兔后肢腘窝血管淋巴结切除术用于继发性淋巴水肿诱导

摘要

本文描述了在兔后肢中建立稳定的获得性淋巴水肿的手术方法。该实验动物模型可用于进一步研究显微外科技术治疗淋巴水肿的效果。

摘要

淋巴水肿是一种常见疾病，常与癌症及其治疗相关，会导致淋巴系统受损，目前的治疗方法大多为姑息性而非根治性。该病在肿瘤患者中发病率较高，表明有必要深入研究正常淋巴系统的功能以及病理状态下的功能障碍。为了复制慢性淋巴水肿模型，必须选择合适的实验动物。由于淋巴系统具有再生能力，动物模型的建立受到一定限制。在诸多候选动物中，兔后肢易于操作，且可较好地外推至人类临床情况，具有明显优势。此外，该物种的体型大小有利于更精确地选择淋巴管进行带血管淋巴结切除术。

本研究介绍了一种在兔后肢进行血管淋巴结切除以诱导继发性淋巴水肿的方法。对麻醉动物进行周长测量、专利蓝V染料注射以及吲哚菁绿淋巴显影（ICG-L），后者采用实时近红外荧光成像技术，可识别单个腘窝淋巴结及淋巴管。通过切除腘窝淋巴结并结扎内侧和外侧传入淋巴管，即可到达上述已识别结构。需特别注意，应识别并结扎任何未进入腘窝淋巴结、而在大腿内直接汇入股部淋巴系统的淋巴管。

术后评估在诱导后3个月、6个月和12个月进行，采用后肢周长测量和ICG-L检测。随访结果显示，动物出现了真皮回流现象，并持续至12个月^th 月，使得这种实验动物在淋巴水肿长期评估的新方法研究中具有实用价值。总之，本文所述方法可行且可重复；此外，在所呈现的时间窗内，其可代表人类淋巴水肿，从而为研究提供一种有用的工具。

引言

淋巴水肿是一种慢性疾病，由于其全球发病率高、缺乏治愈性和标准化治疗手段，并对患者的生活质量造成严重影响，因而需要特别关注^1,2。

在发达国家，淋巴水肿主要为获得性，继发于乳腺癌，这与该恶性肿瘤的高发病率有关；术后10年乳腺癌相关淋巴水肿的累积发病率可高达41.1%³。然而，黑色素瘤、妇科癌症、泌尿生殖系统肿瘤以及头颈部肿瘤等疾病也与较高的淋巴水肿发病率相关⁴。作为提高生存率所必需的肿瘤治疗的一部分，区域淋巴结切除术会导致功能性淋巴引流的中断。在某些情况下，机体可启动代偿机制，从而预防或延迟淋巴水肿的发生⁵。然而，当接受化疗和放疗时，这些代偿机制无法弥补淋巴系统的改变，从而导致淋巴水肿的发生。这会对患者的生活质量产生负面影响，影响其功能状态、社会交往及心理福祉^6,7。

要找到淋巴水肿的有效治疗方法，必须深入了解淋巴系统的病理生理学，以及正常和功能异常的淋巴系统中复杂的细胞机制及其反应^8,9,10。这些认识最初可通过能够模拟人类慢性疾病的实验动物模型获得¹¹。

人们已多次尝试在实验动物模型中复制淋巴水肿；然而，大多数尝试都受到一些限制，包括无法在稳定的动物模型中再现慢性淋巴功能不全、研究成本较高，以及最重要的一点——淋巴系统具有强大的再生能力，能够恢复循环^12,13。

本研究介绍了通过兔后肢手术诱导稳定获得性淋巴水肿的实验方法。根据文献综述，由于兔后肢淋巴系统解剖结构一致，包括一个单一的腘淋巴结，该淋巴结引流后肢淋巴液并汇入腿部主要的股部淋巴系统，因此该动物被认为是建立淋巴水肿模型的理想选择^14,15。

兔子后肢的特定解剖结构使得能够重现人类诱导继发性淋巴水肿的外科手术操作。因此，该手术可用于显微外科培训和临床前研究，并将研究结果外推至人类医学。

方案

所有操作均经赫苏斯·乌松微创外科中心伦理委员会及地区政府动物福利指南批准，上述指南基于欧洲立法制定。

1. 术前与手术准备

1. 将九只体重为4-4.5 kg、年龄为4个月的雌性新西兰白兔分别饲养在独立笼具中，环境温度维持在22-25℃ °C，自由获取食物和水。确保笼子内含有一个表面积为3 m²的聚砜托盘。² 高度为40 cm，并配有木屑垫料的笼床。
   1. 使用项目代码和动物识别编号标记笼子。
   2. 手术前将动物适应性饲养1周，以防止应激相关问题。采集术前血液样本进行实验室检测，以确保每只动物在麻醉前均处于良好健康状态。
2. 确保所有兔子在每次手术前均进行12小时禁食。
   1. 给予麻醉前用药后，使用面罩（Hall 面罩）为兔子预充氧 5 分钟，氧浓度为 100%，新鲜气体流量为 3–5 L/min。随后静脉注射咪达唑仑（0.3 mg/kg）和丙泊酚（10 mg/kg）进行协同诱导麻醉。
3. 使用3.0-3.5号气管导管对兔子进行气管插管，连接气腹装置，接入半封闭环路呼吸系统，并与呼吸机相连；新鲜气体流量初始设定为1 L/min，持续5分钟，随后调整至0.5 L/min。
   1. 通过蒸发器吸入浓度为3%-3.5%的七氟烷进行维持麻醉。
4. 在整个手术过程中，通过耳缘静脉向麻醉后的兔子持续输注乳酸林格液（2-4 mL/kg/h）。
   1. 使用保护性眼膏以保护眼表。
5. 全身麻醉监测：使用直肠温度计监测体温，维持在38.7-39.7 °C，检查黏膜颜色，并监测 O₂饱和度在 >95% 且心率维持在 180-240 次/分钟，使用兔用脉搏血氧仪进行监测。
6. 放置保温支持装置，使动物在手术过程中保持恒定体温。
7. 术中镇痛给予静脉注射酮咯酸（1.5 mg/kg）联合曲马多（3 mg/kg）。
8. 给予抗生素（7.5 mg/(kg∙天）皮下注射恩诺沙星 [s.c.]）术前及术后5天，以及术后镇痛（10 µ克/千克∙皮下注射布托啡诺（每日一次），持续5天。
9. 将兔子置于仰卧位，剃除后肢及腹股沟区域的毛发。将动物保持在背侧/仰卧位，并剪除后肢及腹股沟区域的毛发。
10. 使用0.5%氯己定和70%乙醇对已剃毛的皮肤进行皮肤消毒。消毒完成后，除左侧后肢外，用无菌布覆盖兔子全身。

2. 腘窝血管化淋巴结切除术（图1）

1. 在左侧后肢第二和第三趾间区域皮内注射 0.2–0.3 mL 吲哚菁绿（ICG）。轻轻按摩并屈伸后肢数分钟，以促进染料进入淋巴管。以对侧肢体作为对照。
2. 使用实时近红外荧光相机观察并用手术标记笔在皮肤上标记穿过膝关节水平的淋巴管及腘淋巴结（PLN）（图2）。
3. 向趾间区域注射专利蓝V（0.2 mL），以便后续识别淋巴管和淋巴结。
4. 使用实时近红外荧光相机确定PLN位置后（图3），于腘窝中心做一长约2 cm的切口，沿后肢长轴纵向切开，穿过皮下可见的坐骨静脉。
   1. 使用配备1类激光作为激发光源和近红外敏感相机的光学探头，从动物后肢踝部至膝部获取淋巴系统的实时全景图像。
   2. 切除皮下脂肪组织后，可在肌筋膜上方观察到淋巴管⁵。由于步骤2.3中专利蓝V的染色作用，淋巴管呈蓝色。
   3. 使用显微外科镊扩大切口，暴露PLN及其血管和传入淋巴管蒂，确保所有淋巴和血管结构清晰可见（图4）。
   4. 在坐骨静脉下方、股二头肌与内侧腘绳肌之间识别直径约为0.8 mm的PLN。
5. 识别位于PLN内侧的两条主要淋巴管。这些淋巴管与远端隐静脉平行，并在接近PLN时分支为微血管网络（图5）。
6. 分离淋巴结蒂部时，注意避免损伤周围组织和血管（图6）。
7. 使用10/0尼龙不可吸收缝线，在远端和近端分别结扎内侧动脉（腘动脉分支）和外侧隐静脉。
8. 识别并电凝两组直接汇入股部淋巴系统但未进入PLN的传入淋巴管（图7）。
   注：第一组为引流大腿上部及小腿淋巴液的内侧传入淋巴管；第二组由下肢肌肉组织内的淋巴管组成，这些淋巴管沿腓肠肌走行，与隐静脉伴行。
9. 通过重复进行实时近红外荧光成像，确认淋巴系统完全中断。
10. 彻底清除周围脂肪组织，以防止可能发生的淋巴管新生。
11. 使用4-0聚乙醇酸（PGA）可吸收编织缝线（配16 mm 3/8三角针）行连续皮内缝合，关闭皮肤切口，以避免术后自残行为。
12. 术后将兔子单独饲养于笼中，密切观察，并保持室温在16至22 °C之间。

3. 术后评估

1. 在诱导后 3、6 和 12 个月进行术后评估。
2. 按照先前使用的步骤（步骤 1.2–1.7）对兔子进行麻醉。
3. 使用卷尺测量麻醉后兔子后肢的周长。每 2 cm 测量一次，起点为踝关节，终点为膝关节。采用截锥体公式计算总体积。
4. 使用吲哚菁绿淋巴显像（ICG-L）评估淋巴功能。
   1. 将 0.2–0.3 mL 吲哚菁绿（ICG）注射至第二和第三趾间区域的真皮层，并轻柔按摩 1 分钟，以促进 ICG 进入淋巴管。
5. 使用近红外荧光系统在 15 分钟后采集图像，以评估真皮回流情况。
6. 完成随访后，按照干预时相同的麻醉方案对兔子实施安乐死。达到目标麻醉深度后，以平均 2 meq/kg 的速率经耳缘静脉注射氯化钾。

结果

本研究中，九只兔子接受了淋巴水肿诱导，但有三只兔子在术后即刻期死亡，无法进行评估。术后3个月、6个月和12个月的数据由三位独立研究人员获取。在全身麻醉下进行后肢周径测量和吲哚菁绿淋巴显像（ICG-L），以评估淋巴系统功能及真皮回流情况。

术后3个月通过吲哚菁绿淋巴显像（ICG-L）获得的数据显示，兔左后肢出现真皮回流及皮下淋巴结（PLNs）缺失，符合正常淋巴系统功能受损的表现。术后6个月和12个月的ICG-L结果显示，在手术探查过程中，腘窝远端出现真皮回流及扩张的淋巴管（图8）。

检查及后肢周径测量均未发现临床淋巴水肿的证据。与右侧后肢（对照）相比，左侧后肢体积的增加无显著性差异（p < 0.05）（图9）。所有来自左侧后肢的结果均与同一只动物右侧后肢的结果进行比较，后者作为阴性对照。

在所述的手术过程中，切除后肢淋巴结并应用吲哚...

讨论

在实验动物中切除后肢淋巴结（PLN）是一种相对较新的手术方法，可诱导肢体继发性淋巴水肿，用于评估与研究。淋巴结切除后，淋巴系统功能会出现一段时间的紊乱，伴随淋巴液积聚以及淋巴管的组织学改变，表现为淋巴管扩张。当淋巴液积聚达到一定程度时，可利用吲哚菁绿淋巴显像（ICG-L）等客观技术观察到类似人类淋巴水肿特征性的真皮回流现象。该技术的建立有望提供一种经济有效的临床前研究动物模型，有助于预防和治疗这一病理生理过程。

术中应用专利蓝V可识别后肢淋巴管是否存在淋巴液流动⁵。该技术的缺点是仅能在术中观察淋巴管。因此，目前采用实时近红外荧光成像技术，该方法无需手术即可使外科医生识别、定位并量化应用部位淋巴管中的淋巴流动，是一种极为有效的手段。如今，该技术被视为淋巴水肿诊断的金标准。

本研究中，所有通过吲哚菁绿（ICG）和专利蓝V观察并识别的淋巴管均为通畅状态。在切除后肢淋巴结（PLN）后，左后肢在诱导后的3、6和12个月时均出现真皮回流现象，且未见线性功能性淋巴管存在。这表明在整个研究期间，...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
专利蓝V钠盐（Guerbet）	Guerbet。法国维勒潘特		2.5 g/100 mL
布托啡诺（Bupaq）	Richter Pharma。奥地利韦尔斯	0820645AA	3 mg/10 mL
Fluobeam	Fluoptics。法国格勒诺布尔		荧光成像
IBM SPSS 软件	IBM	版本 21.0
吲哚菁绿（Verdye，Diagnostic Green GmbH）	Diagnostic Green GmbH，德国阿申海姆-多尔纳赫		5 mg/mL
酮咯酸  (Normon)	Normon，西班牙马德里	T01H	30 mg/mL
Microsoft Excel	微软	版本 16.66.1
咪达唑仑（Normon）	诺尔蒙，S.A.，西班牙马德里	T35M	15 mg/3 mL
Pentero 800 显微镜，荧光模块	卡尔·蔡司医疗技术股份公司。格施维策街 51-52 号。耶拿，德国	302581-9245-000
氯化钾（Braun）	B.Braun。西班牙巴塞罗那	19262010	20 mmol/10 mL
异丙酚（Propomitor，Orion Pharma）	Orion Pharma。芬兰斯波	20R039B	200 mg/20 mL
RÜSCH 气管插管	爱尔兰阿西奥内的泰利福医疗IDA商业与科技园区	12CE 12	内径 4.0 毫米管子规格
七氟烷（SevoFlo，Zoetis）	硕腾比利时公司。比利时，鲁汶-拉-讷夫	6093559	1000 mg/g（250 mL）
曲马多（诺蒙）	诺蒙，S.A.，西班牙马德里	T08U	100 mg/2 mL