病毒传播和基于细胞的比色定量

Summary

本方案描述了寨卡病毒（ZIKV）在Vero非洲绿猴肾细胞中的繁殖，以及使用基于细胞的比色免疫检测方法以24孔和96孔（高通量）形式对ZIKV进行定量。

Abstract

寨卡病毒（ZIKV）是一种蚊媒病毒，属于 黄病毒属。ZIKV感染与先天性脑部异常有关，并可能与成人的吉兰-巴雷综合征有关。研究寨卡病毒以了解疾病机制对于促进疫苗和治疗开发非常重要。在病毒学领域，量化病毒的方法至关重要。焦点形成测定 （FFA） 是一种病毒定量测定，它使用抗体检测病毒抗原并使用过氧化物酶免疫染色技术鉴定细胞的感染病灶。目前的研究描述了使用 24 孔和 96 孔（高通量）格式的病毒传播和定量方案。与其他类似研究相比，该协议进一步描述了病灶大小优化，可以作为扩大该测定对其他病毒使用范围的指南。首先，ZIKV在Vero细胞中繁殖3天。使用FFA收获并定量含有ZIKV的培养上清液。简而言之，将病毒培养物接种到Vero细胞上并孵育2-3天。然后，在优化的染色过程（包括细胞固定、透化、封闭、抗体结合和与过氧化物酶底物孵育）后确定病灶形成。使用体视显微镜（24孔格式的手动计数）或软件分析仪（96孔格式的自动计数）观察染色的病毒病灶。FFA 提供可重复的、相对较快的结果（3-4 天），适用于不同的病毒，包括非斑块形成病毒。随后，该方案可用于ZIKV感染的研究，并可用于检测其他临床上重要的病毒。

Introduction

寨卡病毒（ZIKV）感染是一种新出现的蚊媒病毒性疾病。1947 年在乌干达首次分离出 ZIKV ^1,2;从 1947 年到 2007 年，它仍然被忽视，因为临床症状最常见的是无症状的，其特征是自限性发热性疾病。2007 年，寨卡病毒流行始于雅浦群岛 ^3,4，随后于 2013 年至 2014 年在太平洋地区（法属波利尼西亚、复活节岛、库克群岛和新喀里多尼亚）发生更大规模的流行病 ^5,6,7,8，其中首次在成人中报告了严重的神经系统并发症吉兰-巴雷综合征 （GBS）⁹.在2015年和2016年期间，早在2013年巴西出现亚洲寨卡病毒基因型后，寨卡病毒首次大范围流行席卷美洲¹⁰。在这次疫情期间，新生儿中报告了44万至130万例小头畸形和其他神经系统疾病^病例11。目前尚无针对寨卡病毒感染的特异性治愈或治疗方法;因....

Protocol

1. 病毒传播

1. 细胞制备
   1. 在含有 12 mL Dulbecco 改良 Eagle 培养基 （DMEM） 的 75 cm² 细胞培养瓶中培养 Vero 细胞，补充有 10% 胎牛血清 （FBS） 和 2 mM L-谷氨酰胺（参见 材料表）。在37°C的细胞培养箱中用5%CO₂孵育细胞。
   2. 在显微镜下监测细胞;一旦细胞达到70%-90%的汇合度，它们就可以使用了（图1A）。
      注意:Vero细胞大约每24小时翻一番¹⁷。1:10 的稀释度需要 3 到 4 天才能在 75 cm² 烧瓶中达到 80%-90% 的汇合度。每天或每隔一天监测细胞。
2. 细胞单层感染
   1. 使用 10 mL 血清移液管从细胞培养瓶中取出生长培养基。使用 5 mL 血清移液管用 3 mL Dulbecco 磷酸盐缓冲盐水 （dPBS） 冲洗烧瓶 2 次。
      注意: 必须准备一个装有 10% 次氯酸钠的烧杯，以对烧瓶/板中丢弃的任何感染性液体废物进行消毒。
   2. 将 2 mL 无血清 DMEM（补充有 2 mM L-谷氨酰胺不含 FBS 的 DMEM）和 20 μL ZIKV 接种物加入细胞培养瓶中。在....

Results

ZIKV可以使用FFA进行量化，如图3所示。对于 24 孔板，将感染的 Vero 细胞固定在感染后 48 小时、60 小时、72 小时、84 小时和 96 小时。结果显示，感染后96小时（4天）后，细胞保持完整（未观察到细胞脱离）（图4和补充图8A-E）。在感染后48小时（2天）首次观察到病毒病灶的出现（图4A-F）。然而，病灶尺寸太小，难以准确计算病灶。在感染后60小时（2.5天）达到最佳病灶大小（图4B）。在后一个时间点（感染后72 h、84 h和96 h），病灶较大，趋于合并或重叠。合并或重叠的病灶随着时间的推移而增加（图4C-E）。因此，选择在感染后60小时（2.5天）形成的病灶来测定24孔板中的ZIKV滴度（

Discussion

有几种测定方法可以确定病毒滴度;PFA 具有与 FFA 相似的病毒定量方案，其中病毒接种物被稀释以区分单个斑块或病灶。染色后，每个斑块或病灶指示接种物¹⁹中的单个感染性颗粒。PFA用结晶紫染色，以可视化由细胞裂解或死亡引起的斑块形成。因此，PFA更耗时，因为病毒引起CPE需要更长的时间，并且仅限于诱导细胞裂解或死亡的病毒。许多实验室已成功使用 FFA 测定黄病毒的传染性病毒滴度，包括 ZIKV^{19、20、21、22、23、24、25}。FFA 是一种基于细胞的比色免疫检测方法，它用抗体检测病毒抗原，因此使用免疫染色技术识别感染细胞的.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.22 和微量;m 聚醚砜针头过滤器	Sartorius	S6534-FMOSK
1.5 mL 微量离心管	巢	615601
10 mL 无菌血清移液管	Labserv	14955156
1x Dulbecco's 磷酸盐缓冲盐水 （dPBS）	Gibco	14190-136
2.0 mL 螺口盖管	Axygen	SCT-200-SS-C-S
24 孔板	康宁	3526
25 mL 无菌血清移液管	Labserv	14955157
3,3'二氨基联苯胺 （DAB） 过氧化物酶底	Thermo Scientific	34065
37 °含 5% CO2	Sanyo	MCO-18AIC
5 mL 无菌血清移液管	Labserv	14955155
50 mL 离心管	Falcon	LAB352070
75 cm2 组织培养瓶	康宁	430725U
96 孔板	Falcon	353072
抗黄病毒单克隆抗体，4G2（克隆 D1-4G2-4-15）	MilliporeSigma	MAB10216
高压灭菌 20x 磷酸盐缓冲盐水 （PBS）	N/A	N/A	22.8 克 8 mM Na2HPO< sub>4，4.0 克 1.5 mM KH2PO4， 160 克 0.14 M NaCl，4.0 克 2.7 mM 氯化钾，1 升 MilliQ H<亚>2O
生物安全柜，II 类	霍尔顿	HB2448
CTL S6 通用酶联免疫斑点/荧光斑点分析仪	ImmunoSpot，Cellular Technology Limited （CTL）	CTL-S6UNV12	商业软件分析仪
Dulbecco 改良 Eagle 培养基 （DMEM）	Gibco	12800-017
胎牛血清 （FBS）	Bovogen	SFBS
山羊抗小鼠 IgG 二抗与辣根过氧化物酶 （HRP） 偶联	MilliporeSigma	12-349
血细胞计数器	Laboroptik LTD	Neubauer 改进的
IGEPAL CA-630 去污剂	Sigma-Aldrich	I8896	辛基苯氧基聚（乙烯氧基）乙醇IGEPAL
倒置显微镜	蔡司	TELAVAL 31
实验室摇杆	FINEPCR	CR300
L-谷氨酰胺	Gibco	25030-081
低粘度羧甲基纤维素 （CMC）	Sigma-Aldrich	C5678
多通道微量移液器（10 - 100 µL）	Eppendorf	3125000036
多通道微量移液器 （30 - 300 µL）	Eppendorf	3125000052
多聚甲醛	Sigma-Aldrich	P6148
青霉素-链霉素	Gibco	15140-122
单通道移液器（10 - 100 µL）	Eppendorf	3123000047
单通道移液器 （100 - 1000 µL）	Eppendorf	3123000063
单通道移液器（20 - 200 µL）	Eppendorf	3123000055
脱脂牛奶	Sunlac 低脂	N/A	在 1x PBS 中制备 3% 脱脂牛奶，用于染色的封闭阶段
氯酸钠	Clorox	N/A	消毒培养瓶/板中丢弃的传染性液体废物
立体显微镜	Nikon	SMZ1000
注射器一次性，鲁尔锁，10 mL，带 21 G 针	头 Terumo
Vero 非洲绿猴肾细胞	-	ECACC 88020401	从合作者处收到。但是，从其他供应商处获得的 Vero 单元应该能够在进行一些优化的情况下使用。