2O并煮沸，冷却后分装；于-20℃保存 °C
4% PBS 甲醛溶液，1 L	Santa Cruz Biotechnology	sc-281692	4°C 保存 °C
磷酸盐缓冲液（PBS），片剂	MP Biomedicals, LLC	2810305
后固定液			%2 OsO4，%2.5 亚铁氰化钾在dH₂O中2O；现配
5% 亚铁氰化钾水溶液	电子显微镜科学公司	26603-01	室温保存
Primovert — 倒置明场显微镜 — ZEISS	蔡司	货号：491206-0001-000
圆底微量离心管，2 mL	巢	620611
配备STEM附件的扫描电子显微镜	Zeiss	GeminiSEM 500	我们使用 Inlens 二次电子（SE）探测器在 2–3 kV 条件下进行扫描电子显微成像，使用 aSTEM 探测器在 30 kV 条件下进行透射电子显微成像。
SensiTek HRP 抗多价试剂盒组合	ScyTek Laboratories	SHP125	4°C 保存 °C
0.4 M，pH 7.2 的二甲胂酸钠缓冲液	电子显微镜科学公司	11655	用 dH₂O 稀释2O，用于配制0.2 M溶液，并于+4℃保存 °C
钠/钾ATP酶α1抗体 [M7-PB-E9]	GeneTex	GTX22871	-20℃保存 °C
免疫荧光标记溶液（S-IF）	Cellorama	CellO-IF	4°C 保存 °C
免疫组织化学溶液（S-IHC）	Cellorama	CellO-P	4°C 保存 °C
标本修整装置	Leica	EM TRIM2	用于制备环氧树脂样品块以进行超薄切片
溅射镀膜仪	Leica	EM ACE200	用金/钯合金镀膜6 nm，时长90秒，对扫描电镜样品进行镀膜处理
硫代碳酰肼（TCH）	Sigma	223220-5G	用 dH₂O 稀释2O，配制0.5%溶液，并用0.22 μm滤膜过滤 µm 微孔滤膜；室温保存；现配现用
0.4% 台盼蓝溶液	Gibco	15250061
超凝胶强力胶	Pattex	PSG2C	将聚合后的环氧树脂包埋块连同样品粘附到环氧树脂包埋块持样器上
超薄切片机	Leica	EM UC7	用于制备高质量的超薄或半薄切片以进行透射电子显微镜（TEM）观察
通用移液器吸头，10 µL	巢	171215-1101
通用型移液器吸头，1000 µL	伊索拉布	L-002
通用移液器吸头，200 µL	巢	110919HA01
醋酸铀酰	电子显微镜科学公司	22400	用 dH₂O 稀释2O 制备 2% 溶液，并用 0.22 μm 滤膜过滤 µm 微孔滤膜；保持容器密闭，于室温保存