使用微泡从人外周血单核细胞样品中分离、活化和扩增基于浮选的 T 细胞

摘要

本研究的目的是证明基于浮选的分离在分离、激活和扩增原代人T细胞方面的可行性。

摘要

从外周血单核细胞 （PBMC） 中分离 T 细胞以建立 离体 培养的过程对于研究、临床试验和基于细胞的治疗至关重要。在这项研究中，提出了一种简单、新颖的方案，用于 离体从 PBMC中分离、激活和扩增T细胞。本研究利用功能化的浮力激活细胞分选（BACS）技术来分离和活化T细胞。简而言之，该方案涉及从白细胞衍生的PBMC中正向选择CD3 ⁺ 细胞，然后在24孔板中转导之前与预缀合的抗CD28结合链霉亲和素微泡（SAMB）共刺激48小时。功能化的微气泡提供了浮力激活细胞的独特机会，导致增殖表型，允许以最小的消耗进行扩增。该技术减少了疲惫，因为共刺激微泡保持浮力并返回培养基的顶部，从而减少了扩增细胞与共刺激因子接触的时间。结果表明，分离和培养的T细胞接受足够的刺激来激活和增殖，但未达到导致过度激活的程度，从而导致耗尽，如过量PD-1的存在所证明的那样。

引言

目前全球正在进行500多项嵌合抗原受体（CAR）-T细胞治疗临床试验，市场上有四种CAR-T细胞治疗产品¹。然而，仍然存在许多CAR-T细胞研究和制造需求，必须解决这些需求，以提高这些潜在疗效疗法的疗效，可扩展性和长期成功²，³，^4，5。过继CAR-T细胞临床研究和制造始于从外周血样本中分离T细胞以及随后对分离细胞的刺激，转导和扩增。在为CAR-T细胞^{研究和制造选择}细胞分离和刺激技术时，需要仔细考虑T细胞回收率，纯度和活化/耗竭信号等参数3，^4，6。重要的是，需要通过最大限度地减少当前制造过程产生的生物障碍（例如T细胞耗竭）来提高CAR-T细胞疗法的治疗持久性，以提高治疗效果6^，7。

作为荧光激活细胞分选（FACS）和磁激活细胞分选（MACS）等传统细胞分离方法的替代方案，这里展示了带有微气泡的浮力激活细胞分选（BACS）用于T细胞分离。微气泡分离使用浮力、空心微球（微气泡）结合目标并将其漂浮到流体样品的表面^8，9。通过用抗体（即抗CD3）功能化微泡，可以从外周血样本中积极选择所需的T细胞群。随后，在这项工作中证明了使用不同抗体功能化微泡群（即抗CD28）来共刺激和激活悬浮液中的阳性选择T细胞。微气泡提供了一种简单且高度可调的分离和活化工作流程，可产生可用于悬浮细胞培养和下游应用（如基因修饰和扩增）的 T 细胞。至关重要的是，微气泡的浮力细胞活化可促进抑制细胞刺激，以防止过度的T细胞衰竭⁷。

在这项研究中，流式细胞术是用于分析功能化微泡的分离、活化和转导成功的主要工具，以及提供有关转导后生长和扩增阶段存在的特定亚群的详细信息。除流式细胞术外，还使用明场和荧光显微镜来确认细胞健康、形态和转导成功。基于这些结果，微气泡技术和方案为目前使用的传统分离和活化方法提供了一种更可调和更温和的替代方案;特别是，微泡激活细胞的T细胞耗竭标志物的表达明显低于行业标准工具和试剂盒通常观察到的表达。

方案

1. 使用正向选择用微泡分离T细胞

注意:该协议详细介绍了使用SAMB的小规模CD3 ⁺ 阳性选择方法。

1. 在 2.5 mL 的分离缓冲液中与生物素化抗 CD3 （OKT3） 抗体孵育 3 x 10 8^{个商业获得} 的 PBMC，浓度为 25 ng/100 万个细胞 （25 ng/M）。通过上下移液轻轻混合，并在室温下孵育10分钟。
2. 根据制造商报告的SAMB浓度，以0.5（SAMB量）:1（细胞量）的比例添加链霉亲和素微泡（SAMB）。
3. 在室温下以20rpm使用商用端到端（EOE）旋转器混合10-15分钟。在室温下以400× g 离心5分钟。
4. 离心后，阳性选择的细胞将与SAMB一起位于悬浮液的顶部。剩余的未选择细胞将位于管底部的细胞沉淀中。使用9英寸玻璃移液器，将气泡细胞层下方的尖端插入管底部，用电动移液管吸出细胞沉淀和下清液，然后将它们转移到新管中。

2. 阳性选择的T细胞的共刺激（激活）

1. 将原始管中剩余的气泡细胞层重悬于 1 mL 的完整 T 细胞培养基（或其他所需培养基）中。
2. 使用自动细胞计数器用明场显微镜计数清液中的细胞，并从起始细胞数中减去该值以确定气泡细胞层中捕获的细胞数。
3. 在此步骤之前，将生物素化的抗CD28抗体与商业SAMB混合至少2小时，以产生偶联的抗CD28 SAMB。请联系 SAMB 制造商以确定偶联所需的抗 CD28 抗体量。将抗CD28偶联的SAMB添加到步骤2.1产生的气泡细胞悬液中，使用1.5（抗CD28 SAMB）:1（细胞）的比例。
4. 使用EOE旋转混合15分钟，然后根据步骤2.2中获得的细胞数，将总体积与完整的T细胞培养基或其他所需培养基调节至每mL200万个细胞。

3. 细胞培养基中共刺激细胞的扩增

1. 在 24 孔板中以每孔 2 M/mL 的浓度分配步骤 2.4 中的 1 mL 活化细胞。在37°C的加湿5%CO₂ 培养箱中孵育。
2. 24小时后，加入50U / mL的IL-2和25ng / M的可溶性抗CD3（OKT3）以进一步促进扩增，使用第0天接种的初始细胞数计算。将细胞板放回加湿的CO₂ 培养箱中，并在37°C下孵育过夜。

4.可选:用慢病毒转导活化的T细胞

注意:此处使用的方法改编自Prommersberger等人。¹⁰.

1. 在室温下解冻慢病毒，并通过移液短暂混合。
2. 从每个孔中轻轻取出600 μL的中清液，不要接触现在位于孔底部的子细胞或残留在溶液表面的气泡层。
3. 每孔加入 5 μg/mL 六二甲基溴化物以增强病毒转导。以3（每个细胞的慢病毒颗粒）的感染多重性（MOI）添加慢病毒颗粒。
4. 在800× g 和32°C下使用慢速加速和不中断减速将板离心45分钟。将细胞在37°C的加湿CO₂ 培养箱中孵育4小时。
5. 4小时后，向每个孔中加入600μL市售的新鲜完整T细胞培养基和50U / mL的IL-2，并将细胞板放回37°C的加湿CO₂ 培养箱中用于T细胞扩增。

5. T细胞扩增（有或没有事先转导）

1. 每2天，从中清液中取出一半的培养基，用新鲜的完整T细胞培养基代替，并加入浓度为50U / mL的IL-2。
2. 每周两次计数T细胞以评估细胞密度。当细胞密度超过 2 x 10 6-2.5 x 10⁶ 细胞/mL 时，将细胞转移到更大的容器中，将其稀释至 5 x 10⁵ 细胞/mL。

6. 收获T细胞和流式细胞术

1. 通过上下移液轻轻混合每个孔的内容物。取出孔的全部内容物，包括微气泡，并将它们转移到 1.5 mL 管中。
2. 用 400 μL 无钙和无镁 DPBS （−/−） 洗涤每个孔，并将溶液转移到 1.5 mL 管中。在室温下以400× g 离心5分钟。
3. 吸出上清液，并将细胞沉淀重悬于50μL分离缓冲液中。
4. 用活化和耗尽抗体/染色混合物染色，并在室温下在黑暗中孵育10分钟。按如下方式制备染色鸡尾酒 - 活化鸡尾酒:AF700-CD3，PE / 炫目-CD4，PE / Cy7-CD8，BV510-CD25，PE-CD69;疲惫鸡尾酒: AF700-CD3， PE/炫目-CD4， PE/Cy7-CD8， PE-PD-1.
5. 加入 1 mL 分离缓冲液，轻轻混合。在室温下以400×g离心5分钟以洗去多余的抗体。完全吸出上清液。
6. 将细胞沉淀重悬于 1 mL 分离缓冲液中，并转移到适当的容器（例如，FACS 管、96 孔板等）中进行流式细胞术分析。推荐的流式细胞术分析设门方案详见 图1。

结果

从购买的PBMC中分离T细胞并按照协议中所述进行接种活化。阴性对照样品（购买的PBMC）未激活。包括这些对照样品是为了证明微气泡活化过程对实验样品的影响与未接触和未刺激的T细胞对照相比，确保观察到的活化标志物是添加活化因子的结果，而不是T细胞本身固有的。根据图2中的实验大纲，将细胞以2 x 10⁶个细胞/ mL接种在T细胞培养基中，并且未接触/未刺激或与抗CD3（克隆OKT3）和抗CD28（克隆28.2）SAMB共刺激。在培养物中刺激48小时后，用编码zsGreen的慢病毒颗粒转导细胞。在转导后4天和6天，使用AF700-CD3，PE / Dazzle-CD4，PE / Cy7-CD8，BV510-CD25，PE-PD-1（或PE-CD69，取决于是否使用耗尽或激活面板）和7-AAD对细胞进行成像，收获和表面染色。zsGreen转基因在FITC通道中可检测到。流式细胞术门控方法详见图1。在对照样品和接受微气泡共刺激的细胞之间观察到活T细胞数量和转基因阳性T细胞的增加（

讨论

所述协议允许从PBMC样品中分离T细胞，并用微气泡激活培养基中的悬浮T细胞。该方法依赖于功能化的微气泡，其固有的浮力提供了向细胞引入共刺激信号并在它们悬浮在培养基中时激活它们的独特机会，从而减少膨胀细胞暴露于长时间刺激;这种过度刺激可导致T细胞耗竭标志物的表达增加和治疗效果降低¹¹。浮力附着在功能化微气泡上的受刺激T细胞产生未触及的子细胞，这些子细胞下降到细胞培养板的底部进行扩增，从而允许一段时间远离浮力刺激因子的生长。文献中已经详细说明了分离的T细胞长时间暴露于刺激因子（例如基于磁珠的方案12）如何对扩增和治疗效果产生不利影响6，^7，11。

由于该报告方案依赖于CD3 ⁺ 细胞的正向选择，因此在该协议的分离阶段仔细但彻底地去除气泡细胞层下方的清液至关重要。这确保了只有阳性选择的T...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
2-巯基乙醇	Gibco	21985-023	CAS：60-24-2
Biologix 多孔培养板 24 孔板	VWR	76081-560
生物素抗人 CD28 （28.2） 抗体	Biolegend	302904
生物素抗人 CD3 （OKT3） 抗体	Biolegend	317320
DPBS，无钙，无镁	Gibco	14190-136
GlutaMAX 补充剂	Thermofisher	35050061
人重组 IL2	BioVision （vwr）	10006-122
慢病毒颗粒 rLV.EF1.zsGreen1-9	Takara Bio	0038VCT
Leukopak	BioIVT	HUMANLMX100-0001129
正常人 PBMC	BioIVT	HUMANHLPB-0002562
青霉素/链霉素 100X 用于组织培养	VWR	97063-708	CAS：8025-06-7
聚凝胺感染/转染试剂	Millipore Sigma	TR-1003-G	CAS：28728-55-4
混合人 AB 血清血浆衍生热灭活	创新研究	ISERABHI100mL
RPMI 1640 培养基、GlutaMAX 补充剂、HEPES	Gibco	72400047
链霉亲和素微泡试剂盒（包括 Akadeum 的分离缓冲液）	Akadeum	11110-000