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方法文章

病毒增殖与基于细胞的比色定量

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DOI：

10.3791/64578

⸱

2023年4月7日

 ,  ,  ,  , 
1Tropical Infectious Diseases Research and Education Centre (TIDREC), Higher Institution Center of Excellence (HICoE), Universiti Malaya, 2Department of Medical Microbiology, Faculty of Medicine, Universiti Malaya

本文内容

摘要

本实验方案描述了在Vero非洲绿猴肾细胞中扩增寨卡病毒（ZIKV）的方法，并利用基于细胞的比色免疫检测法，在24孔板和96孔板（高通量）格式中对ZIKV进行定量。

摘要

寨卡病毒（ZIKV）是一种通过蚊子传播的病毒，属于黄病毒属（Flavivirus）。ZIKV感染与先天性脑部异常以及成人可能发生的吉兰-巴雷综合征相关。开展ZIKV相关研究以阐明疾病发生机制，对于推动疫苗和治疗方法的开发具有重要意义。病毒定量方法在病毒学领域至关重要且为基础性技术。焦点形成实验（FFA）是一种病毒定量检测方法，通过抗体检测病毒抗原，并利用辣根过氧化物酶免疫染色技术识别细胞中的感染灶。本研究描述了采用24孔板和96孔板（高通量）两种格式进行病毒增殖与定量的实验流程。与其他类似研究相比，该方案进一步阐述了焦点大小的优化过程，可为将该检测方法拓展应用于其他病毒提供指导。首先，在Vero细胞中培养ZIKV，持续3天。收集含有ZIKV的培养上清液，并使用FFA进行定量。简而言之，将病毒培养物接种至Vero细胞，孵育2-3天；随后经过优化的染色步骤（包括细胞固定、通透化、封闭、抗体结合以及与辣根过氧化物酶底物孵育）后，检测焦点的形成情况。染色后的病毒焦点可通过体视显微镜（24孔板采用人工计数）或软件分析系统（96孔板采用自动计数）进行观察。FFA具有结果可重复、相对快速（3-4天）的优点，适用于多种病毒的检测，包括不形成蚀斑的病毒。因此，该实验方案不仅可用于ZIKV感染的研究，还可用于检测其他具有临床重要性的病毒。

引言

寨卡病毒（ZIKV）感染是一种新出现的蚊媒病毒性疾病。ZIKV 最早于1947年在乌干达被分离出来1,2；从1947年到2007年期间，该病毒一直被忽视，因为其临床症状通常无明显表现，且多表现为自限性发热性疾病。2007年，寨卡疫情首次在雅浦群岛暴发3,4，随后在2013年至2014年间，太平洋地区（法属波利尼西亚、复活节岛、库克群岛和新喀里多尼亚）也相继发生较大规模的疫情5,6,7,8，期间首次在成人中报告了严重的神经系统并发症——吉兰-巴雷综合征（Guillain-Barré syndrome, GBS）9。2015年至2016年期间，随着寨卡病毒亚洲基因型株早在2013年即已在巴西出现，美洲地区首次暴发了大规模寨卡病毒疫情10。在此轮疫情中，共报告了约44万至130万例新生儿小头症及其他神经系统疾病病例11。目前尚无针对寨卡病毒感染的特异性治疗方法或治愈手段，因此迫切需要能够预防感染（尤其是在妊娠期间）的寨卡病毒疫苗。

病毒定量是一种用于确定样本中病毒数量的方法，在医学和生命科学等多个领域的科研及学术实验室中具有重要作用。该过程在商业领域同样重要，例如病毒疫苗、重组蛋白、病毒抗原或抗病毒制剂的生产。目前有多种方法或检测技术可用于病毒定量12。方法或检测技术的选择通常取决于病毒的特性、所需的准确度水平以及实验或研究的性质。总体而言，病毒定量方法可分为两大类：一类是检测病毒核酸（DNA 或 RNA）存在的分子检测技术，另一类是体外（in vitro）测定病毒感染活性的检测技术12。定量聚合酶链式反应（qPCR，用于 DNA）或定量逆转录聚合酶链式反应（qRT-PCR，用于 RNA）13以及数字液滴 PCR14是常用于定量样本中病毒核酸的分子技术示例15。然而，这些高灵敏度的分子技术无法区分具有感染活性的病毒与无活性的病毒15。因此，对于需要获取病毒在细胞上感染活性等生物学特性的研究，仅依靠上述分子技术无法完成；必须采用能够测量并确定具有感染活性病毒存在的检测方法。用于测定病毒感染活性的检测方法包括噬斑形成实验（PFA）、50%组织培养感染剂量（TCID50）、荧光灶点检测以及透射电子显微镜（TEM）12。

空斑形成试验（PFA）由Renato Dulbecco于1952年开发，是病毒滴定中最常用的方法之一，也适用于寨卡病毒（ZIKV）16。该方法可用于直接测定具有感染性的裂解性病毒颗粒的浓度。其原理基于裂解性病毒在感染后能够在接种的单层细胞上产生细胞病变效应（CPEs；即细胞死亡区域或空斑，表现为被未感染细胞包围的感染区域）。然而，该检测方法存在若干影响其应用的缺点：耗时较长（约需7-10天，具体时间取决于病毒种类）、依赖细胞病变效应，且易产生误差。在本研究中，我们报道了一种免疫比色技术——焦点形成试验（FFA），可用于在24孔板和96孔板体系中检测并定量ZIKV。

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方案

1. 病毒增殖

  1. 细胞准备
    1. 在含有12 mL添加10%胎牛血清（FBS）和2 mM L-谷氨酰胺的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）的75 cm2细胞培养瓶中培养Vero细胞（见材料表）。将细胞置于37 °C、5% CO2的细胞培养箱中孵育。
    2. 在显微镜下观察细胞；当细胞融合度达到70%–90%时，即可使用（图1A）。
      注：Vero细胞大约每24小时倍增一次17。在75 cm2培养瓶中，1:10的传代稀释通常需要3至4天达到80%–90%融合度。应每日或隔日观察细胞生长情况。
  2. 细胞单层感染
    1. 使用10 mL移液管从细胞培养瓶中移除生长培养基。用5 mL移液管加入3 mL杜氏磷酸盐缓冲液（dPBS），冲洗培养瓶2次  。
      注：需准备含10%次氯酸钠的烧杯，用于消毒废弃的感染性液体废物（来自培养瓶或培养板）。
    2. 向细胞培养瓶中加入2 mL无血清DMEM（含2 mM L-谷氨酰胺但不含FBS的DMEM）和20 µL ZIKV接种物。室温下轻轻摇动孵育1小时，使病毒吸附细胞。
      注：初始ZIKV毒株的滴定有助于确定ZIKV接种物体积（步骤2）。
      警告：ZIKV被归类为生物安全二级（BSL-2）病原体。所有涉及含ZIKV材料的操作必须在经认证的生物安全柜中进行，并遵循实验室标准操作程序（SOP），佩戴适当的个人防护装备。
  3. 添加覆盖培养基
    1. 1小时孵育后，使用5 mL移液管移除并弃去稀释后的病毒接种物。用3 mL dPBS冲洗细胞培养瓶2次。
    2. 向细胞培养瓶中加入12 mL维持培养基（含2% FBS、2 mM L-谷氨酰胺和100 U/mL青霉素-链霉素的DMEM），以维持感染后细胞的生长。
    3. 将感染的Vero细胞在37 °C、5% CO2的细胞培养箱中继续孵育3天。
      注：每日在显微镜下观察感染Vero细胞的细胞病变效应（CPE）。
  4. 收集含ZIKV的细胞培养上清液
    1. 感染后第3天，可观察到细胞变圆和脱落（CPE）（图1B-D）。使用10 mL移液管将含ZIKV的细胞培养上清液收集至50 mL离心管中。
    2. 使用0.22 µm聚醚砜注射器滤器（见材料表）过滤细胞培养上清液。将过滤后的上清液分装为每管500 µL至2.0 mL螺口管中，于-80 °C保存备用。
      注：收获的ZIKV可在-80 °C长期保存。
      ​警告：若使用注射器针头，必须格外小心，以防刺伤皮肤。实验室应建立相应的标准操作程序。

2. 病毒定量

  1. 细胞准备
    1. 将Vero细胞接种于指定的培养板中（24孔板：每孔0.5 mL，每孔7.5 × 104 个细胞；96孔板：每孔0.1 mL，每孔1.5 × 104 个细胞），并在37 °C、5% CO2的细胞培养箱中孵育过夜。
      注意：需检测五个不同的时间点（24孔板：感染后48 h、60 h、72 h、84 h和96 h；96孔板：感染后24 h、36 h、48 h、60 h和72 h）；因此，每个时间点需准备一块培养板。
    2. 孵育24 h后，当细胞达到70%–90%融合度时（图1E），培养板即可用于感染。在感染细胞单层前，需先准备稀释的病毒储备液（步骤2.2）。
  2. 病毒稀释
    1. 对于24孔板和96孔板，每块板各准备六个无菌的1.5 mL微量离心管，用于进行10倍系列稀释（从10-1至10-5），并包括一个阴性对照。对于24孔板的实验设置，在全部六个微量离心管中各加入450 µL无血清DMEM。对于96孔板的实验设置，在六个管中各加入135 µL无血清DMEM。
      注意：在进行10倍系列稀释前，需清晰标记每根管，以标明其所含溶液的稀释度。
    2. 进行系列稀释时，对于24孔板实验设置，取50 µL步骤1中收获的ZIKV储备液，加入含有450 µL无血清DMEM的10-1管中。对于96孔板实验设置，取15 µL ZIKV储备液加入含有135 µL无血清DMEM的10-1管中。
    3. 涡旋振荡每根管以充分混匀病毒与培养基。此为第一次10倍稀释。
      注意：每次稀释管中病毒与培养基的充分混匀，是确保系列稀释准确性的关键。
    4. 对于24孔板实验设置，使用新的移液枪头重悬10-1管，取50 µL稀释后的ZIKV转移至10-2管，进行第二次10倍稀释。对于96孔板实验设置，使用新的移液枪头重悬10-1管，取15 µL稀释后的ZIKV转移至10-2管，进行第二次10倍稀释。
    5. 重复步骤2.2.4共四次，直至第五个管（不包括阴性对照）。
      注意：每次移液后均需更换新的移液枪头，以避免交叉污染。
  3. 细胞单层的感染
    1. 移除并弃去每孔中的培养上清（24孔板：每孔0.5 mL；96孔板：每孔0.1 mL）。
    2. 用dPBS清洗每孔2次（24孔板：每孔300 µL；96孔板：每孔60 µL）。
    3. 从最高稀释度至最低稀释度依次操作，将每种系列稀释的病毒接种物加入各孔中（24孔板：每孔200 µL；96孔板：每孔40 µL）。
      ​注意：每个稀释度的感染需设两个重复孔。保留两个未感染孔作为阴性对照。清晰标记培养板及各孔，避免混淆。每次移液后更换移液枪头，防止交叉污染。
    4. 在室温下轻轻摇动培养板，孵育1 h，使病毒充分吸附。
  4. 覆盖细胞培养基的添加
    1. 孵育1 h后，从最低浓度至最高浓度依次移除并弃去各孔中的病毒悬液。
    2. 用dPBS清洗感染细胞2次（24孔板：每孔300 µL；96孔板：每孔60 µL）。
    3. 在每孔中加入覆盖培养基：DMEM（含2% FBS、2 mM L-谷氨酰胺和100 U/mL青霉素-链霉素）与1.5%低黏度羧甲基纤维素（CMC；见材料表）的混合液（24孔板：每孔1 mL；96孔板：每孔0.2 mL）。
    4. 将培养板置于37 °C、5% CO2的细胞培养箱中孵育。
      注意：此孵育期间请勿扰动培养板。
    5. 在不同时间点（24孔板：感染后48 h、60 h、72 h、84 h和96 h；96孔板：感染后24 h、36 h、48 h、60 h和72 h）将培养板从细胞培养箱中取出，进行染色。

3. 染色

  1. 细胞固定
    1. 在特定时间孵育后（24孔板：感染后48 h、60 h、72 h、84 h和96 h；96孔板：感染后24 h、36 h、48 h、60 h和72 h），移除并弃去覆盖介质，用1× PBS洗涤细胞3次。对于96孔板，使用多通道移液器移除并弃去覆盖介质，并用每孔60 µL的1× PBS洗涤细胞3次。
    2. 加入4%多聚甲醛以固定细胞（24孔板：每孔300 µL；96孔板：每孔60 µL）。将板在室温下孵育20分钟。
      警告：多聚甲醛是聚合的甲醛固体，为易燃的白色结晶粉末，在与水混合或加热时会释放甲醛气体。所有涉及多聚甲醛的操作必须在经认证的化学通风橱或经批准的排风装置中进行，并遵循实验室针对含甲醛化学品的SOP。
    3. 20分钟后，弃去多聚甲醛溶液，并用1× PBS洗涤细胞3次。随后按照步骤3.2–3.5进行通透、封闭和抗体孵育。
      注：弃置4%多聚甲醛时，应遵循所在大学或研究机构的废弃物处理规程。
  2. 细胞通透
    1. 加入1%辛基苯基聚氧乙烯醚（见材料表）以进行细胞通透处理（24孔板：每孔200 µL；96孔板：每孔40 µL）。将板在室温下孵育15分钟。
    2. 15分钟后，弃去辛基苯基聚氧乙烯醚溶液，并用1× PBS洗涤细胞3次。
  3. 封闭
    1. 加入3%脱脂奶粉以减少样本中的非特异性结合（24孔板：每孔500 µL；96孔板：每孔100 µL）。将板在室温下孵育2小时。
    2. 2小时后，弃去3%脱脂奶粉溶液，并用1× PBS洗涤细胞3次。
      ​注：此处可暂停实验。加入3%脱脂奶粉后，板可在4 °C保存最多2天，再进行一抗孵育。
  4. 一抗孵育
    1. 将抗黄病毒单克隆抗体4G2（克隆号D1-4G2-4-15；一抗，见材料表）用1%脱脂奶粉按1:1,000比例稀释后加入（24孔板：每孔200 µL；96孔板：每孔40 µL）。将板在37 °C孵育1小时。
    2. 1小时后，移除含单克隆抗体的溶液，并用1× PBS洗涤细胞3次。
  5. 二抗孵育
    1. 加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗小鼠IgG二抗（见材料表），用1%脱脂奶粉按1:1,000比例稀释（24孔板：每孔200 µL；96孔板：每孔40 µL）。将板在37 °C孵育1小时。
    2. 1小时后，移除含二抗的溶液，并用1× PBS洗涤细胞3次。
  6. 底物孵育
    1. 加入3,3'-二氨基联苯胺（DAB）过氧化物酶底物（见材料表），避光孵育30分钟（24孔板：每孔200 µL；96孔板：每孔40 µL）。30分钟后，用水洗涤孔板以终止反应。
    2. 将板在空气中过夜干燥，待完全干燥后进行病灶计数。

4. 病毒滴度的测定

  1. 手动集落计数流程（24孔板格式）
    1. 可在体视显微镜下观察集落。选择产生50–200个集落的稀释度。
    2. 对所选稀释度的每个重复样本进行集落计数。计算每个所选稀释度的平均集落数。
    3. 使用以下公式计算每毫升样品中的集落形成单位（FFU/mL）：FFU/mL = 平均集落数 /（稀释倍数 × 加入的稀释病毒液体积）。
  2. 自动集落计数流程（96孔板格式）
    1. 在商用软件分析仪上扫描96孔板。
      1. 双击软件（参见材料表）以打开。
      2. 点击切换套件，并确保套件已切换至任一适用选项（补充图1A）。点击确定。
      3. 通过点击扫描 > 全板扫描开始扫描（补充图1B）。
      4. 点击仪表板，确认捕获格式为96孔板格式（补充图2A）。
      5. 将居中模式选择为"自动预对齐用户确认"（补充图2B）。
      6. 点击弹出以加载孔板。
        注意：打开孔板盖子，将孔板正面朝上放置，A行位于上方（补充图3A）。
      7. 输入孔板名称并点击确定。点击加载以载入孔板。
      8. 点击开始启动扫描。随后，使用"上、下、左、右"按钮校准A1、A12和H1孔的位置，并点击确认（补充图3B）。
        注意：软件将开始逐孔扫描。
      9. 扫描完成后，将弹出概览图像。点击关闭。
      10. 通过点击返回主控面板退出扫描。
    2. 使用软件对96孔板进行计数。
      1. 点击计数 > 智能计数。
      2. 软件将显示"第1步（共5步）：选择要计数的孔板"。点击加载孔板(s)，勾选整个文件夹，然后点击选择以导入已扫描的孔板（补充图4A）。
      3. 软件将显示"第2步（共5步）：定义计数参数"。点击调整参数，参数将显示出来（弥散处理；小/正常/大/最大/最大+1；斑点分离；计数区域；背景平衡；纤维去除；门控）。
        注意：从一个孔开始，反复检查并找到适用于所有孔的最佳设置。
      4. 完成后，点击下一步（补充图4B）。
      5. 软件将显示"第3步（共5步）：选择/取消选择孔"。完成要计数孔的选择后，点击下一步继续。
        注意：被选中用于计数的孔将在每个孔的右上角显示一个"C"标记（补充图5A）。
      6. 软件将显示"第4步（共5步）：输出设置"。点击查看/修改输出设置，检查设置（如图像格式）是否合适。点击保存并退出 > 下一步（补充图5B）。
      7. 软件将显示"第5步（共5步）：启动自动计数"。点击启动自动计数（补充图6A）。
      8. 完成后，点击退出自动计数。
  3. 在商用软件分析仪中执行质量控制（QC）。
    1. 在主控面板页面，点击质量控制 > 添加孔板(s)。勾选整个文件夹以导入已计数的孔板，点击选择 > 开始QC（补充图6B）。
    2. 双击每个孔以审核斑点。点击计数以删除任何斑点。软件将开始重新计数。
      注意：确保已勾选"斑点：删除"。计数完成可通过集落计数结果指示，例如"30"（补充图7A）。
    3. 当计数结束（由集落计数结果指示，例如"30"）时，点击"是"以确认删除斑点（补充图7B）。对要删除的斑点进行三次左键单击。右键单击完成操作，然后点击是。
    4. 完成质量控制后，点击完成孔板并进入项目概览。
  4. 使用软件分析仪进行成像。
    1. 查看已扫描、已计数并完成质量控制的孔板图像（图2）。

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结果

可采用蚀斑定量法（FFA）对ZIKV进行定量，其流程如图3所示。对于24孔板，在感染后48 h、60 h、72 h、84 h和96 h时间点固定感染的Vero细胞。结果显示，感染后96 h（4天）细胞仍保持完整（未观察到细胞脱落现象）（图4和补充图8A-E）。病毒蚀斑最早在感染后48 h（2天）出现（图4A-F），但此时蚀斑尺寸过小，难以准确计数。感染后60 h（2.5天）时，蚀斑大小最为理想（图4B）。而在后续时间点（感染后72 h、84 h和96 h），蚀斑更大，并趋于融合或重叠，且融合或重叠的蚀斑随时间逐渐增多（图4C-E）。因此，选择感染后60 h（2.5天）形成的蚀斑用于测定24孔板中ZIKV的滴度（

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讨论

有多种方法可用于测定病毒滴度；蚀斑形成试验（PFA）与焦点形成试验（FFA）具有相似的病毒定量方案，即通过稀释病毒接种物，使单个蚀斑或焦点能够被区分。染色后，每个蚀斑或焦点代表接种物中的一个感染性病毒颗粒19。PFA 使用结晶紫染色以显示由细胞裂解或死亡引起的蚀斑形成。因此，PFA 更为耗时，因为它需要更长的培养时间以使病毒引发明显的细胞病变效应（CPE），且仅适用于能够诱导细胞裂解或死亡的病毒。许多实验室已成功应用FFA测定黄病毒属病毒（包括ZIKV）的感染性病毒滴度19,20,21,22,23,24,25。FFA 是一种基于细...

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披露

作者声明不存在任何竞争利益。

致谢

本研究获得了马来西亚高等教育 Ministry 在长期研究资助计划（LRGS MRUN 第一阶段：LRGS MRUN/F1/01/2018）以及卓越高等研究机构（HICoE）项目（MO002-2019）资金支持。本研究中的图3展示了焦点形成实验染色的工作流程，改编自 BioRender.com（2022）提供的"DAB Immunohistochemistry"。检索自 https://app.biorender.com/biorender-templates/t-5f3edb2eb20ace00af8faed9-dab-immunohistochemistry。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
0.22 µm 聚醚砜注射器滤器SartoriusS6534-FMOSK
1.5 mL 微量离心管Nest615601
10 mL 无菌刻度移液管Labserv14955156
1× Dulbecco’s 磷酸盐缓冲液（dPBS）Gibco14190-136
2.0 mL 螺口管 AxygenSCT-200-SS-C-S
24 孔板Corning3526
25 mL 无菌刻度移液管Labserv14955157
3,3'-二氨基联苯胺（DAB）过氧化物酶底物Thermo Scientific34065
37 °C、5% CO2 培养箱SanyoMCO-18AIC
5 mL 无菌刻度移液管Labserv14955155
50 mL 离心管FalconLAB352070
75 cm2 组织培养瓶 Corning430725U
96 孔板Falcon353072
抗黄病毒单克隆抗体 4G2（克隆号 D1-4G2-4-15）MilliporeSigmaMAB10216
高压灭菌的 20× 磷酸盐缓冲液（PBS）N/AN/A含 8 mM Na2HPO4 22.8 g、1.5 mM KH2PO4 4.0 g、0.14 M NaCl 160 g、2.7 mM KCl 4.0 g，加 MilliQ H2O 至 1 L
II 级生物安全柜HoltenHB2448
CTL S6 通用 ELISpot/FluoroSpot 分析仪ImmunoSpot, Cellular Technology Limited (CTL)CTL-S6UNV12商用软件分析系统
Dulbecco 改良 Eagle 培养基（DMEM）Gibco12800-017
胎牛血清（FBS）BovogenSFBS
辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗小鼠 IgG 二抗MilliporeSigma12-349
血细胞计数板Laboroptik LTD改良型 Neubauer
IGEPAL CA-630 去垢剂Sigma-AldrichI8896辛基苯氧基聚乙氧基乙醇 IGEPAL 
倒置显微镜ZEISSTELAVAL 31
实验室摇床FINEPCRCR300
L-谷氨酰胺Gibco25030-081
低黏度羧甲基纤维素钠（CMC）Sigma-AldrichC5678
多通道移液器（10 - 100 µL）Eppendorf3125000036
多通道移液器（30 - 300 µL）Eppendorf3125000052
多聚甲醛Sigma-AldrichP6148
青霉素-链霉素Gibco15140-122
单通道移液器（10 - 100 µL）Eppendorf3123000047
单通道移液器（100 - 1000 µL）Eppendorf3123000063
单通道移液器（20 - 200 µL）Eppendorf3123000055
脱脂奶粉Sunlac Low FatN/A用 1× PBS 配制 3% 脱脂奶粉用于染色封闭步骤
次氯酸钠CloroxN/A用于消毒来自培养瓶/板的废弃感染性液体废物
体视显微镜NikonSMZ1000
10 mL 一次性注射器，鲁尔锁头，带 21 G 针头TerumoSS10L21G
Vero 非洲绿猴肾细胞 -ECACC 88020401由合作者提供。然而，从其他供应商获得的 Vero 细胞经适当优化后也应可用于本实验。

参考文献

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