方法文章

从小鼠脑组织中分离突触组分的亚细胞分级分离法

DOI：

10.3791/64574

⸱

2022年9月14日

 ,  , 
1Department of Neurology, Yale University, 2Department of Neuroscience, Yale University, 3Interdepartmental Neuroscience Program, Yale University

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本方案提供了一种可靠且详细的方法，用于从小鼠脑组织中获取高纯度的突触体、突触小泡及其他突触组分。该方法可实现对突触过程的评估，包括在区室分辨率下对蛋白质定位和功能进行生物化学分析。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

突触末梢是神经元间信息传递的主要部位。突触功能障碍是多种神经精神疾病和神经系统疾病的重要特征。因此，通过亚细胞分级分离技术对突触亚区室进行生化表征，是揭示正常与疾病状态下突触过程分子机制的有力方法。本实验方案描述了从小鼠脑组织中分离突触末梢及突触亚区室的亚细胞分级分离方法。首先，在脑组织匀浆后，分离出封闭的突触末梢结构，即突触体。突触体包含神经元的突触前和突触后区室，其膜结构已掐断并封闭。这些结构保持代谢活性，是研究突触结构与功能的宝贵材料。随后，将突触体进行低渗裂解和超速离心，以获得富含突触小泡、突触胞浆和突触质膜的突触亚区室。通过透射电子显微镜观察及针对突触亚区室特异性蛋白的生化富集分析，验证各组分的纯度。该方法简便且有效，适用于研究突触的结构与功能特性，以及多种脑部疾病的分子病因。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

突触是大脑的基本计算单元，神经元通过突触进行通信，并实现多种精细而复杂的功能。因此，突触对大脑健康至关重要1；突触功能障碍被认为是多种神经系统疾病的原因或结果2。突触由两个不同神经元的突触前和突触后终末组成，二者紧密相邻，中间由突触间隙分隔，其间分布有突触黏附分子。信息以称为神经递质的化学信使形式，从突触前成分传递至突触后成分1。参与神经递质传递的分子过程是当前研究的热点领域3,4,5。理解突触终末内的致病过程以及突触对神经元其他亚区室病变的响应，是应对脑部疾病的关键步骤1,2。多种方法学上的进展，主要应用于小鼠模型，推动了这一领域的研究6。通过差速离心法分离突触组分便是其中一种范式性突破方法，使得在健康与疾病状态下对突触过程进行深入评估成为可能。

成年人大脑包含800亿至900亿个神经元7,8。在啮齿类动物中，大鼠大脑约含有2亿个神经元，而小鼠则约有7000万个神经元9,10。每个神经元与由高度极化的神经元、胶质细胞及密集血管交织而成的网络形成数千个特异性的突触连接。在如此复杂且异质的组织中，曾难以想象能够将突触作为一个独立系统进行分离和研究。20世纪60年代，Victor Whittaker、Catherine Hebb 及其他研究者通过亚细胞分级分离技术成功实现了完整突触末梢的分离11,12,13,14。为了分离突触小泡（SVs），他们将脑组织在等渗（0.32 M）蔗糖溶液中通过液相剪切力进行匀浆，随后进行超速离心。由此获得了脱离的、由质膜包裹的完整神经末梢或膨大结构，并将其称为神经末梢颗粒（NEPs）11,13。由于这些结构保留了突触的结构与功能特性，NEPs 后来被命名为"突触体"，以与其他亚细胞器的命名保持一致13,15。值得注意的是，Eduardo de Robertis 及其同事提出了"突触小泡"这一术语，其研究工作与 Whittaker 等人的研究相互重叠，并为"突触体"的分离与表征提供了重要支持16,17,18。

突触体是具有生理活性的结构，包含神经递质储存、释放和再摄取所需的所有细胞与分子特性13,18。其在体外（in vitro）保留关键突触特征，并且不含非突触成分，这也增强了该分离方法的应用价值。突触体极大地促进了人们对神经传递化学与生理特性的理解，目前正被用于研究突触分子过程及其在疾病中的改变19,20,21,22,23。突触体也是分离突触组分的初始材料来源，例如突触小泡（SVs）、网格蛋白包被小泡（CCVs）、突触胞质、突触质膜、突触线粒体、突触黏附分子及其他感兴趣组分，有助于深入理解突触功能的分子机制18,19,20,24,25,26,27,28。这些亚突触组分可通过突触体的渗透裂解及蔗糖密度梯度超速离心获得15,29。尽管Whittaker研究团队最初建立的亚细胞分级分离方法在获取高质量突触体和突触小泡方面已被证实高效13,30，但近年来的优化进一步提高了亚细胞组分的纯度22,23,31,32。本文提供了一种高度详尽且易于操作的经典方案，用于小鼠脑组织的亚细胞分级分离，以获取突触体、突触小泡及其他亚突触组分。

方案

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

所有小鼠实验均经耶鲁大学机构动物护理与使用委员会（IACUC）批准（方案编号 2021-11117），并在国际实验动物评估和认可委员会（AAALAC）认证的设施中进行。动物的护理与饲养均遵循《实验动物护理与使用指南》。33 由耶鲁大学动物资源中心（YARC）提供。动物在12小时光照/12小时黑暗循环条件下饲养， 随意摄取 可自由获取食物和水。每种基因型或条件需要5至8只小鼠或2至4只大鼠进行以下实验方案。由于大鼠脑体积较大，所需数量较少。同样，实验动物的年龄可能影响组分得率；对于年龄小于2个月的动物，可能需要增加小鼠数量。除此之外，所述操作步骤适用于两种鼠类以及任何年龄的健康成年动物。本研究中展示的代表性数据使用了来自商业来源的野生型（C57BL/6J）小鼠（年龄=2个月；每次重复包括4只雄性和4只雌性） 材料表).

1. 实验准备

注意：本方案需要一名研究人员约11小时完成。强烈建议在实施本方案的前一天完成台面准备工作（图1）、缓冲液配制（表1）、离心机及转子预冷至4 °C，以及所需材料和仪器的收集与标记（参见材料表），如适用。

DNA提取的实验室设置；包括冰浴、微量管、工具；流程准备。
图1：实验台设置。 在进行脑组织解剖前，(A) Dounce玻璃匀浆器和(B) 所有缓冲液均预先在冰上预冷。(C) 蛋白酶抑制剂储备液在冰上解冻。另准备一个盛有湿冰的容器用于离心管，一个液氮杜瓦瓶（未显示），以及(D) 一个盛有干冰的容器，用于短期保存在液氮中速冻的样品。(E) 微量离心管已预先标记，因在本实验过程中，每种基因型或条件的每个亚细胞组分样品均需收集四份等分试样（节省时间的提示：在实验前一天彻底标记所有离心管）。(F) 合适的生物危害废物容器，(G) 70%乙醇，(H) 外科手术工具，以及(I) 吸水垫表面。实验所需的离心管和其他一次性耗材已单独放置，以便在执行方案时高效取用（未显示）。请点击此处查看该图的放大版本。

  1. 准备手术台面，收集脑组织切除所需的剪刀和镊子（见材料表）。按照图2所示，预先标记用于小鼠尾部活检的1.5 mL微量离心管，以及每种收集组分所需的四个试管。
  2. 准备两个装有湿冰的容器、一个装有干冰的容器，以及一个放置在台面上的液氮杜瓦瓶。
  3. 将苯甲基磺酰氟（PMSF）、抑肽酶A（pepstatin A）、抑肽酶（aprotinin）和亮抑蛋白酶肽（leupeptin）的储存液置于冰上解冻（见材料表）。配制所需缓冲液（表1）。
    注意：蔗糖溶液可预先配制并保存于4 °C。但由于蛋白酶抑制剂在水溶液中不稳定，因此所有缓冲液必须在实验开始前新鲜加入解冻后的抑制剂溶液或药片。此外，所有缓冲液均需使用无去垢剂的玻璃器皿和无去垢剂的水配制，以确保获得完整的突触体。
  4. 将所有缓冲液和玻璃Dounce匀浆器（见材料表）置于冰上预冷。将离心机设定为4 °C，并将转子预冷至4 °C。
  5. 在冰上的Dounce匀浆器中加入14 mL缓冲液A（表1）。

表1：亚细胞分级缓冲液的组成。 请点击此处下载该表格。

小鼠脑组织分馏示意图；突触体、囊泡分离、突触膜制备流程。
图 2：亚细胞组分分离实验流程概览。 亚细胞分级分离步骤及所收集样品的示意图总结。 请点击此处查看该图的放大版本。

2. 小鼠脑组织切除

用于教学研究的啮齿类动物头骨缝合线及颅部特征解剖图。
图3：颅面解剖结构。（A）小鼠头骨的背侧视图，标示了相关的颅部结构。（B）小鼠头骨及脑部的左侧外侧视图，标示了相关的颅部结构和解剖方向。虚线表示应进行切口的位置。请点击此处查看此图的放大版本。

  1. 在通风橱或生物安全柜内的麻醉室中，使用开放滴加法以100%异氟烷对每只小鼠进行深度麻醉34。通过颈椎脱位并迅速断头的方式处死每只小鼠。在处死和解剖过程中，交替进行不同基因型或实验组别的操作12。安乐死后，用精细剪刀切除尾尖约2 mm组织用于活检。将组织保存以备基因分型使用。
  2. 用70%乙醇喷洒断头后的小鼠头部，以防止毛发在解剖过程中粘附于组织和手术器械上。
  3. 将精细剪刀插入断头切口处的皮下，深入至颅骨膜层，沿中线做矢状切口，直至鼻间缝（图3A），以分离头皮与颅骨。
  4. 从枕部区域开始，向两侧颞部方向操作，修剪筋膜和肌肉，暴露颅骨外表面，直至两侧外耳道以外区域（图3B）。
  5. 用非惯用手固定头皮及颅骨前部。另一只手将精细剪刀插入枕骨大孔后缘2 mm处，此处可见脊髓穿出。沿中线切开，直至剪刀到达顶间骨内表面（图3；虚线所示）。
    注意：初始切开时，剪刀应与脊髓平行，并向颅骨内表面施加压力，以避免损伤脑干和小脑。
  6. 调整剪刀角度，使刀片与颅骨背侧表面平行。继续沿矢状方向向前推进切口，穿过顶骨和额骨，以矢状缝和额间缝为引导。持续施加向上的压力，以避免损伤大脑皮层。切口终止于鼻间缝稍前方（图3A）。
  7. 在鼻间缝前方，将剪刀垂直于颅骨，刀片分别置于鼻-前颌缝处，对鼻骨做一小段垂直切口（约3 mm），并完成一次均匀切割（图3；虚线所示）。
    注意：此步骤可更便于颅骨回缩，若需采集嗅球，则该操作尤为关键。
  8. 固定颅骨前部的同时，使用一对带纹理镊子的一侧轻轻将颅骨从脑组织上向上、向外侧及腹侧抬起。根据需要沿中线重复操作，并对另一侧半球进行相同处理，直至整个脑表面完全暴露。
  9. 使用弯头镊子或精细刮匙，轻轻抬起脑组织前部。切断视神经和颅神经，以完成脑组织与颅骨的完全分离。
  10. 针对每种实验条件，将五至八只小鼠的脑组织一同收集至预冷的玻璃Dounce匀浆器中，内含14 mL缓冲液A（表1）。

3. 突触体的制备

注意：本实验流程的示意图见图4。

突触体分离流程、离心示意图、生物化学分离方法、逐步操作
图 4：突触体制备。 第3步示意图，突触体（P2'）的制备过程。请点击此处查看该图的放大版本。

  1. 使用玻璃Dounce匀浆器在500 rpm条件下进行12次上下抽吸（总计）以匀浆脑组织。每次向下抽吸时短暂暂停，以确保组织充分匀浆。建议在冰浴中进行匀浆，以避免温度升高导致蛋白质变性。取5 µL样品用于通过双辛可宁酸法（BCA，参见材料表）测定蛋白浓度。取100 µL全脑裂解液样品用于蛋白质印迹（WB）。对于本步骤及后续所有样品（图2），均需分别取两份BCA样品和两份WB样品。将所有收集的样品在液氮中速冻，并于−80 °C保存。
  2. 将全脑匀浆液加入高速圆底离心管（14 mL）中（参见材料表），在4 °C条件下以800 × g离心10分钟，获得上清液（S1）。将S1转移至新的离心管中，保留沉淀（P1），后者含有完整细胞和细胞核。避免吸取絮状、白色、松散的表层沉淀。取2份各5 µL的S1用于BCA检测，以及2份各100 µL的S1用于WB检测。
  3. 将S1在4 °C条件下以9,000 × g离心15分钟，获得突触体上清液（S2）和粗制突触体沉淀（P2）。取2份各10 µL的S2用于BCA检测，以及2份各500 µL的S2用于WB检测。在保留样品后弃去上清液，并继续下一步操作。
  4. 将P2用3 mL预冷的含蛋白酶抑制剂的缓冲液A重悬，然后在4 °C条件下以9,000 × g离心15分钟，获得上清液（S2'）和洗涤后的突触体（P2'）。弃去上清液，保留沉淀。
  5. 将P2'用3 mL缓冲液A重悬。避免重悬沉淀底部深红色部分，该部分主要含有线粒体。取2份各20 µL的P2'用于BCA检测，以及2份各100 µL的P2'用于WB检测。
    注意：可通过轻轻吹打沉淀边缘和表面，使白色洗涤后的突触体重悬，同时将移液枪头避开沉淀中心的红色区域，从而实现此操作。

4. 低渗裂解

注意：本实验流程的示意图见图5。

低渗裂解步骤示意图；用于细胞破碎、分离与纯化的离心机设置。
图 5：低渗裂解。 第4步示意图，即突触体的低渗裂解，以生成裂解上清液（LS1）和突触体膜组分（LP1）。请点击此处查看该图的放大版本。

  1. 对于洗涤后突触体的低渗裂解，向重悬的 P2'（约 27 mL）中加入 9 倍体积的预冷缓冲液 B（表 1）。在玻璃 Dounce 匀浆器中匀浆突触体（以 500 rpm 进行三次上下抽提）。
  2. 将样品转移至 50 mL 带盖锥形离心管中。在 4 °C 冷室中，于旋转仪上旋转孵育 15 分钟。
  3. 在 4 °C 条件下，以 25,000 x g 离心 20 分钟，裂解后的 P2'，获得裂解上清液（LS1）和含有突触体膜的裂解沉淀（LP1）。取 2 份各 50 µL 的 LS1 用于 BCA 蛋白定量，另取 2 份各 400 µL 的 LS1 用于 WB 检测。将 LS1 转移至带盖离心管中，用于超速离心（见 材料表）。

5. 突触小泡的分离

注意：本实验流程的示意图见图6。

突触小泡和质膜分离示意图、离心及梯度过程。
图6：突触小泡分离与突触质膜分离。（A）第5步示意图，分离突触胞质组分（LS2）和突触小泡组分（LP2）；（B）第6步，通过蔗糖梯度超速离心获得髓鞘组分（MF）、突触质膜组分（SPM）和线粒体组分（Mito.）。请点击此处查看该图的放大版本。

  1. 将LS1在固定角转子超速离心机（见材料表）中于4 °C、100,000 × g 离心60分钟，以获得突触胞质上清液（LS2）和突触小泡沉淀（LP2）。LP2体积较小，呈半透明状，并紧密附着于离心管管壁。
  2. 用500 µL缓冲液A重悬LP2。使用23 G针头和1 mL注射器，轻轻吹打使LP2剪切。取2份各10 µL的LP2用于BCA蛋白定量，另取2份各250 µL的LP2用于WB检测。
  3. 将LS2（约30 mL）转移至截留分子量为10 kDa的离心过滤装置中（见材料表）。
    注意：若需保留小于10 kDa的蛋白质，可使用截留分子量为4 kDa的离心过滤装置，但离心时间将相应延长。
  4. 在4 °C、5000 × g 条件下离心最多1小时，将LS2浓缩至约0.5 mL。取2份各10 µL浓缩后的LS2用于BCA蛋白定量，另取2份各250 µL用于WB检测。开始离心后，请立即进入步骤6.1。

6. 突触浆膜的分离

  1. 将LP1（步骤4.3）重悬于1 mL缓冲液B中（表1）。取2份各10 µL的LP1用于BCA测定，另取2份各50 µL的LP1用于WB分析。用缓冲液B和缓冲液C（表1）将剩余的LP1调整至终体积为7.5 mL，终蔗糖浓度为1.1 M。
  2. 将7.5 mL重悬的LP1转移至14 mL超速离心管中（见材料表）。小心地在LP1上层覆盖3.75 mL缓冲液D（表1），然后再覆盖1.25 mL缓冲液A（或更大体积，以刚好填满至离心管顶部下方）。避免沿管壁加样，以免破坏蔗糖梯度界面。每次覆盖蔗糖组分后，用笔标记液面顶部位置。通过称重（而非体积）平衡超速离心管，使用缓冲液A逐滴添加，使重量差异控制在10 mg以内。在4 °C条件下，使用水平转子超速离心机（见材料表）以48,000 × g 离心2.5小时。
  3. 超速离心后获取完整梯度图像，以记录各蔗糖界面的清晰度及分馏效果。
  4. 小心移除表面的320 mM蔗糖层（缓冲液A）。在320 mM/855 mM蔗糖界面处收集髓鞘组分（MF），体积为800 µL。在855 mM/1.1 M蔗糖界面处收集突触质膜（SPM）组分，体积为1,000 µL。以环形方式从管壁处向上吸取各组分，确保完全收集。小心吸除剩余蔗糖溶液，并将线粒体沉淀（Mito.）重悬于200 µL缓冲液B中以回收。取2份各100 µL的MF用于BCA测定，另取2份各10 µL的Mito.用于BCA测定；将剩余的MF和Mito.样品均分为两份，用于WB分析。
  5. 用2倍体积的缓冲液B（约2 mL）稀释SPM组分，然后在3.5 mL离心管中使用固定角转子（见材料表），于4 °C以25,000 × g 离心20分钟。弃去上清液，将SPM沉淀重悬于缓冲液A中，终体积为250 µL。取2份各5 µL的SPM用于BCA测定，并将剩余SPM样品均分为两份，用于WB分析。
  6. 进行BCA测定以确定各样品的蛋白浓度，注意校正不同取样体积的影响。
    注：对于WB分析，建议所有亚细胞组分的工作蛋白浓度为2 µg/µL（对于LS1和MF组分，可达到的最高浓度亦可使用）。

结果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

该方法可获得11种脑亚细胞组分，可用于进一步纯化及多种下游分析35,36。评估突触体、突触小泡（SVs）23及其他组分质量的金标准方法是电子显微镜（EM）（图7）。也可通过针对特定亚细胞组分中存在蛋白的定量免疫印迹分析，评估各组分纯度的标志物（图8）。例如，对各组分进行免疫印迹分析显示，与初始全脑匀浆（Total）相比，N-钙黏蛋白（CDH2，UniProt名称）在突触质膜组分（SPM）中富集，α-突触核蛋白（SYUA）在突触胞质组分（LS2）中富集，突触素（SYPH）在突触小泡组分（LP2）中富集，髓鞘碱性蛋白（MBP）在髓鞘组分（MF）中富集（图8）。一旦确认组分纯度（例如，注意CDH2在LS2组分中缺失，或SYPH在LP2组分中富集数倍），即可利用定量免疫印迹分析确定目标蛋白的定位，或比较不同基因型或处理条件下蛋白分布的差异。明确突触蛋白的亚细胞定位有助于揭示此前未被描述的蛋白功能。此外，该方法在与功能实验联用时，可能有助于阐明疾病状态下蛋白转运缺陷或突触功能障碍。例如，我们的研究团队已利用该方法鉴定出在突触胞质中富集的一群具有酶活性的棕榈酰蛋白硫酯酶119。

细胞超微结构分析；细胞器电子显微照片，细胞生物学研究，结构研究。
图7：突触体的电子显微镜（EM）分析。（A）含有突触小泡（箭头）的突触体的代表性电镜图像。（B）同时包含突触前（箭头）和突触后组分（双箭头）的突触体的代表性电镜图像。（C）含有突触小泡和线粒体（箭头）的突触体的代表性电镜图像（比例尺 = 100 nm）。请点击此处查看该图的放大版本。

蛋白质分级；CDH2、MBP 分析；凝胶印迹与柱状图；标志物富集；数据比较。
图 8：细胞亚组分的免疫印迹分析。 （A）与全脑匀浆（总蛋白）相比，细胞亚组分纯度标志物（以 UniProt 命名法标注）定位于预期组分：N-钙黏蛋白（CDH2）位于突触质膜组分（SPM），突触素1（SYPH）和突触连接蛋白1（SYNJ1）位于突触小泡富集组分（LP2），α-突触核蛋白（SYUA）位于突触胞质组分（LS2），髓鞘碱性蛋白（MBP）位于髓鞘组分（MF）。 （B）免疫印迹定量分析显示各组分纯度标志物的富集程度（相对于总蛋白的倍数变化），数据以均值 ± 标准差表示，采用 log10 标度。虚线表示 1.5 倍变化（y = 0.176）（n = 3 次重复实验，使用 8 只野生型小鼠；年龄 = 2 个月；SYPH、SYUA、MBP 的印迹数为 n = 4–5，其中 n = 3 的数据点此前由 Gorenberg 等人19发表；SYNJ1 为 n = 5；CDH2 为 n = 1）。 请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

在他们的开创性研究中，Whittaker 及其同事采用四种形态学标准来鉴定突触体：（1）结构具有封闭的质膜；（2）结构内含有类似于神经末梢和曲张体中的突触小泡 原位 大小和数量；(3) 这些结构含有一个或多个小型线粒体；(4) 突触前膜常与之黏附 突触后组分11,12,13. 尽管前两个标准通常适用于所有分离方法，但在本文描述的最新方案中，并非所有获得的突触体都含有线粒体和附着的突触后终末。大约60%的突触体含有线粒体，而估计仅有最多15%具有附着的突触后终末。37若特别关注突触后成分，已知使用等渗的Krebs样匀浆缓冲液并结合压力过滤法进行富集，可获得富含突触后终末（也称为突触神经体）的突触体高浓度制备物。22,38.

处死动物的方法可能影响突触体及突触亚组分的质量。使用无需麻醉的安乐死方法处死成年动物，通常可获得最佳的组分质量。此外，脑组织应新鲜解剖，不可冷冻，并以1:10的匀浆缓冲液比例（重量/体积）进行匀浆，以获得最具活性的突触组分22。脑内存在多种异质性的突触，可根据其所含神经递质的类型加以区分。突触体的形成通常不受突触类型或神经递质含量的影响13。但小脑中的苔藓纤维是一个例外，已知在从脑其他区域获取突触体的最佳条件下，这些纤维结构易被破坏39,40。因此，若实验目的允许排除该区域，则建议在脑组织匀浆前去除小脑。若需分离具有特定神经递质特征的突触体，可先分离脑内富含目标神经递质神经元的区域。然而，该方法的最终组分得率将受到目标区域大小的限制（因此，动物的年龄也是一个需要考虑的因素）。目前已有针对特定神经递质突触体的免疫化学分离方法，但其活性和得率将显著降低22。若需评估突触体的代谢活性，可采用神经递质释放测定41,42或某些酶学检测方法43。

突触体分离物中的常见污染物包括微粒体、游离线粒体、突触小泡（SVs）以及神经元和胶质细胞膜。通过增加P1和P2组分的洗涤次数22，并在后续步骤中避免重新悬浮红色的线粒体沉淀，可减少污染。在代谢活性和实验时间至关重要的实验中，减少洗涤次数并使用Ficoll或Percoll梯度代替蔗糖梯度将更为有利44,45,46。这些方法也能显著降低污染。Whittaker最初的方案可获得高质量的突触小泡。Nagy等人进一步优化的该方法23，在不显著降低得率的前提下，可制备出纯度高且均一性优异的突触小泡36。若需研究特定亚型的突触小泡，例如含VGLUT-1的谷氨酸能突触小泡或含VGAT-1的GABA能突触小泡，可使用特异性抗体进行免疫分离47,48。此外，也有其他方法可用于从突触体中分离包被小泡（CCVs），由于密度差异，这些小泡可能不会出现在本方法所获得的突触小泡相同的界面位置20,49,50。

总体而言，本分离突触组分的实验方案可根据源脑组织的质量和数量以及实验目标进一步优化，以获得纯度和活性更高的组分。有关进一步的故障排除细节，可参考 Dunkley 和 Robinson22 以及 Ganzella 等人36 所著的书籍章节。

披露

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

我们感谢 P. Colosi 在电镜图像制备方面的帮助。本研究由美国国立卫生研究院（R01 NS064963，SSC；R01 NS110354，SSC；R01 NS083846，SSC；R21 NS094971，SSC；T32 NS007224，SMT；T32 NS041228，SMT）、美国国防部（W81XWH-17-1-0564，SSC；W81XWH-19-1-0264，VDJ）、帕金森病跨领域科学协同研究网络（Aligning Science Across Parkinson's, ASAP）以及迈克尔·J·福克斯基金会靶点推进计划（MJFF-020160，SSC & VDJ）资助。我们使用 BioRender.com 制作了图示插图。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1 mL TB 注射器BD309649
1.5 mL Eppendorf 管USA Scientific1415-2500
14 mL 开口薄壁超透明管Beckman Coulter344060与 SW 40 Ti 兼容
23 号精密滑动皮下注射针头BD305145
26.3 mL 聚碳酸酯瓶带盖组件Beckman Coulter355618与 Ti70 兼容
3.5 mL 开口厚壁聚丙烯管Beckman Coulter349623与 TLA-100.3 兼容
50 mL Falcon 管Fisher Scientific14-432-22
Amicon Ultra-15 离心过滤单元 Millipore SigmaUFC901024
抑肽酶Sigma-AldrichA62791 mg/mL 溶于 diH2O
Avanti J-26 XP 离心机Beckman CoulterB22984<26,000 rpm
台式高密度聚乙烯杜瓦瓶Thermo Scientific5028U19
C57BL/6J 小鼠The Jackson Labs000664
Centrifuge 5810REppendorfEP022628168<14,000 rpm
完整型 Mini 无 EDTA 蛋白酶抑制剂混合片剂Roche11873580001每 50 mL 溶液加入 1 片
弯头镊Fine Science Tools11273-20
精细外科剪刀Fine Science Tools8r
Glas-Col 组织匀浆系统Cole-ParmerUX-04369-15
Graefe 镊Fine Science Tools11650-10
高速聚碳酸酯圆底离心管ThermoFisher3117-0500与 JA20 兼容
异氟烷Henry Schein Animal HealthNDC 11695-6776-2
JA-20 转子Beckman Coulter334831
亮抑蛋白酶肽American BioAB011081 mg/mL 溶于 diH2O
N-[2-羟乙基]哌嗪-N’-[2-乙烷磺酸] (HEPES)American BioAB00892
Optima L-80 XP 超速离心机Beckman Coulter<100,000 rpm
Optima TLX 超速离心机Beckman Coulter<120,000 rpm
Pepstatin AThermo Scientific784361 mg/mL 溶于 DMSO
苯甲基磺酰氟 (PMSF)American BioAB01620
Pierce BCA 蛋白定量检测试剂盒Thermo Scientific23335用于测定蛋白浓度
移液器吸头
血清移液管
蔗糖Sigma-AldrichS0389
外科剪刀Fine Science Tools14002-12
SW 40 Ti 摆动桶转子Beckman Coulter331301
特氟龙涂层研钵和研杵组织研磨器Thomas Scientific3431D94
Ti70 转子Beckman Coulter337922
TLA-100.3 转子Beckman Coulter349490
管式旋转混合器Dot ScientificDTR-02VS

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Synaptic Transmission. Principles of Neural Science, Fifth Edition. Kandel, E. R., Schwartz, J. H., Jessell, T. M., Siegelbaum, S. A., Hudspeth, A. J., Education, A. J. , McGraw-Hill Education. New York, NY. (2014).
  2. Lepeta, K., et al. Synaptopathies: synaptic dysfunction in neurological disorders - A review from students to students. Journal of Neurochemistry. 138 (6), 785-805 (2016).
  3. Südhof, T. C., Malenka, R. C. Understanding synapses: Past, present, and future. Neuron. 60 (3), 469-476 (2008).
  4. Südhof, T. C. The molecular machinery of neurotransmitter release (Nobel lecture). Angewandte Chemie International Edition. 53 (47), 12696-12717 (2014).
  5. Jahn, R., Boyken, J. Molecular Regulation of Synaptic Release. Neuroscience in the 21st Century: From Basic to Clinical. Pfaff, D. W. , Springer. New York. New York, NY. 351-401 (2013).
  6. Xiong, H., Gendelman, H. E. Current Laboratory Methods in Neuroscience Research. , Springer. New York. New York, NY. (2014).
  7. Azevedo, F. A., et al. Equal numbers of neuronal and nonneuronal cells make the human brain an isometrically scaled-up primate brain. Journal of Comparative Neurology. 513 (5), 532-541 (2009).
  8. Herculano-Houzel, S. The remarkable, yet not extraordinary, human brain as a scaled-up primate brain and its associated cost. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 10661-10668 (2012).
  9. Herculano-Houzel, S., Lent, R. Isotropic fractionator: A simple, rapid method for the quantification of total cell and neuron numbers in the brain. Journal of Neuroscience. 25 (10), 2518-2521 (2005).
  10. Herculano-Houzel, S., Mota, B., Lent, R. Cellular scaling rules for rodent brains. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (32), 12138-12143 (2006).
  11. Gray, E. G., Whittaker, V. P. The isolation of nerve endings from brain: An electron-microscopic study of cell fragments derived by homogenization and centrifugation. Journal of Anatomy. 96, 79-88 (1962).
  12. Gray, E. G., Whittaker, V. P. The isolation of synaptic vesicles from the central nervous system. Journal of Physiology. 153, 35-37 (1960).
  13. Whittaker, V. P. Thirty years of synaptosome research. Journal of Neurocytology. 22 (9), 735-742 (1993).
  14. Jahn, R., Fasshauer, D. Molecular machines governing exocytosis of synaptic vesicles. Nature. 490, 201-207 (2012).
  15. Whittaker, V. P., Michaelson, I. A., Kirkland, R. J. The separation of synaptic vesicles from nerve-ending particles ('synaptosomes). Biochemical Journal. 90 (2), 293-303 (1964).
  16. De Robertis, E., Rodriguez De Lores Arnaiz, G., Pellegrino De Iraldi, A. Isolation of synaptic vesicles from nerve endings of the rat brain. Nature. 194, 794-795 (1962).
  17. De Robertis, E., Pellegrino De Iraldi, A., Rodriguez, G., Gomez, C. J. On the isolation of nerve endings and synaptic vesicles. The Journal of Biophysical and Biochemical Cytology. 9 (1), 229-235 (1961).
  18. Zimmermann, H., Whittaker, V. P. The Discovery of the Synaptosome and Its Implications. Synaptosomes. Murphy, K. M. , Springer. New York. New York, NY. 9-26 (2018).
  19. Gorenberg, E. L., et al. Identification of substrates of palmitoyl protein thioesterase 1 highlights roles of depalmitoylation in disulfide bond formation and synaptic function. PLoS Biology. 20 (3), 3001590(2022).
  20. Vidyadhara, D. J., et al. Dopamine transporter and synaptic vesicle sorting defects initiate auxilin-linked Parkinson's disease. bioRxiv. , (2022).
  21. Schrimpf, S. P., et al. Proteomic analysis of synaptosomes using isotope-coded affinity tags and mass spectrometry. Proteomics. 5 (10), 2531-2541 (2005).
  22. Dunkley, P. R., Robinson, P. J. Synaptosome Preparations: Which Procedure Should I Use. Synaptosomes. Murphy, K. M. , Springer. New York. New York, NY. 27-53 (2018).
  23. Nagy, A., Baker, R. R., Morris, S. J., Whittaker, V. P. The preparation and characterization of synaptic vesicles of high purity. Brain Research. 109 (2), 285-309 (1976).
  24. Takamori, S., et al. Molecular anatomy of a trafficking organelle. Cell. 127 (4), 831-846 (2006).
  25. Wagner, J. A., Kelly, R. B. Topological organization of proteins in an intracellular secretory organelle: the synaptic vesicle. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (8), 4126-4130 (1979).
  26. Jahn, R., Schiebler, W., Ouimet, C., Greengard, P. A 38,000-dalton membrane protein (p38) present in synaptic vesicles. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 82 (12), 4137-4141 (1985).
  27. Binotti, B., Jahn, R., Pérez-Lara, Á An overview of the synaptic vesicle lipid composition. Archives of Biochemistry and Biophysics. 709, 108966(2021).
  28. Siegel, D. P., Ware, B. R. Electrokinetic properties of synaptic vesicles and synaptosomal membranes. Biophysical Journal. 30 (1), 159-172 (1980).
  29. Whittaker, V. P., Michaelson, I. A., Kirkland, R. J. The separation of synaptic vesicles from disrupted nervending particles. Biochemical Pharmacology. 12 (3), 300-302 (1963).
  30. Clementi, F., Whittaker, V. P., Sheridan, M. N. The yield of synaptosomes from the cerebral cortex of guinea pigs estimated by a polystyrene bead "tagging" procedure. Zeitschrift für Zellforschung und Mikroskopische Anatomie. 72, 126-138 (1966).
  31. Carlson, S. S., Wagner, J. A., Kelly, R. B. Purification of synaptic vesicles from elasmobranch electric organ and the use of biophysical criteria to demonstrate purity. Biochemistry. 17 (7), 1188-1199 (1978).
  32. Huttner, W. B., Schiebler, W., Greengard, P., De Camilli, P. Synapsin I (protein I), a nerve terminal-specific phosphoprotein. III. Its association with synaptic vesicles studied in a highly purified synaptic vesicle preparation. Journal of Cell Biology. 96 (5), 1374-1388 (1983).
  33. Hawkins, P., et al. A guide to defining and implementing protocols for the welfare assessment of laboratory animals: eleventh report of the BVAAWF/FRAME/RSPCA/UFAW Joint Working Group on Refinement. Laboratory Animals. 45 (1), 1-13 (2011).
  34. Risling, T. E., Caulkett, N. A., Florence, D. Open-drop anesthesia for small laboratory animals. Canadian Veterinary Journal. 53 (3), 299-302 (2012).
  35. Deutsch, C., Drown, C., Rafalowska, U., Silver, I. A. Synaptosomes from rat brain: Morphology, compartmentation, and transmembrane pH and electrical gradients. Journal of Neurochemistry. 36 (6), 2063-2072 (1981).
  36. Ganzella, M., Ninov, M., Riedel, D., Jahn, R. Isolation of synaptic vesicles from mammalian brain. Methods in Molecular Biology. 2417, 131-145 (2022).
  37. Dunkley, P. R., et al. A rapid Percoll gradient procedure for isolation of synaptosomes directly from an S1 fraction: homogeneity and morphology of subcellular fractions. Brain Research. 441 (1-2), 59-71 (1988).
  38. Schwartz, R. D., Skolnick, P., Hollingsworth, E. B., Paul, S. M. Barbiturate and picrotoxin-sensitive chloride efflux in rat cerebral cortical synaptoneurosomes. FEBS Letters. 175 (1), 193-196 (1984).
  39. Pittaluga, A., Thellung, S., Maura, G., Raiteri, M. Characterization of two central AMPA-preferring receptors having distinct location, function and pharmacology. Naunyn-Schmiedeberg's Archives of Pharmacology. 349 (6), 555-558 (1994).
  40. Israël, M., Whittaker, V. P. The isolation of mossy fibre endings from the granular layer of the cerebellar cortex. Experientia. 21 (6), 325-326 (1965).
  41. Khvotchev, M., Lonart, G., Südhof, T. C. Role of calcium in neurotransmitter release evoked by alpha-latrotoxin or hypertonic sucrose. Neuroscience. 101 (3), 793-802 (2000).
  42. Lonart, G., Janz, R., Johnson, K. M., Südhof, T. C. Mechanism of action of rab3A in mossy fiber LTP. Neuron. 21 (5), 1141-1150 (1998).
  43. Nicholls, D. G., Sihra, T. S. Synaptosomes possess an exocytotic pool of glutamate. Nature. 321 (6072), 772-773 (1986).
  44. Dunkley, P. R., Jarvie, P. E., Robinson, P. J. A rapid Percoll gradient procedure for preparation of synaptosomes. Nature Protocols. 3 (11), 1718-1728 (2008).
  45. Cotman, C. W., Matthews, D. A. Synaptic plasma membranes from rat brain synaptosomes: Isolation and partial characterization. Biochimica et Biophysica Acta. 249 (2), 380-394 (1971).
  46. Booth, R. F., Clark, J. B. A rapid method for the preparation of relatively pure metabolically competent synaptosomes from rat brain. Biochemical Journal. 176 (2), 365-370 (1978).
  47. Takamori, S., Riedel, D., Jahn, R. Immunoisolation of GABA-specific synaptic vesicles defines a functionally distinct subset of synaptic vesicles. Journal of Neuroscience. 20 (3), 4904-4911 (2000).
  48. Burger, P. M., et al. Synaptic vesicles immunoisolated from rat cerebral cortex contain high levels of glutamate. Neuron. 3 (6), 715-720 (1989).
  49. Blondeau, F., et al. Tandem MS analysis of brain clathrin-coated vesicles reveals their critical involvement in synaptic vesicle recycling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (11), 3833-3838 (2004).
  50. Maycox, P. R., Link, E., Reetz, A., Morris, S. A., Jahn, R. Clathrin-coated vesicles in nervous tissue are involved primarily in synaptic vesicle recycling. Journal of Cell Biology. 118 (6), 1379-1388 (1992).

重印与许可

申请许可以重复使用本 JoVE 文章的文本或图表

申请许可

标签

相关文章