建立源自患者肿瘤样本的三维肿瘤球体并评估其对药物的敏感性

摘要

本实验方案描述了如何从原代癌细胞生成三维肿瘤培养模型，并通过细胞活力检测和显微镜观察评估其对药物的敏感性。

摘要

尽管在理解肿瘤生物学方面已取得显著进展，但进入临床试验的大多数肿瘤药物候选物仍以失败告终，通常原因是缺乏临床有效性。这一高失败率揭示了当前临床前模型在预测临床疗效方面的不足，主要在于其无法充分反映肿瘤异质性和肿瘤微环境。这些问题可通过利用来自个体患者肿瘤样本建立的三维（3D）培养模型（类球体）加以解决。相比无法体现肿瘤异质性的传统细胞系，这些3D培养模型更能真实反映实际生物学特征。此外，3D培养模型优于二维（2D）培养模型（单层结构），因为它们能够模拟肿瘤环境中的多种要素，如缺氧、坏死和细胞黏附，并维持细胞的天然形态和生长方式。本研究建立了一种从个体患者来源的癌细胞制备三维多细胞类球体原代培养物的方法。这些细胞可直接来源于患者的肿瘤组织或患者来源的异种移植瘤。该方法广泛适用于多种实体瘤（如结肠癌、乳腺癌和肺癌），且具有成本效益，可在常规癌症研究或细胞生物学实验室中完成，无需依赖特殊设备。本文提供了一种从原代癌细胞生成3D肿瘤培养模型（多细胞类球体）并利用两种互补方法评估其药物敏感性的实验方案：细胞活力检测（MTT法）和显微镜观察。这些多细胞类球体可用于评估潜在药物候选物、发现潜在生物标志物或治疗靶点，并研究治疗反应与耐药机制。

引言

体外和体内研究是开发癌症治疗方法的两种互补途径。体外模型能够控制大多数实验变量，便于进行定量分析，常作为低成本的筛选平台，也可用于机制研究¹。然而，其生物学相关性本质上有限，因为这类模型仅能部分反映肿瘤微环境¹。相比之下，体内模型（如患者来源的异种移植模型，PDX）能够更好地模拟肿瘤微环境的复杂性，更适合用于转化研究以及个体化治疗（即研究来源于特定患者的模型对药物的反应）¹。然而，体内模型不适用于高通量药物筛选，因为其实验参数难以像体外模型那样精确控制，且模型构建过程耗时长、劳动强度大、成本高^1,2。

体外 模型已有100多年的历史，细胞系已有70多年的历史³然而，在过去几十年中，可用的复杂性 体外 实体瘤模型的复杂性已显著增加。这种复杂性涵盖了从二维（2D）培养模型（单层结构），包括来源于肿瘤的永生化细胞系或原代细胞系，到近年来涉及三维（3D）模型的更先进方法¹在二维模型中，一个关....

方案

用于原代肿瘤细胞培养的人类肿瘤样本采集，均按照拉宾医学中心经机构审查委员会（IRB）批准的方案进行，并取得患者的书面知情同意。符合本研究参与资格的患者包括患有非转移性乳腺癌、结肠癌、肝癌、肺癌、神经内分泌肿瘤、卵巢癌或胰腺癌的成年及儿童癌症患者，所有儿童癌症患者，以及所有转移性癌症患者。唯一的排除标准是无法提供知情同意。

1. 类球体的生成与收集

注意：原代肿瘤细胞的分离可按照 Kodak 等人⁸所述方法进行。重要的是，用于生成类球体的原代肿瘤细胞可直接来源于患者活检、切除等获取的样本，也可间接来源于患者来源的异种移植（PDX）模型中的肿瘤样本，如 Moskovits 等人⁹所述。

1. 通过取一个含有单层贴壁原代细胞培养物的小型培养瓶（T25），去除培养基，用PBS洗涤，然后加入1 mL 1× Accutase（一种细胞解离溶液），制备75%–100%融合度的贴壁原代肿瘤细胞培养物的单细胞悬液（参见 材料表在 37 °C 下孵育 3 分钟。
2. 通过加入5 mL细胞培养基（含10% FBS、1:100青霉素-链霉素、1%非必需氨基酸和1% L-谷氨酰胺的RPMI-1640培养基）中和Accutase溶液；参见

结果

本方案介绍了从原代肿瘤细胞生成均一球状体培养物的步骤，对药物在球状体培养中的疗效进行定量评估（MTT法），以及确定研究药物对球状体形态的影响。文中展示了由结肠癌和乳腺癌细胞培养物生成的球状体代表性实验数据。类似实验也使用其他肿瘤类型进行，包括胆管癌、胃癌、肺癌和胰腺癌（数据未显示）。本文所展示的所有实验均设三个重复。

图2展示了由原代结肠癌细胞培养生成的类球体。如图2所示，生成的类球体数量取决于最初接种至每个孔中的细胞数量。类球体生长至直径超过100 μm需要10–14天。肿瘤细胞的来源（例如不同患者、不同组织来源）决定了其生长速率。增加接种细胞数量并不能缩短类球体形成所需的时间，而只会增加形成的类球体数量。值得注意的是，在对结肠癌类球体进行长期培养后，它们开始相互黏附，形成葡萄串样的类球体簇（图3），这导致培养体系不均一，因而无法将这些类球体用于MTT实验。

讨论

本方案描述了一种从人类肿瘤样本中生成三维原代细胞培养物（球状体）的简便方法。这些球状体可用于多种分析，包括评估潜在药物候选物及药物组合、鉴定潜在生物标志物或治疗靶点，以及研究应答与耐药机制。该方案可使用直接来源于患者样本的原代肿瘤细胞，或来源于PDX模型的肿瘤细胞，后者可通过患者样本建立。后一种方法使得在 体外 和 体内 使用相同原发肿瘤进行的实验。既往研究已表明，在PDX模型及其衍生的3D培养体系的药物敏感性实验结果之间具有一致性。⁹，从而支持了这一点的相关性 体外/体内 方法

当前方案的主要优势包括其对大多数实体瘤具有广泛的适用性，以及具有较高的成本效益，后者源于该方案与癌症研究/细胞生物学实验室常见的设备和技术能力相兼容（即无需特殊设备或外包服务）。此外，当前方案可生成均一的类球体细胞群，从而能够使用高通量定量存活率检测方法（例如MTT法）。生成均一的类球体细胞群对于获得有意义的实验结果至关重要，已有研究表明类球体的大小会影响其对治疗的反应。与较小的类球体不.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
5-氟尿嘧啶	TEVA Israel	批号 16c22NA	氟尿嘧啶，Adrucil
Accutase	Gibco	A1110501	StemPro Accutase 细胞解离试剂
顺铂	TEVA Israel	20B06LA	Abiplatin,
Cultrex	Trevigen	3632-010-02	基底膜基质，3型
DMSO（二甲基亚砜）	Sigma Aldrich	D2650-100ML
胎牛血清（FBS）	Thermo Fisher Scientific	2391595
荧光计 ELISA 阅读仪	Biotek	Synergy H1	Gen5 3.11
盐酸（HCl）	Sigma Aldrich	320331	用于终止液
ImageJ	美国国立卫生研究院，马里兰州贝塞斯达，美国	版本 1.52a	开源软件 ImageJ
异丙醇	Gadot	P180008215	用于终止液
L-谷氨酰胺	Gibco	1843977
MTT	Sigma Aldrich	M5655-1G	3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四氮唑溴盐
非必需氨基酸	Gibco	11140050
帕博西尼	Med Chem Express	CAS # 571190-30-2
PBS	Gibco	14190094	杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）*不含钙和镁
青霉素–链霉素	Invitrogen	2119399
无酚 RPMI 1640	Biological industries, 中国台湾	01-103-1A
移液槽	Alexred	RED LTT012025
RPMI-1640 培养基	Gibco	11530586
舒尼替尼	Med Chem Express	CAS # 341031-54-7
曲妥珠单抗	F. Hoffmann - La Roche Ltd, 巴塞尔, 瑞士	10172154 IL	赫赛汀
0.5% 台盼蓝溶液	Biological industries, 中国台湾	03-102-1B
超低吸附 96 孔板	Greiner Bio-one	650970
长春瑞滨	Ebewe	11733027-03	Navelbine