本研究的目的是证明基于浮力的分离方法在分离、激活和扩增原代人T细胞方面的可行性。
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本文内容
摘要
摘要
从外周血单个核细胞中分离T细胞的过程 细胞（PBMCs）以建立 离体 培养物对于科研、临床检测以及基于细胞的治疗至关重要。本研究中，我们介绍了一种简单且新颖的方案，用于从外周血单个核细胞（PBMCs）中分离、活化并扩增T细胞。 离体 介绍了一种利用功能化浮力激活细胞分选（BACS）技术分离和激活T细胞的研究方法。简而言之，该方案包括通过阳性选择富集CD3+ 来自白细胞分离包（leukopak）来源的外周血单个核细胞（PBMCs）的T细胞，在转导前于24孔板中与预先结合抗CD28的链霉亲和素微泡（SAMBs）共刺激48小时。功能化微泡提供了一种独特的浮力激活细胞的方式，可诱导促进增殖的表型，从而在最小耗竭的情况下实现细胞扩增。该技术通过使共刺激微泡保持浮力并返回培养基上层，减少了扩增中的T细胞与共刺激因子接触的时间，从而降低细胞耗竭程度。结果表明，分离并培养的T细胞获得了足以激活和增殖的刺激信号，但未达到过度激活的程度，因此避免了因PD-1过度表达所提示的细胞耗竭现象。
引言
目前全球正在进行超过500项嵌合抗原受体（CAR）-T细胞疗法的临床试验，已有四种CAR-T细胞治疗产品上市1。然而，为了提高这些具有潜在治愈性疗法的有效性、可扩展性和长期成功率，CAR-T细胞研究与生产方面仍存在诸多需求亟待解决2,3,4,5。过继性CAR-T细胞临床研究与生产始于从外周血样本中分离T细胞，随后对分离的细胞进行刺激、转导和扩增。在选择用于CAR-T细胞研究与生产的细胞分离和刺激技术时，必须仔细考虑T细胞回收率、纯度以及激活/耗竭信号等参数3,4,6。尤为重要的是，需要通过减少现有生产工艺所导致的生物学障碍（例如T细胞耗竭），来改善CAR-T细胞疗法的治疗持久性，从而增强其治疗效果6,7。
作为一种替代传统细胞分离方法（如荧光激活细胞分选（FACS）和磁激活细胞分选（MACS））的技术，本文展示了利用微泡进行T细胞分离的浮力激活细胞分选（BACS）。微泡分离技术利用具有浮力的中空微球（微泡）与目标细胞结合，并将其上浮至液体样本表面8,9。通过将抗体（例如抗CD3抗体）修饰在微泡表面，可从外周血样本中正向筛选出目标T细胞群体。随后，本研究进一步展示了使用另一类抗体修饰的微泡（例如抗CD28抗体）在悬浮状态下共刺激并激活已富集的T细胞。微泡技术提供了一种简单且高度可调的分离与激活工作流程，所获得的T细胞可直接用于悬浮细胞培养以及后续应用，如基因修饰和扩增。关键的是，利用微泡进行浮力驱动的细胞激活能够适度控制细胞刺激，从而避免T细胞过度耗竭7。
本研究中，流式细胞术是用于分析功能化微泡的分离、活化及转导效果的主要工具，同时可提供转导后细胞生长与扩增阶段中特定亚群的详细信息。除流式细胞术外，还采用明场和荧光显微镜观察以确认细胞活性、形态及转导效果。根据这些结果，微泡技术及其操作方案相较于目前常用的常规分离与活化方法，提供了一种更可调控且更温和的替代方案；特别是，经微泡活化的细胞表现出显著低于行业标准工具和试剂盒处理组的T细胞耗竭标志物表达水平。
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方案
1. 使用微泡通过阳性选择分离T细胞
注意：本方案详细介绍了使用 SAMBs 进行小规模 CD3+ 阳性筛选的方法。
- 将3 × 108个 commercially obtained PBMCs 与2.5 mL分离缓冲液及生物素标记的抗CD3（OKT3）抗体混合，抗体终浓度为每百万个细胞25 ng（25 ng/M）。用移液器轻柔吹打混匀，室温孵育10分钟。
- 根据生产商提供的SAMB浓度，按0.5（SAMB数量）:1（细胞数量）的比例加入链霉亲和素微泡（SAMBs）。
- 使用商用的翻转混合仪（end-over-end, EOE）在室温下以20 rpm转速混合10–15分钟。随后在室温下以400 × g 离心5分钟。
- 离心后，被正向选择的细胞将与SAMBs一起位于悬液上层，未被选择的剩余细胞则形成沉淀位于管底。使用9英寸玻璃移液管，将管尖插入气泡-细胞层下方至管底，用电子移液器吸取细胞沉淀及下层液体，并转移至新管中。
2. 共刺激（激活）经阳性选择的T细胞
- 用1 mL完全T细胞培养基（或其他所需培养基）重悬原始管中剩余的气泡-细胞层。
- 使用自动细胞计数仪结合明场显微镜对下层液中的细胞进行计数，并从初始细胞数中减去该数值，以确定被捕获在气泡-细胞层中的细胞数量。
- 在此步骤之前，将生物素标记的抗CD28抗体与商用SAMBs混合，孵育至少2小时，以制备偶联了抗CD28抗体的SAMBs。请联系SAMBs生产商以确定偶联所需的抗CD28抗体用量。按照1.5（抗CD28 SAMBs）:1（细胞）的比例，将偶联抗CD28的SAMBs加入第2.1步所得的气泡-细胞悬液中。
- 使用EOE旋转混匀15分钟，然后根据第2.2步获得的细胞数量，用完全T细胞培养基或其他所需培养基调整总体积至每毫升含200万细胞。
3. 在细胞培养基中扩增共刺激细胞
- 将步骤2.4中活化的细胞以每孔1 mL、浓度为2 M/mL接种至24孔板中。在37 °C、含5% CO2的湿化培养箱中孵育。
- 24小时后，根据第0天接种的初始细胞数量计算，加入终浓度为50 U/mL的IL-2和25 ng/mL的可溶性抗CD3抗体（OKT3），以进一步促进细胞扩增。将细胞板放回湿化CO2培养箱中，于37 °C过夜孵育。
4. 可选：用慢病毒转导活化的T细胞
注意：此处使用的方法改编自 Prommersberger 等人.10。
- 将慢病毒在室温下解冻，并用移液器轻轻混匀。
- 轻轻吸出上清液，每孔取出 600 µL，注意不要触碰已沉降至孔底的子代细胞，也不要扰动仍停留在溶液表面的气泡层。
- 每孔加入 5 µg/mL 的六亚甲基溴化铵以增强病毒转导效率。按感染复数（MOI）为 3（即每个细胞感染 3 个慢病毒颗粒）加入慢病毒颗粒。
- 将培养板在 32 °C 条件下，以 800 × g 离心 45 分钟，加速度设为慢速，减速时不用刹车。随后将细胞置于 37 °C、湿润的 CO2 培养箱中孵育 4 小时。
- 孵育 4 小时后，每孔加入 600 µL 商品化的新鲜完全 T 细胞培养基和 50 U/mL 的 IL-2，然后将细胞培养板放回 37 °C、湿润的 CO2 培养箱中继续进行 T 细胞扩增。
5. T细胞的扩增（可选择是否预先转导）
- 每2天从中间培养基中移除一半的培养液，更换为新鲜的完全T细胞培养基，并加入白细胞介素-2（IL-2），使其终浓度为50 U/mL。
- 每周计数T细胞两次，以评估细胞密度。当细胞密度超过2 × 106–2.5 × 106 个细胞/mL时，将细胞转移至更大的容器中，并稀释至5 × 105 个细胞/mL。
6. T细胞的收获与流式细胞术
- 用移液器轻轻吹打混匀每个孔中的内容物。吸出孔内全部液体，包括微小气泡，并转移至一个1.5 mL离心管中。
- 用400 µL无钙无镁的DPBS（−/−）洗涤每个孔，并将洗涤液转移至1.5 mL离心管中。在室温下以400 × g 离心5分钟。
- 吸去上清液，将细胞沉淀重悬于50 µL分离缓冲液中。
- 加入活化与耗竭抗体/染色混合液，在室温避光孵育10分钟。染色混合液配制如下：活化染色液：AF700-CD3、PE/Dazzle-CD4、PE/Cy7-CD8、BV510-CD25、PE-CD69；耗竭染色液：AF700-CD3、PE/Dazzle-CD4、PE/Cy7-CD8、PE-PD-1。
- 加入1 mL分离缓冲液，轻轻混匀。在室温下以400 × g离心5分钟，以去除多余的抗体。彻底吸去上清液。
- 将细胞沉淀重悬于1 mL分离缓冲液中，并转移至适当的容器（例如FACS管、96孔板等）进行流式细胞术分析。推荐的流式细胞术分析设门策略详见图1。
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结果
T细胞从购买的外周血单个核细胞（PBMCs）中分离，并按照方案所述进行铺板以激活。阴性对照样本（购买的PBMCs）未进行激活。设置这些对照样本旨在展示微泡激活过程对实验样本的影响，与未经处理且未受刺激的T细胞对照相比，确保所观察到的激活标志物是由于添加的激活因子引起，而非T细胞自身固有的特性。根据图2中的实验设计，将细胞以2 × 106 个细胞/mL的密度接种于T细胞培养基中，分别保持未处理/未刺激状态，或使用抗CD3（克隆OKT3）和抗CD28（克隆28.2）偶联的链霉亲和素修饰微泡（SAMBs）进行共刺激。在培养中刺激48小时后，用编码zsGreen的慢病毒颗粒对细胞进行转导。在转导后第4天和第6天，对细胞进行成像、收集，并使用AF700-CD3、PE/Dazzle-CD4、PE/Cy7-CD8、BV510-CD25、PE-PD-1（或根据是否使用耗竭或激活检测面板分别使用PE-CD69）以及7-AAD进行表面染色。zsGreen转基因可在FITC通道中检测到。流式细胞术的设门策略详见图1。与...
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讨论
本方案描述了从外周血单个核细胞（PBMC）样本中分离T细胞，并利用微泡在培养基中激活悬浮T细胞的方法。该方法依赖于经过功能化的微泡，其固有的浮力可为细胞提供共刺激信号，在细胞悬浮于培养基中时实现激活，从而减少扩增中的细胞受到持续刺激的时间；过度刺激可能导致T细胞耗竭标志物表达升高，降低其治疗效果11。被激活的T细胞会附着在功能化微泡上并随其上浮，产生的未直接受刺激的子代细胞则沉降至细胞培养板底部进行扩增，使其在远离浮力驱动的刺激因子的环境中经历一段生长时期。已有文献详细指出，将分离的T细胞长时间暴露于刺激因子（如基于磁珠的方法）12，可能对细胞扩增能力及治疗效能产生不利影响6,7,11。
由于本报告的实验方案依赖于对 CD3+ 细胞的阳性筛选，在该方案的分离阶段，必须小心且彻底地移...
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披露
所有作者在提交时均为 Akadeum Life Sciences 的员工，该公司生产并销售微泡分离产品。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 2-巯基乙醇 | Gibco | 21985-023 | CAS: 60-24-2 |
| Biologix 多孔培养板 24 孔板 | VWR | 76081-560 | |
| 生物素标记抗人 CD28 (28.2) 抗体 | Biolegend | 302904 | |
| 生物素标记抗人 CD3 (OKT3) 抗体 | Biolegend | 317320 | |
| 不含钙、镁的 DPBS | Gibco | 14190-136 | |
| GlutaMAX 添加剂 | Thermofisher | 35050061 | |
| 人重组 IL2 | BioVision (vwr) | 10006-122 | |
| 慢病毒颗粒 rLV.EF1.zsGreen1-9 | Takara Bio | 0038VCT | |
| 白细胞分离物（Leukopak） | BioIVT | HUMANLMX100-0001129 | |
| 正常人外周血单个核细胞（PBMCs） | BioIVT | HUMANHLPB-0002562 | |
| 组织培养用青霉素/链霉素 100X 溶液 | VWR | 97063-708 | CAS: 8025-06-7 |
| 聚凝胺感染/转染试剂 | Millipore Sigma | TR-1003-G | CAS:28728-55-4 |
| 混合人 AB 血清（血浆来源，热灭活） | Innovative Research | ISERABHI100mL | |
| RPMI 1640 培养基，含 GlutaMAX 添加剂和 HEPES | Gibco | 72400047 | |
| 链霉亲和素微泡分选试剂盒（包含 Akadeum 分离缓冲液） | Akadeum | 11110-000 |
参考文献
- Albinger, N., Hartmann, J., Ullrich, E. Current status and perspective of CAR-T and CAR-NK cell therapy trials in Germany. Gene Therapy. 28 (9), 513-527 (2021).
- Tyagarajan, S., Spencer, T., Smith, J. Optimizing CAR-T cell manufacturing processes during pivotal clinical trials. Molecular Therapy. Methods & Clinical Development. 16, 136-144 (2019).
- Stock, S., Schmitt, M., Sellner, L. Optimizing manufacturing protocols of chimeric antigen receptor T cells for improved anticancer immunotherapy. International Journal of Molecular Sciences. 20 (24), 6223(2019).
- Rohaan, M. W., Wilgenhof, S., Haanen, J. B. A. G. Adoptive cellular therapies: The current landscape. Virchows Archiv. 474 (4), 449-461 (2019).
- Abou-El-Enein, M., et al. Scalable manufacturing of CAR T cells for cancer immunotherapy. Blood Cancer Discovery. 2 (5), 408-422 (2021).
- Poltorak, M. P., et al. Expamers: A new technology to control T cell activation. Scientific Reports. 10, 17832(2020).
- Kagoya, Y., et al. Transient stimulation expands superior antitumor T cells for adoptive therapy. JCI Insight. 2 (2), 89580(2017).
- Snow, T., Roussey, J., Wegner, C., McNaughton, B. Application No. 63/326,446. US Patent. , 63/326,446 (2022).
- McNaughton, B., et al. Application No. 16/004,874. US Patent. , 16/004,874 (2018).
- Prommersberger, S., Hudecek, M., Nerreter, T. Antibody-based CAR T cells produced by lentiviral transduction. Current Protocols in Immunology. 128 (1), 93(2020).
- Wijewarnasuriya, D., Bebernitz, C., Lopez, A. V., Rafiq, S., Brentjens, R. J. Excessive costimulation leads to dysfunction of adoptively transferred T cells. Cancer Immunology Research. 8 (6), 732-742 (2020).
- Li, Y., Kurlander, R. J. Comparison of anti-CD3 and anti-CD28-coated beads with soluble anti-CD3 for expanding human T cells: Differing impact on CD8 T cell phenotype and responsiveness to restimulation. Journal of Translational Medicine. 8, 104(2010).
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重印与许可
