在水凝胶中完整培养、冻存、处理及成像类器官与球状体

摘要

本研究描述了在多功能装置内，使类球体和类器官保持在水凝胶中完整状态的情况下，对其进行培养、冷冻、解冻、处理、染色、标记以及在各种显微镜下观察的方法学。

摘要

类器官和球状体是细胞培养实验室中生长的三维结构，与二维培养模型相比，其作为研究模型的优势正日益受到认可，因为它们能更好地模拟人体环境，并且相较于动物实验具有诸多优点。然而，这类研究通常面临可重复性和一致性方面的难题。在漫长的实验过程中，类器官和球状体需在不同细胞培养容器之间转移，并经历移液和离心等操作，这些脆弱且敏感的三维生长结构常常因此受损或丢失。最终结果受到显著影响，因为三维结构无法维持原有的特性和质量。本文所述方法最大限度地减少了这些对结构造成压力的操作步骤，确保类器官和球状体在整个处理流程中始终处于稳定且一致的环境中，且无需脱离其所处的水凝胶及多功能装置。研究人员可在同一多功能装置中完成类器官或球状体的培养、冷冻、解冻、处理、染色、标记，并随后利用多种高科技仪器（从共聚焦显微镜到电子显微镜）对其结构进行观察。该技术在处理过程中为三维生长结构提供了稳定且受保护的环境，从而提高了研究的可重复性、可靠性和有效性。此外，省去繁琐的操作步骤还可最大限度减少人为操作误差、缩短实验时间，并降低污染风险。

引言

细胞研究与治疗的未来在于三维细胞培养^1,2,3类器官和球状体模型缩小了体外与体内研究之间的差距 体外 通过构建更接近人体发育、生理和疾病特征的模型，改进实验和动物模型^4,5,6,7,8,9然而，这些模型的可重复性和可再现性仍然面临挑战。此外，在多种情况下，使用现有技术对这些结构进行操作、收获、转移和离心会导致类器官和球状体的丢失或损伤，从而显著影响实验结果。

尽管已有多种组织学染色、免疫组织化学染色、免疫荧光标记和冷冻保存的实验方案，但目前尚无通用方法用于标准化实验条件，以及在不丢失或损伤这些精细结构的前提下进行操作和处理。现有的实验方案通常极为耗时，从数天到数周不等，且涉及多种试剂的复杂操作步骤^{10,11,12,13,14}。此外，在细胞培养容器与冻存管之间进行类器官和球状体的收获、移液、离心和转移操作时，会导致结构位置的改变及机械力的作用，最终影响类器官和球状体的分化与成熟。已有研究报道，组织拓扑结构、细胞的空间定位以及机械力对细胞的分化和成熟具有显著影响^6,15,16,17。

因此，有必要改进现有的常规技术，以生成质量稳定的类器官和球状体。若能采用一种方法或装置，省去离心及其他上述步骤，并在单一且安全的环境中完成全部多步骤操作，将有助于获得最为一致且可靠的数据。此外，这种方法还将减少时间、人力和成本的限制。

本文所述的多功能装置（MD）为类器官和球状体的多种操作提供了单一且安全的环境（补充 图 1）。该装置及其配套方案消除了收获、移液、转移和离心等步骤。在连续操作过程中，类器官和球状体始终保留在其体外（in vitro）环境中。该环境主要由天然或合成的细胞外基质成分组成，例如市售的水凝胶。换句话说，本文所述方法允许在水凝胶液滴中直接对类器官/球状体的整体样本进行处理、检测和冷冻保存。

该生物相容性装置可耐受60 °C至-160 °C之间的温度，因此可在-160 °C的液氮罐中保存类器官/类固醇，或在60 °C下制备用于电子显微镜观察的树脂包埋块。装置中的微环境结构设计用于为三维生长结构提供限定空间，并基于先前研究促进球状体或类器官的形成^{18,19,20,21,22,23}。该部分装置为透明材质，含有特定塑料，具有高光学质量（折射率：1.43；阿贝数：58；厚度：7.8 mil [0.0078 in 或 198 µm]）。微环境区域及其周围的“侧边”部分均会产生自发荧光。中心透明微环境区域面积为80 mm²，侧边部分面积为600 mm²。容器深度为15 mm，壁厚为1.5 mm。这些特性，结合装置的尺寸与设计，使其可用于多种高科技显微镜下的观察，并可用于电子显微镜样品的制备（图2）。该装置的封闭系统具有两种状态：一种可在冷冻条件下密封，另一种可在培养箱中允许气体流通。CCK8增殖与细胞毒性检测显示，与传统细胞培养皿相比，该装置对细胞的影响相似（补充 图2）。台盼蓝排斥实验表明，在MD装置中进行细胞培养时，细胞活力较高（94%）（图3）。

单个设备中对一个样品可执行的操作包括：（1）培养，（2）组织学染色，（3）免疫染色，包括免疫组织化学和免疫荧光标记，（4）冷冻，（5）解冻，（6）在光学显微镜下观察，例如明场、暗场、荧光、共聚焦和超分辨率显微镜，（7）包被后直接在扫描电子显微镜下观察，或（8）制备用于透射电子显微镜观察（图2）。

目前存在多种用于类器官和球状体的组织学染色、免疫组织化学标记或荧光标记的方法^{10,11,12,13,14,24,25}。从水凝胶中收获这些结构是当前技术的第一步，也是关键步骤。在此之后，某些方法可实现整体免疫标记。而在其他方法中，收获后的类器官需包埋于石蜡中，切片后再进行染色和免疫染色。然而，切片可能无法完整呈现整个样本，仅能提供有关结构三维构象的有限信息。此外，这些技术已知的副作用包括对三维结构的损伤以及抗原性的丧失。

本文介绍的显微镜检查新配套方案可实现对仍处于水凝胶中的整体样本进行分析。此处描述的方案包括两种新开发的试剂配方：免疫组织化学溶液（S-IHC）和免疫荧光标记溶液（S-IF）。使用这些溶液的方法使研究人员能够获得更准确的数据，因为避免了传统操作流程中对精细结构造成损害的步骤，如离心、移液和样品转移。本方案还省去了收获、封闭、透明化和抗原修复等步骤，将整个流程缩短至6–8小时。此外，该方法允许在同一S-IF溶液中同时加入一至三种抗体，因此即使进行多重标记实验，也能在同一天内获得结果，这是本方案的另一优势；而传统的整体样本免疫荧光标记方案通常需要3天至数周时间^{10,11,12,13,14}。

省略了会降低抗原性的另一有害步骤——石蜡包埋。三维结构从显微观察开始到结束始终处于其体外（in vitro）环境中。由于三维结构始终保持在生长条件下，蛋白质表达与定位数据能更真实地模拟体内（in vivo）状态。由于该方法消除了影响样本抗原表达的步骤，因此预期可获得更准确的结果。表 1 和表 2 展示了这些新方案如何减少操作步骤、节省实验室时间和人力，并相较于传统工作流程降低费用和废弃物产生。

除了上述关键步骤外，另一个问题是提供一种冷冻保存介质和方法，以更高细胞存活率维持样品的三维结构^{26,27,28,29,30,31}。冷冻保存对于构建稳定的模型系统以及类器官和球状体的生物样本库至关重要^32,33。对完整的原始三维结构进行生物样本库保存，将有助于更真实地再现健康或疾病状态的自然特征。关键考虑因素包括类器官/球状体冷冻保存与解冻操作的便捷性和可靠性。目前大多数技术在解冻后的类器官回收率非常低，通常低于50%。然而，近期研究已显示出改善存活率的可喜成果^26,27,28,29。Lee 等人证明，当使用含15% DMSO的威斯康星大学溶液时，78%的球状体细胞在冷冻保存后仍可存活²⁸。Arai 等人的研究中，细胞存活率进一步提高至83%²⁹。然而，由于三维结构无法保持原有的特性与质量，冷冻保存后的结果受到显著影响。此外，在制药和诊断环境中，为符合良好生产规范，需要使用无血清试剂。传统工作流程采用含有胎牛血清（FBS）和二甲基亚砜（DMSO）的培养基进行慢速冷冻法，而这两种成分均存在局限性。FBS 是一种动物源性产品，可能存在批次间差异。DMSO 是一种非常有效的冷冻保护剂，但长期暴露，尤其是在解冻过程中，可能引起细胞毒性作用^30,31。

本文还描述了在水凝胶中对整个类器官或球状体进行冷冻/解冻的方法。研究中使用了两种类器官和球状体的冷冻保存配方：（1）含10% DMSO的传统冷冻液（FS）；（2）无血清且无DMSO的冷冻保存培养基。该冷冻保存培养基含有不同于现有配方的细胞外基质成分。细胞外基质主要由两类大分子组成：蛋白聚糖和纤维蛋白，它们不仅为细胞成分提供必要的物理支架，还启动组织形态发生、分化和稳态所需的过程^{34,35,36,37,38,39,40}。胶原蛋白提供抗张强度，调控细胞黏附，支持趋化性和细胞迁移，并引导组织发育³⁷。此外，弹性纤维可使经历反复拉伸的组织恢复原状³⁸。第三种纤维蛋白——纤连蛋白，可指导间质细胞外基质的组织结构，在介导细胞黏附方面发挥关键作用，并作为细胞外的机械调节因子³⁹。Du 等人已证明鸡胶原蛋白水解物在天然肌动球蛋白模型系统中的冷冻保护作用⁴¹。他们的结果表明，胶原蛋白水解物能够抑制冰晶生长，减少蛋白质的冷冻变性和氧化，效果与商用冷冻保护剂相当，并在冻融循环后提供更优的凝胶结构。 因此，在冷冻保存培养基中添加细胞外基质成分可为样本提供更安全、更具保护性的环境，并有助于活体结构在冻融后修复。

此外，本研究描述了一种简单的方法，可在类器官和球状体仍处于水凝胶中时，对其活细胞的细胞质膜和细胞核进行标记。

方案

1. 类器官和球状体的培养

1. 将水凝胶置于冰上过夜（在冰箱或冷室中）以解冻。
2. 将市售的多功能装置（MD；参见 材料表) 在实验前一天将样品放入培养箱中（37 °C，5% CO₂升温。
3. 将无菌宽头移液器吸头置于4℃冰箱中 °C.
   注意：步骤 1.1–1.3 应在第 0 天进行，步骤 1.4–1.11 应在第 1 天进行。
4. 将水凝胶置于超净台中的冰上孵育15分钟。
   1. 可选：根据制造商的建议，用冷的细胞培养基稀释水凝胶。
5. 将含有HepG2细胞沉淀的离心管（购自商业来源的肝细胞癌细胞系；参见 材料表置于冰上。
6. 接种30-35孔 µ在预热装置的腔室内加入 L 的 100% 水凝胶，形成凝胶液滴。
7. 将10,000个HepG2细胞置于每个水凝胶液滴顶部中央图2），在37℃孵育15分钟 °C.
8. 用200覆盖水凝胶液滴 µ含10%胎牛血清的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）L
9. 将微流控装置（MD）的盖子正确盖好以允许气体流通，并将装置放入培养箱中。
10. 给细胞加入 200 µ每隔一天更换一次含10% FBS的DMEM培养基。
11. 在倒置显微镜下观察类球体的生长情况（图3）。类球体的形成始于第3天^rd 天 视频 1 显示类球体在水凝胶穹顶不同层面的位置。
    注意事项：强烈建议轻柔地吸除水凝胶周围的液体，并缓慢向环境中添加新液体，以防止损坏水凝胶液滴。

2. 类器官/球状体整体在水凝胶中的苏木精和伊红染色

1. 将固定液（4% 多聚甲醛；PFA）、PBS 和苏木精（见材料表）预热至 37 °C。
2. 用移液器吸除水凝胶液滴周围的培养基，加入 100–200 µL 的 4% PFA 进行固定，在 37 °C 下孵育 15–20 分钟。
3. 吸除 4% PFA，加入 200 µL PBS，在 37 °C 下洗涤 3 次，每次 5 分钟。随后吸除 PBS，加入 200 µL 苏木精溶液，在 37 °C 下孵育 15–20 分钟。
4. 吸除苏木精溶液，加入 200 µL dH₂O，在 37 °C 下洗涤 3 次，每次 10 分钟。吸除 dH₂O 后，加入 200 µL 乙醇，在 37 °C 下孵育 5–10 分钟。
5. 吸除乙醇，加入 200 µL 伊红（见材料表），在 37 °C 下孵育 10 分钟。吸除伊红溶液，加入 200 µL dH₂O，在室温（RT）下洗涤 5 分钟。
6. 吸除 dH₂O，加入 100 µL 甘油覆盖水凝胶液滴，作为封片介质。
7. 可选步骤：用盖玻片封片。若为避免压碎较大尺寸的类器官或球状体，可省略此步骤。
8. 将 MD 的盖子紧密关闭，防止干燥，直至进行观察。样品在至少 6 个月内保持稳定，可用于检测。

3. 类器官/球状体整体在水凝胶中的免疫组织化学染色

1. 将市售的免疫组织化学溶液（S-IHC；参见材料表）预热至 37 °C。
2. 在 200 µL 去离子水（dH₂O）中加入 3% 过氧化氢（H₂O₂），将类器官或球状体连同水凝胶一起在 37 °C 下孵育 5 分钟。
3. 吸除过氧化氢溶液，在去离子水（dH₂O）中 37 °C 洗涤 5 分钟。吸除 dH₂O，随后在 100 µL S-IHC 溶液中于 37 °C 各孵育 10 分钟，重复两次。
4. 吸除 S-IHC 溶液，加入 100 µL 用 S-IHC 稀释的一抗溶液（参见材料表），在 37 °C 孵育 1–2 小时（按照生产商推荐的工作稀释比例进行稀释）。
5. 吸除一抗溶液，在 100 µL S-IHC 溶液中于 37 °C 孵育三次，每次 5 分钟。
6. 吸除 100 µL S-IHC 溶液，加入生物素标记的二抗（参见材料表），在 37 °C 孵育 10 分钟。
7. 吸除二抗溶液，在 100 µL S-IHC 溶液中于 37 °C 孵育三次，每次 5 分钟。吸除 S-IHC 溶液后，加入 100 µL 辣根过氧化物酶（HRP）标记的链霉亲和素（参见材料表），在 37 °C 孵育 10 分钟。
8. 吸除 HRP 标记的链霉亲和素溶液，在 100 µL S-IHC 溶液中于 37 °C 孵育三次，每次 5 分钟。
9. 吸除 S-IHC 溶液，加入 100 µL DAB/AEC 显色液混合物（参见材料表），在 37 °C 孵育 5–10 分钟。
10. 在光学显微镜下观察染色强度。
11. 用去离子水（dH₂O）洗涤三次，每次 2 分钟。
12. 可选：加入 100 µL 苏木精（参见材料表），在 37 °C 孵育 5 分钟，用于细胞核复染。
13. 吸除苏木精溶液，用去离子水（dH₂O）洗涤 5 分钟。
14. 吸除 dH₂O，加入 100 µL 甘油覆盖水凝胶液滴，作为封片介质。
15. 将 MD 培养皿的盖子紧密盖好，直至进行显微镜观察。
    备注：本方案中省略了抗原修复和蛋白封闭步骤，因为 S-IHC 溶液已无需这些步骤。

4. 类器官/球状体在水凝胶中的整体免疫荧光标记

1. 将以下材料预热至 37 °C：4% PFA、PBS、S-IF、S-IF 中的初级抗体溶液、S-IF 中的次级抗体溶液、核染料和甘油（参见材料表）。
2. 吸除细胞培养基，加入 200 µL 4% PFA，在 37 °C 固定 15–30 分钟。吸除固定液，用 S-IF 在 37 °C 洗涤 3 次，每次 10 分钟。
3. 向微环境（niche）周围侧壁加入 dH₂O，以在后续步骤中提供湿度。
4. 吸除水凝胶液滴周围的 S-IF，将水凝胶液滴在 S-IF 中与 100 µL 初级抗体溶液（参见材料表）于 37 °C 孵育 30–60 分钟。
5. 吸除初级抗体溶液，用 S-IF 在 37 °C 洗涤 3 次，每次 10 分钟。
6. 吸除 S-IF，将水凝胶液滴在 S-IF 中与 100 µL 次级抗体溶液（参见材料表）于 37 °C 避光孵育 30–60 分钟。
7. 吸除次级抗体溶液，用 PBS 在 37 °C 避光洗涤 3 次，每次 10 分钟。
8. 吸除 PBS，加入 100 µL 含封片剂或甘油的核-DNA 染料，在 37 °C 避光孵育。
9. 用甘油填充微环境（niche），防止干燥。
10. 可选：用盖玻片覆盖微环境（niche）。此步骤可省略，以避免挤压类器官或球状体。
11. 紧密封闭 MD。MD 中的样品可在 4 °C 避光条件下保存至少 6 个月，荧光损失最小。
12. 共聚焦显微镜检测使用以下设置：所有通道的针孔值设为 20.1；增益主控值在 488 nm 时保持 550，550 nm 时保持 485，594 nm 时保持 450；所有实验中激光功率保持恒定，最低百分比设为 2.0。
    备注：初级抗体：抗 Na-K ATP 酶抗体（1:100）、抗精氨酸酶抗体（1:50）、抗白蛋白抗体（1:50）、抗 β-半乳糖苷酶抗体（1:25）、抗线粒体抗体（1:100）、抗高尔基体抗体（1:50）、抗细胞角蛋白 5 抗体（1:100）、Ov6 抗体（1:100）。次级抗体：羊抗兔 IgG（H+L）-488、羊抗兔 IgG（H+L）-550、羊抗小鼠 IgG（H+L）-488、羊抗小鼠 IgG（H+L）-550、羊抗鸡 IgY（H+L）-647。所有次级抗体稀释比例均为 1:100。此外，还使用了偶联抗体 FITC-鬼笔环肽（1:100）（参见材料表）。

5. 在水凝胶中对活体类器官和球状体的细胞膜和细胞核进行标记

1. 配制含有Alexa Fluor小麦胚芽凝集素（5.0 µ微克/毫升）和 Hoechst（2 µM) 在 Hank's 平衡盐溶液 (HBSS) 中，按照制造商的建议（参见 材料表），并升温至37 °C.
2. 吸弃细胞培养基，加入 100 µ加入适量标记溶液以覆盖水凝胶液滴，37℃孵育15–30分钟 °C.
3. 移除标记液，用 PBS 洗涤两次，每次 10 分钟，37 ℃ °C. 可选：用 200 µ4% 甲醛溶液中 37℃ 孵育 15 分钟 ˚C.
4. 用甘油作为封片剂覆盖水凝胶液滴。可选：用盖玻片封片。
5. 紧密关闭MD的盖子，并在避光条件下冷藏，直至进行荧光/共聚焦显微镜检查。该样品至少可稳定保存6个月。

6. 类器官/球状体整体在水凝胶中的冻存与复苏

1. 按照以下步骤冻存类器官。
   1. 将购买的冻存液（FS；参见材料表）预热至 37 °C。
   2. 轻柔吸除水凝胶圆顶周围的细胞培养基。
   3. 轻柔加入 200 µL 冻存液。将样品在 37 °C 下孵育 1 小时。
   4. 紧密关闭装置盖子，并将其放入泡沫盒中。将此泡沫盒再放入另一个泡沫盒中，如补充图 3所示。将两个泡沫盒均紧密封闭。两个嵌套的泡沫盒可在 -20 °C 冰箱中为样品提供每分钟 1 至 2 °C 的降温梯度。
   5. 将盒子置于 -20 °C 下 2 小时。随后将盒子转移至 -80 °C 冰箱中过夜。
   6. 从盒子中取出样品。微流控装置（MD）中的样品可在 -80 °C 冰箱中保存长达 6 个月。
   7. 将含有样品的微流控装置（MD）转移至液氮罐中进行长期储存。
2. 按照以下步骤复苏类器官。
   1. 从冰箱或液氮罐中取出含有样品的微流控装置（MD），并直接放入 37 °C 培养箱中。在 37 °C 下孵育 1 小时。
   2. 向微环境（niche）中加入 200 µL 预热的培养基（冻存液与细胞培养基的体积比为 1:1），并在 37 °C 下孵育 30 分钟。
   3. 继续向微环境中加入更多预热的培养基（冻存液与细胞培养基的体积比为 1:2），并在 37 °C 下孵育 30 分钟。
   4. 轻柔吸除培养基与冻存液的混合液。随后进行水凝胶中整体类器官/球状体的扫描电子显微镜（步骤 7）和透射电子显微镜（步骤 8）成像。

7. 类器官/球状体整体的扫描电子显微镜观察

1. 预热卡诺夫斯基固定液和后固定液（参见 材料表室温（RT）
2. 吸除 MD 中水凝胶周围的细胞培养基。将 MD 中的样品置于超净台中的冰上孵育 15 分钟。
3. 轻轻吸除类器官/球状体周围液化的水凝胶。可保留少量基质胶在样本微环境中，以避免损伤或丢失样本。
4. 用卡诺夫斯基固定液（2% PFA，2.5% 戊二醛溶于 0.15 M 卡可基酸盐缓冲液，并含 2 mM CaCl₂）固定₂；参见 材料表室温下孵育1小时。
5. 轻轻吸去固定剂，用蒸馏水（dH₂O）洗涤₂O）每次15分钟，重复3次。
6. 吸去 dH₂O₂用后固定液（1% 水溶液四氧化锇 [OsO₄]）轻柔固定₄]；参见 材料表室温下孵育1小时。
7. 轻轻吸去固定后的溶液，用蒸馏水（dH₂O）洗涤₂O）每次15分钟，重复3次。
8. 在一系列浓度的乙醇（30%、50%、70%、80%、90%、96%、100%）、乙醇/丙酮混合液（1:1；1:2）及纯丙酮中依次脱水，每步在室温下进行15分钟。
9. 使用临界点干燥仪进行干燥。
10. 使用溅射镀膜仪在装置中的样品上镀一层6 nm的金/钯 材料表）90 秒。
11. 在真空模式下，使用镜内二次电子探测器，于2–3 kV电压下用扫描电子显微镜观察（5 × 10⁻⁶ Pa）^-6 mA）。在 8.1–8.2 mm 的工作距离下，分别以 675 倍、1050 倍和 1570 倍的放大倍数进行成像。
    注意：所有步骤均在 MD 中进行。使用 200–250 µ每步所需溶液的体积为 L。

8. 水凝胶中类器官/球状体整体装片的透射电子显微镜观察

1. 将Karnovsky固定液预热至37 °C。吸除多孔板（MD）中水凝胶周围的细胞培养基。
2. 在室温下用Karnovsky固定液固定样品1小时。用去离子水（dH₂O）洗涤3次，每次15分钟。
3. 在室温下用2%的水溶液OsO₄ 和2.5%的亚铁氰化钾溶液后固定45分钟。用去离子水（dH₂O）洗涤3次，每次10分钟。
4. 在室温下用0.5%的硫代羰基肼（TCH；见材料表）孵育30分钟。用去离子水（dH₂O）洗涤3次，每次10分钟。
5. 在室温下用2%的水溶液OsO₄ 孵育30分钟。用去离子水（dH₂O）洗涤3次，每次10分钟。
6. 在室温下用2%醋酸铀酰溶液（见材料表）孵育1小时。
   注意：此步骤中，类球体可在4 °C下保存过夜。
7. 在60 °C下用天冬氨酸铅溶液（见材料表）孵育45分钟。用去离子水（dH₂O）洗涤3次，每次10分钟。
8. 在梯度乙醇（50%、70%、90%、100% [×2]）和纯丙酮中依次于室温下脱水，每次15分钟。
9. 在室温下依次用丙酮/环氧树脂混合液（1:1；1:2）和纯环氧树脂（见材料表）处理，每次2小时。
10. 在60 °C下聚合树脂过夜（至少16小时）。聚合完成后，从多孔板（MD）中取出树脂块，如补充图4所示。
11. 用树脂胶将树脂块粘附到更大的支撑块上。修块并定位至类器官或类球体所在区域。
12. 使用超薄切片机（见材料表）切取半薄切片（1,000 nm）和超薄切片（60 nm）。
13. 将超薄切片置于100目铜网上，使用配备STEM探测器的扫描电子显微镜在30 kV加速电压下观察。工作距离设为44 mm，分别在2580×、5020×和6060×放大倍数下采集图像。
    注意事项：每步使用200–250 µL溶液。步骤8.1–8.10均在多孔板（MD）中进行。

结果

本文介绍了一种多功能装置（MD）及配套方法，可在单一特制环境中对仍处于水凝胶中的完整类器官或球状体进行培养、冷冻、解冻、组织学染色、免疫组织化学染色、免疫荧光标记、包被以及处理。本研究旨在利用35个MD中的35个水凝胶液滴制备HepG2肝癌球状体。实验设置三个重复组以确保准确性。此外，以MD中的肺类器官进行免疫荧光标记为例，展示了当前方法在类器官研究中的应用效果。

图1展示了含有水凝胶半球结构的装置细节。该微环境（niche）的尺寸和形状设计旨在为含有类器官/球状体的水凝胶提供保护性环境，并在各种实验过程中节约试剂用量。此外，装置中环绕微环境的侧部结构可在免疫染色实验期间用作保湿腔室。培养样本所用的培养基体积可为100–200 µL，具体取决于水凝胶液滴的高度。本研究主要关注基于半球形液滴的方法，因为许多水凝胶、商用细胞外基质组分以及基底膜提取物均允许用户制备液滴。然而，也可先将水凝胶填充至微流控装置（MD）的微环境中，再在其中接种细胞以生成类器官/球状体。当基质的黏度不允许形成液滴，或实验涉及大量类器官时，后一种方法可能...

讨论

MD 与本文所述的配方和方案相辅相成，可在更受控的环境中促进类器官和球状体快速且自发地进行三维生长，并可在相同条件下持续开展实验。样品在整个过程中始终处于同一环境，近 100% 的三维生长结构在容器中保持完整。这提高了连续实验过程中的均一性，并支持更长的培养周期。此外，与传统工作流程相比，类器官和球状体处理步骤显著减少。图4），从而最大限度地减少操作时间、人为误差和污染风险。此外，由于在整个实验过程中保持稳定的实验条件，并在单一环境中保护3D生长结构，因此提高了实验的可靠性与有效性。该方法有助于节省实验室的时间和人力，同时提升准确性、可靠性和有效性。同时，它还允许在整个连续过程中对单个3D生长结构进行追踪。利用该装置，可检测培养过程中3D结构的大小和位置变化，以及其对不同化合物的反应。这提供了一个卓越的 体外 用于重现人体发育及疾病发生过程的实验模型。研究人员可探究类球体和类器官融合过程中的各个阶段，这一机制对于疾病进展和正常发育中的细胞迁移至关重要^44,...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
无水乙醇（EtOH）	默克	8187602500	用 dH₂O 稀释2O 配制 30%、50%、70%、80%、90% 和 96% 溶液，并于室温保存
丙酮	默克	8222512500	室温保存
Alexa Fluor 小麦胚芽凝集素和 Hoechst  在Hank's平衡盐溶液（HBSS）中	Invitrogen	I34406	Image-IT LIVE 细胞质膜与细胞核标记试剂盒，-20 保存 °C
甲胎蛋白（AFP）浓缩及预稀释多克隆抗体	Biocare Medical	CP 028 A	4°C 保存 °C
抗白蛋白抗体	Abcam	EPR20195	4°C 保存 °C，稀释比例：1:50
抗β-半乳糖苷酶抗体，鸡多克隆	Abcam	134435	4°C 保存 °C，稀释比例：1:25
抗细胞角蛋白5	Abcam	53121	4°C 保存 °C，稀释比例：1:100
精氨酸酶-1 浓缩型及预稀释型兔单克隆抗体	Biocare Medical	ACI 3058 A，B	4°C 保存 °C，稀释比例：1:50
氯化钙（CaCl2)	Sigma	C1016-500G	用Karnovsky固定液溶解，配制成2 mM CaCl2；室温保存
细胞计数试剂盒8（WST-8 / CCK8）	Abcam	ab228554
15 mL 离心管	巢	601051
50 mL 离心管	巢	602052
II级生物安全柜 Bio II Advance Plus	Telstar	EN12469
CO2 培养箱	松下	KM-CC17RU2
铜网	电子显微镜科学公司	G100-Cu	载网上的超薄切片；100线/英寸方格网
临界点干燥仪	Leica	EM CPD300	用于在纯丙酮中干燥适用于扫描电镜的生物样品
DAB/AEC显色液混合物	Sigma Aldrich	AEC101	4°C 保存 °C
金刚石刀	硅藻	Ultra 45°，40-US	用于透射电子显微镜的超薄切片
分子生物学用二甲基亚砜	Biofroxx	67-68-5
一次性塑料巴斯德吸管	巢
DMEM - 达尔伯克改良伊格尔培养基	Gibco	41966-029	4°C 保存 °C
伊红Y醇溶液	明亮幻灯片	2.BS01-105-1000
Epon 树脂	Sigma	45359-1EA-F	环氧树脂包埋试剂盒，4°C 保存 °C
含添加剂增强剂的胎牛血清	Pan Biotech	P30-3304	4°C 保存 °C
冷冻液（FS）	Cellorama	CellO-F	4°C 保存 °C
玻璃刀制备器	Leica	EM KMR3	用于制作8 mm厚度的玻璃刀
玻璃刀片条（尺寸 8 mm × 25.4 mm × 400 mm）	Leica	7890-08	用于透射电子显微镜的超薄或半薄切片
25% 戊二醛水溶液，电镜级	电子显微镜科学公司	16210	用 dH₂O 稀释2O，配制2.5%溶液，于+4℃保存 °C
甘油溶液	Sigma Aldrich	56-81-5	-20 °C 保存，稀释比例：1:100
山羊抗鸡 IgY（H+L）二抗，Alexa Fluor 647	Invitrogen	A32933	室温保存
山羊抗小鼠IgG（H+L）二抗，DyLight 488	Invitrogen	35502	4°C 保存 °C,  稀释比例：1:50
山羊抗小鼠 IgG（H+L）二抗，DyLight 550	Invitrogen	84540	4°C 保存 °C,  稀释比例：1:50
DyLight 488 标记山羊抗兔 IgG（H+L）二抗	Invitrogen	35552	4°C 保存 °C,  稀释比例：1:50
山羊抗兔IgG（H+L）二抗，DyLight 550	Invitrogen	84541	4°C 保存 °C
Harris 苏木精	明亮载玻片	2.BS01-104-1000
HepG2 细胞	ATCC	HB-8065	储存在氮气罐中
人/大鼠 OV-6 抗体 单克隆小鼠 IgG1 克隆 # OV-6	R&D Systems	MAB2020	-20℃保存 °C
水凝胶	康宁	354248	Matrigel，高浓度（HC）无LDEV型基底膜基质，10 mL，-20储存 °C
水凝胶	康宁	354234	Matrigel，无LDEV基底膜基质，10 mL，-20℃保存 °C
水凝胶	赛默飞世尔科技	A1413201	Geltrex，无LDEV低生长因子基底膜基质
水凝胶	Biotechne, R&D Systems	BME001-01	Cultrex Ultramatrix RGF BME，储存于 -20 °C
卡诺夫斯基固定液			2% PFA，2.5% 戊二醛溶于0.15 M卡考基酸缓冲液，含2 mM CaCl₂2；现配；用于透射电镜 &和扫描电镜样品
L-天冬氨酸	Sigma	11189-100G	室温保存
铅天冬氨酸溶液			将40 mg天冬氨酸溶解于10 mL ddH₂O中2O，并加入66 mg硝酸铅。溶液在60 ℃下稳定 °C，并调节pH至5；现配现用
硝酸铅	电子显微镜科学公司	17900	室温保存
徕卡共聚焦显微镜	Leica	DMi8
LSM 700 激光扫描共聚焦显微镜	蔡司
酶标仪	Biotek Synergy
多功能装置（MD）	Cellorama	CellO-M
细胞核DNA染料	Invitrogen	H3569	Hoechst 33258，五水合物（双苯并咪唑）－ 水溶液，10 mg/mL，4 °C 保存 °C
细胞核DNA染料	ThermoFischer Scientific	62248	DAPI 溶液，于 +4 ℃ 保存 °C
四氧化锇（OsO₄）4) ,4%	电子显微镜科学公司	19190	用 dH₂O 稀释2O 以配制 2% 溶液；于 +4 ℃ 保存 °在密闭容器中于2-8°C避光保存
Ov6 抗体	R&研发系统	MAB2020	4°C 保存 °C
4% 甲醛溶液（PFA）	Sigma	1.04005.1000	将4% PFA溶解于dH₂O中2O并煮沸，冷却后分装；于-20℃保存 °C
4% PBS 甲醛溶液，1 L	Santa Cruz Biotechnology	sc-281692	4°C 保存 °C
磷酸盐缓冲液（PBS），片剂	MP Biomedicals, LLC	2810305
后固定液			%2 OsO4，%2.5 亚铁氰化钾在dH₂O中2O；现配
5% 亚铁氰化钾水溶液	电子显微镜科学公司	26603-01	室温保存
Primovert — 倒置明场显微镜 — ZEISS	蔡司	货号：491206-0001-000
圆底微量离心管，2 mL	巢	620611
配备STEM附件的扫描电子显微镜	Zeiss	GeminiSEM 500	我们使用 Inlens 二次电子（SE）探测器在 2–3 kV 条件下进行扫描电子显微成像，使用 aSTEM 探测器在 30 kV 条件下进行透射电子显微成像。
SensiTek HRP 抗多价试剂盒组合	ScyTek Laboratories	SHP125	4°C 保存 °C
0.4 M，pH 7.2 的二甲胂酸钠缓冲液	电子显微镜科学公司	11655	用 dH₂O 稀释2O，用于配制0.2 M溶液，并于+4℃保存 °C
钠/钾ATP酶α1抗体 [M7-PB-E9]	GeneTex	GTX22871	-20℃保存 °C
免疫荧光标记溶液（S-IF）	Cellorama	CellO-IF	4°C 保存 °C
免疫组织化学溶液（S-IHC）	Cellorama	CellO-P	4°C 保存 °C
标本修整装置	Leica	EM TRIM2	用于制备环氧树脂样品块以进行超薄切片
溅射镀膜仪	Leica	EM ACE200	用金/钯合金镀膜6 nm，时长90秒，对扫描电镜样品进行镀膜处理
硫代碳酰肼（TCH）	Sigma	223220-5G	用 dH₂O 稀释2O，配制0.5%溶液，并用0.22 μm滤膜过滤 µm 微孔滤膜；室温保存；现配现用
0.4% 台盼蓝溶液	Gibco	15250061
超凝胶强力胶	Pattex	PSG2C	将聚合后的环氧树脂包埋块连同样品粘附到环氧树脂包埋块持样器上
超薄切片机	Leica	EM UC7	用于制备高质量的超薄或半薄切片以进行透射电子显微镜（TEM）观察
通用移液器吸头，10 µL	巢	171215-1101
通用型移液器吸头，1000 µL	伊索拉布	L-002
通用移液器吸头，200 µL	巢	110919HA01
醋酸铀酰	电子显微镜科学公司	22400	用 dH₂O 稀释2O 制备 2% 溶液，并用 0.22 μm 滤膜过滤 µm 微孔滤膜；保持容器密闭，于室温保存