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利用 Micro-C-XL 绘制哺乳动物三维基因组相互作用

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DOI：

10.3791/64579

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2023年11月3日

 ,  , 
1Novo Nordisk Foundation Center for Protein Research, University of Copenhagen

本文内容

摘要

本文介绍了一种利用全基因组染色体构象捕获方法Micro-C-XL，以核小体分辨率绘制三维基因组结构的实验方案。

摘要

三维（3D）染色体结构是基因组调控和细胞类型特化的重要因素。例如，被称为增强子的顺式调控元件被认为通过在三维空间中的相互作用来调控远端启动子的活性。via 全基因组染色体构象捕获（3C）技术（如 Hi-C）极大地改变了我们对基因组在细胞内组织方式的理解。目前对三维基因组结构的认识受到染色体在三维空间中拓扑结构解析分辨率的限制。Micro-C-XL 利用微球菌核酸酶（MNase）在染色体构象捕获实验过程中对基因组进行片段化，从而以核小体（染色质的基本单位）水平的分辨率测量染色体折叠状态。该方法提高了测量中的信噪比，因此相较于其他全基因组三维技术，更有利于绝缘位点和染色体环的检测。本文提供了一个配有图示的、详细的分步操作方案，用于从哺乳动物细胞制备高质量的 Micro-C-XL 样品。

引言

Micro-C-XL 是一种可在核小体分辨率下检测全基因组三维基因组构象的技术。Micro-C-XL 基于广泛应用的邻近连接 Hi-C 技术，该技术已极大地推动了我们对三维基因组组织方式的理解1。Micro-C-XL 及其最初版本 Micro-C 最初在 Saccharomyces cerevisiae2,3 中开发，随后被改进并应用于哺乳动物细胞体系，在该体系中，该实验方案已展现出其在检测三维基因组短程特征（如染色体环和绝缘位点）方面的充分潜力。本版本基于近期发表的哺乳动物 Micro-C-XL 研究4,5。由于 Micro-C-XL 已取代 Micro-C，因此在本文中将 Micro-C-XL 统称为 Micro-C。

Micro-C 与 Hi-C6 的主要区别如下：1）使用微球菌核酸酶（MNase）对基因组进行片段化，而非限制性内切酶；2）使用反应基团之间原子间距更大的附加交联剂，而不仅使用甲醛。这两个步骤均使其 Micro-C 相较于传统 Hi-C 具有更高的信噪比。片段化大小限制了在邻近连接实验中可解析的三维基因组结构的分辨率。MNase 是一种优先消化可及性 DNA 而保留核小体保护 DNA 完整的核酸酶。利用 MNase 测序进行核小体足迹分析表明，核小体几乎完全覆盖大多数真核生物基因组7。由于核小体在基因组中呈分布状态，平均间距为 160–220 bp，具体数值因物种和细胞类型而异，因此 MNase 是用于高分辨率解析基因组结构的理想酶。

在Micro-C方法中，联合使用甲醛（FA）和额外的交联剂可进一步提高信噪比2,8。具有较长原子间隔基团的胺特异性交联剂有助于促进蛋白质-蛋白质交联。这类交联剂通常为二琥珀酰亚胺基戊二酸酯（DSG）或乙二醇双琥珀酰亚胺基琥珀酸酯（EGS），其间隔基长度分别为7.7 Å和16.1 Å。通过EGS或DSG降低背景噪声在高片段化率的实验（如Micro-C）中尤为明显，这可能归因于随机连接事件发生率的降低8。

一种近期开发的Hi-C 3.0方案利用ESG/DSG交联和多种限制性内切酶组合，可降低Hi-C实验中的噪声，并显著提高染色体环和绝缘位点的检测能力8,9。然而，对不同相互作用数据特征进行逐位点比较发现，与Hi-C 3.0和传统Hi-C相比，Micro-C在短程特征（如染色体环和绝缘位点）的检测方面表现更优8。尽管如此，与传统Hi-C相比，Hi-C 3.0仍能改善短程特征的检测，并保持对基因组区室化结构的强检测能力。综上所述，染色体构象捕获方法的选择应根据具体的研究目标和生物学问题来确定。

本文提供了一套详细的Micro-C实验操作流程，可用于解析三维基因组结构。

方案

1. 细胞培养与交联

  1. 根据实验需求培养细胞，以获得至少 1 x 107 个细胞。此处，细胞在 E14 培养基（含丙酮酸钠和 L-谷氨酰胺的 DMEM，15% 胎牛血清，1x 白血病抑制因子（LIF），1x 非必需氨基酸（NEAA），1% 青霉素-链霉素，0.1 mM β-巯基乙醇 [参见 材料表]）中，于 37 °C、5% CO2 条件下培养，并每两天传代一次。
    注意：本方案已成功应用于多种物种的多种细胞类型，例如 Homo sapiens 和 Mus musculus。本示例中使用的是小鼠胚胎干细胞（ES 细胞）。
  2. 当细胞融合度达到 70%–80% 时，吸除培养基收获细胞。用 5 mL DPBS 洗涤一次，然后每 10 cm 培养皿加入 3 mL 预热的 0.25% 胰蛋白酶，在 37 °C 下孵育 2–3 分钟。
  3. 加入 7 mL 预热的 E14 培养基以终止胰蛋白酶反应，并将脱落的细胞转移至 50 mL 离心管中。
  4. 在室温（RT）下以 300 x g 离心 5 分钟收集细胞。弃去上清液，将细胞沉淀重悬于培养基中，并使用细胞计数仪计数细胞。
    注意：本方案对细胞浓度的轻微变化具有一定的耐受性，已使用多种细胞计数仪进行细胞数量测定；但需注意所用细胞计数仪的动态范围，通常为 1 x 105–1 x 107 个细胞/mL。虽然本离心速度和时间已针对该细胞类型进行过测试，但体积更小的细胞可能需要更高的离心速度或更长的离心时间，应相应调整离心条件。
  5. 在室温下以 300 x g 离心 5 分钟收集细胞，并将细胞重悬于 DPBS 中，终浓度为 1 x 106 个细胞/mL。例如，若细胞产量为 1 x 107 个，则将细胞重悬于 10 mL DPBS 中。
  6. 进行第一次交联时，向细胞悬液中加入 37% 甲醛（FA），使其终浓度为 1%，并在室温下旋转孵育（15–20 rpm）10 分钟；例如，若细胞产量为 1 x 107 个，则向 10 mL 细胞悬液中加入 270 µL FA。
    注意：FA 溶液在开封后通常可在室温下稳定保存长达 3 个月。
  7. 加入 2.5 M 甘氨酸至终浓度 0.25 M 以终止反应，在室温下旋转孵育（15–20 rpm）5 分钟。例如，若细胞产量为 1 x 107 个，则向细胞悬液中加入 1.027 mL 2.5 M 甘氨酸。
  8. 在室温下以 300 x g 离心 5 分钟收集细胞。弃去上清液，将细胞重悬于 5 mL DPBS 中。重复离心一次，然后将细胞沉淀重悬于 DPBS 中，终浓度为 4 x 106 个细胞/mL。例如，若细胞产量为 1 x 107 个，则将细胞重悬于 2.5 mL DPBS 中。
  9. 进行第二次交联时，用 DMSO 配制 0.3 M 乙二醇双（琥珀酰亚胺基琥珀酸酯）（EGS）储备液（13.6 mg EGS 溶于 100 µL DMSO）。向细胞悬液中加入 EGS 至终浓度 3 mM，在室温下旋转孵育（15–20 rpm）40 分钟。例如，若细胞产量为 1 x 107 个，则向 2.5 mL 细胞悬液中加入 25 µL 0.3 M EGS 储备液。
    注意：配制储备液前，应将 EGS 在室温下平衡至少 20 分钟。
  10. 加入 2.5 M 甘氨酸至终浓度 0.4 M 以终止反应，在室温下旋转孵育（15–20 rpm）5 分钟。例如，若细胞产量为 1 x 107 个，则向细胞悬液中加入 400 µL 2.5 M 甘氨酸。
  11. 在室温下以 1,000 x g 离心 5 分钟收集细胞，将细胞沉淀重悬于 DPBS 中，终浓度为 5 x 106 个细胞/mL。将 5 x 106 个细胞/管分装用于制备文库，1 x 106 个细胞/管分装用于微球菌核酸酶（MNase）消化滴定实验。
    注意：建议对每批交联细胞进行最佳消化程度的滴定。理想情况下，为 MNase 滴定实验（步骤 2）准备两到三个 1 x 106 个细胞的等分试样，为制备实验（步骤 3）准备两到四个 5 x 106 个细胞的等分试样。
  12. 在室温下以 1,000 x g 离心 5 分钟收集细胞，弃去上清液。将细胞沉淀在液氮中速冻，并于 −80 °C 保存。
    ​注意：成功构建的 Micro-C 文库可来自保存长达 3 个月的样品。

2. MNase 滴定

注意：在处理双重交联细胞的制备文库之前，必须进行微球菌核酸酶（MNase）滴定，以确定 MNase 的最佳浓度。

  1. 进行MNase滴定实验时，将一管含1 × 106个细胞的冻存细胞置于冰上解冻10分钟，并用500 µL DPBS重悬细胞（若细胞易贴壁，可加入1× BSA）。将细胞悬液置于冰上孵育20分钟。
  2. 在室温下以10,000 × g离心5分钟收集细胞，弃去上清液。用500 µL MB#1缓冲液（50 mM NaCl、10 mM Tris-HCl、5 mM MgCl2、1 mM CaCl2、0.2% NP-40、1×蛋白酶抑制剂[见材料表]，pH 7.4）重悬细胞沉淀。
  3. 再次在室温下以10,000 × g离心5分钟收集细胞，弃去上清液。将细胞沉淀重悬于200 µL MB#1缓冲液中，并将样品均分为四份，分装至四个离心管中。
  4. 解冻一管MNase（20 U/µL），用pH 7.4的10 mM Tris缓冲液依次进行1:2、1:4、1:4和1:4梯度稀释，得到浓度分别为10 U/µL、2.5 U/µL、0.625 U/µL和0.1256 U/µL的MNase溶液（每种浓度用于一种消化条件）。以适当的时间间隔（10–20秒），向四个样品中的第一个加入1 µL MNase溶液，涡旋混匀后，在37 °C下于恒温混匀仪中孵育10分钟（800 rpm振荡）。随后依次向其余三个细胞样品中加入剩余稀释梯度的MNase溶液（各1 µL）。
  5. 通过向每个管中加入200 µL新配制的STOP缓冲液（150 µL pH 7.4的10 mM Tris、25 µL 10% SDS、25 µL 20 mg/mL蛋白酶K、2 µL 0.5 M EGTA），以与添加MNase相同的顺序和时间间隔终止MNase消化反应。在65 °C下孵育2小时。
  6. 向每个样品中加入500 µL苯酚-氯仿-异戊醇（PCI），充分涡旋混匀。在室温下以19,800 × g离心5分钟以分离相层，将水相转移至新的离心管中（约200 µL/样品）。
    警告：PCI含有多种有毒成分，必须在化学安全通风橱中操作。详情请参阅制造商说明。
  7. 按照商业DNA纯化试剂盒的说明书纯化DNA（见材料表），并用12 µL洗脱缓冲液洗脱样品。
    注意：去蛋白化步骤（步骤2.5）中的SDS浓度可能抑制某些DNA纯化试剂盒的效果。本实验所用DNA纯化试剂盒的性能与乙醇沉淀法相当。
  8. 加入2–5 µL上样染料，将样品在1.5%琼脂糖凝胶中以120 V电泳30–50分钟（直至条带清晰分离；图1A）。
  9. 根据实验需求选择最佳的消化程度，并继续进行制备性MNase消化。理想的消化程度应几乎无核小体亚片段，且单核小体与双核小体的比例在70%–90%之间。
    ​注意：本实验中，图1A第4泳道的消化程度被确定为最佳，对应使用0.625–1.25 U MNase处理2.5 × 105个细胞（即每1 × 106个细胞使用2.5–5 U MNase）。详细讨论请参见代表性结果部分。

3. 制备性MNase消化

  1. 将染色质片段化至单核小体 通过 MNase 消化，解冻先前双重交联的 5 x 106 细胞分装后，用1 mL DPBS重悬，冰上孵育20分钟（若细胞贴附管壁，可加入1× BSA）。
  2. 通过离心在 10,000 x g 条件下收集细胞 g 室温下孵育5分钟，弃去上清液。将沉淀重悬于500 µL MB#1缓冲液中。重复离心步骤一次。将沉淀重悬于1 mL MB#1缓冲液中，分装为每管200 µL（1 x 10⁶细胞/管）。6 每份样品的细胞数。
  3. 根据MNase滴定结果（见步骤2），通过加入适量的MNase（通常为每1 × 10⁶个细胞2.5–10 U/µL）消化染色质6 向每份等分试样中加入细胞。充分混匀（涡旋并快速离心），然后在37 °C下于恒温混匀仪中以800 rpm振荡孵育10分钟。
  4. 通过向每份等分试样中加入1.6 µL 0.5 M EGTA（终浓度4 mM）终止MNase消化，并在65 °C下于恒温混匀仪中以800 rpm振荡孵育10分钟。
  5. 以 10,000 x g 离心收集样品 g 室温孵育5分钟，弃去上清液。将细胞沉淀重悬于500 µL 1× NEBuffer 2.1中。
  6. 汇集相当于 5 x 10 的输入量的样本6 细胞或更少数量的细胞用于后续处理。
    注意：如果超过 5 x 106 细胞需进行处理时，应将这些样本平行处理，因为酶促反应条件是针对5 x 10优化的6 细胞
  7. 在进行邻近连接步骤之前，取出10%样品作为输入对照，以监测MNase消化程度。向该样品中加入150 µL 10 mM Tris（pH 7.4）、25 µL 10% SDS和25 µL 20 mg/mL蛋白酶K，于65 °C孵育过夜。

4. DNA 末端处理与邻近连接

  1. 在 4 °C 条件下以 10,000 × g 离心 5 分钟收集剩余样品，弃去上清液。将沉淀重悬于 90 µL 新鲜配制的 Micro-C 主混合液 1（表 1）中，在 37 °C 下以 800 rpm 振荡孵育 15 分钟。
  2. 加入 10 µL 浓度为 5 U/µL 的 Klenow 片段，在 37 °C 下以 800 rpm 振荡孵育 15 分钟。
  3. 加入 100 µL 新鲜配制的 Micro-C 主混合液 2（表 2），在 25 °C 下以 800 rpm 振荡孵育 45 分钟。孵育结束后，加入 EDTA 至终浓度为 30 mM 以终止酶促反应，随后在 65 °C 下以 800 rpm 振荡孵育 20 分钟。
  4. 在 4 °C 条件下以 10,000 × g 离心 5 分钟收集样品，弃去上清液。将样品重悬于 500 µL 新鲜配制的 Micro-C 主混合液 3（表 3）中，在室温下以 15–20 rpm 旋转孵育 2.5 小时。
  5. 在 4 °C 条件下以 10,000 × g 离心 5 分钟收集样品，弃去上清液。将样品重悬于 200 µL 新鲜配制的 Micro-C 主混合液 4（表 4）中，在 37 °C 下以 800 rpm 振荡孵育 15 分钟。
  6. 进行逆转交联和去蛋白化：向样品中加入 25 µL 浓度为 20 mg/mL 的蛋白酶 K 和 25 µL 10% SDS，于 65 °C 过夜孵育，并间歇混匀。

5. 双核小体DNA的纯化与片段大小选择

  1. 向样品和输入对照中加入 500 µL PCI，涡旋混匀。在 19,800 x g 条件下离心 5 分钟以分离相，然后将上层水相转移至新的离心管中。
  2. 通过 DNA 纯化试剂盒或乙醇沉淀法浓缩 DNA。将样品在 30 µL（步骤 5.3）中洗脱，输入对照在 15 µL（步骤 3.11）中洗脱，并运行 1.5 % 琼脂糖凝胶电泳以分离单核小体和双核小体（图 1B）。
    注意：去蛋白化步骤中的 SDS 浓度可能抑制某些 DNA 纯化试剂盒的效果。本实验所用的 DNA 纯化试剂盒（见 材料表）性能与乙醇沉淀法相当。根据所用细胞数量的不同，输入 DNA 的量可在 100 ng 至 10 µg 范围内。通常情况下，从 5 x 106 个细胞中可提取 1–5 µg DNA。
  3. 切取大小为双核小体（约 300 bp）的 DNA 片段。使用市售的 DNA 凝胶回收试剂盒（见 材料表）从琼脂糖凝胶中回收 DNA，并在 150 µL 洗脱液中洗脱。

6. 链霉亲和素磁珠的制备

  1. 每个样本取 10 µL 链霉亲和素磁珠（参见材料表）加入反应管中。
  2. 将反应管置于适用于 1.5 mL 管的磁力架上（参见材料表）。待溶液澄清后（1–2 分钟），吸去上清液，每个样本用 300 µL 1× TBW 缓冲液（5 mM Tris-HCl，pH 7.5，0.5 mM EDTA，1 M NaCl，0.05% Tween 20）重悬磁珠。重复此步骤一次。
  3. 将磁珠重悬于每份在步骤 7 中处理的样本 150 µL 的 2× B&W 缓冲液（10 mM Tris-HCl，pH 7.5，1 mM EDTA，2 M NaCl）中。

7. 链霉亲和素下拉及磁珠上文库制备

  1. 将150 µL预处理的磁珠（步骤6.3）加入150 µL样品（步骤5.3）中。室温下旋转孵育20分钟（15–20 rpm）。
  2. 将离心管置于合适的磁力架上，静置至溶液澄清（1–2分钟）。吸除上清液，并将磁珠重悬于300 µL的1× TBW中。重复此步骤一次。
  3. 将离心管置于合适的磁力架上，静置至溶液澄清（1–2分钟）。吸除上清液，并将磁珠重悬于100 µL的0.1× TE缓冲液（1 mM Tris，0.1 mM EDTA，pH 8.0）中。
  4. 将离心管置于合适的磁力架上，静置至溶液澄清（1–2分钟）。吸除上清液，将磁珠重悬于50 µL的0.1× TE缓冲液中，并转移至PCR管中。
    注意：所用0.1× TE缓冲液的体积（50 µL）对应于本实验所用DNA测序文库构建试剂盒（见材料表）的输入体积。若使用其他试剂盒或策略，请相应调整体积。
  5. 根据测序文库构建试剂盒的生产商说明书进行DNA操作步骤。这些步骤通常包括DNA末端修复（平端化）、A尾添加、接头连接和U碱基切除。最后一步（U碱基切除）为本研究所用试剂盒特有。若使用该试剂盒，请按照试剂盒说明书从步骤1至步骤2.6操作，使用未稀释的接头，并在步骤2.6之后无需考虑−20 °C保存。
    注意：测序试剂盒所需的缓冲体系更换必须通过磁珠在磁力架上的结合及洗涤步骤（步骤7.3至7.4）完成，因为DNA仍结合在链霉亲和素磁珠上。此外，由于DNA结合在磁性磁珠上，应忽略试剂盒说明书中接头连接后的任何纯化和片段大小选择步骤。继续进行步骤7.6（本方案）。
  6. 完成接头连接后，按步骤7.2所述方法洗涤样品。弃去上清液，并将磁珠重悬于20 µL的0.1× TE缓冲液中。

8. 所需PCR循环次数的估算

注意：建议估算文库扩增所需的PCR循环数。通常，Micro-C文库需要进行8-15个PCR循环。尽管该步骤并非必需，但它有助于避免过度扩增，并降低PCR重复序列产生的风险。

  1. 为了确定所需的最少PCR循环次数，使用1 µL链霉亲和素-生物素-DNA样品（步骤7.6）进行PCR。具体操作为：向样品中加入PCR预混液（3.2 µL H2O、0.4 µL i5引物、0.4 µL i7引物和5 µL Q5高保真DNA聚合酶）。根据所使用的DNA文库构建试剂盒的制造商说明，进行16个循环的PCR反应。
    注：此处使用的引物需从单独的试剂盒中购买（见材料表），且必须与所用的文库构建试剂盒兼容。
  2. PCR反应完成后，使用适当的磁铁收集磁珠，并使用高灵敏度DNA定量仪器（见材料表）测定1 µL上清液中的DNA浓度。为获得总DNA浓度，将该数值乘以10（PCR反应的总体积）。所需PCR循环数的估算方法参见代表性结果部分。
  3. 向剩余的9 µL PCR混合物中加入2 µL 6x上样缓冲液。在1%琼脂糖凝胶上分离扩增后的PCR文库，以确认接头连接成功，预期条带大小约为450 bp（图1C）。
    ​注：凝胶应显示一条约420 bp的清晰条带（Micro-C文库加上接头）。120 bp的条带代表接头二聚体，提示文库复杂度较低。可能出现较低分子量的条带（小于100 bp），这些是PCR反应中未使用的引物。

9. 测序文库扩增

  1. 向剩余的19 µL链霉亲和素-生物素-DNA样品中加入PCR预混液（65 µL H2O、100 µL Q5高保真DNA聚合酶、8 µL i5引物、8 µL i7引物）。将反应混合物分装为50–100 µL的等份。
    注意：PCR的最佳体积取决于PCR仪型号；通常情况下，50 µL在常见的PCR仪中可获得最可重复的扩增效果。
  2. 根据DNA文库构建试剂盒的说明书进行PCR扩增，循环数依据步骤8确定。若未执行步骤8，建议进行14个循环。
  3. 使用磁性磁珠（参见材料表）按1:0.9的比例依照生产商方案纯化DNA。用20 µL 0.1% TE缓冲液洗脱。
    注意：若在步骤8.5中检测到接头二聚体，建议以相同比例进行两次纯化。
  4. 测定DNA浓度，并在质量控制系统上运行样品（参见材料表）。通过观察是否存在单一清晰条带来确认Micro-C文库的良好质量（图1D）。
    ​注意：由于PCR前已对样品进行洗涤，磁珠上建库过程中通常不易出现接头二聚体。因此，若出现接头二聚体，提示文库复杂度较低。如观察到接头二聚体，强烈建议使用低投入量测序对样品进行质量控制。

10. DNA测序与数据处理

  1. 根据测序服务提供商的要求，对 Micro-C 文库进行双端测序。
    注意：理想情况下，样本应在测序平台上以双端模式进行测序，每条读长为 50 bp。过去也成功使用过读长较短的较早平台，例如 2 × 35 bp。重要的是，如果研究涉及基因组重复区域，建议采用更长的读长进行测序。
  2. 为评估 Micro-C 文库的质量，对每个样本进行低输入量测序，测序深度为 5 × 106 至 1 × 107 条 reads。
  3. 使用 Distiller10 处理测序文件（fastq 文件）。将 reads 比对至相应的参考基因组（本研究中为 mm10）。
    注意：测序文件可在本地计算机或计算集群上使用多种分析流程进行处理。对于测序深度较低的样本，可采用较大的分箱尺寸（例如 10,000 bp、50,000 bp、100,000 bp 和 500,000 bp），以降低计算需求和文件大小。本研究所使用的 Distiller 软件可生成所有必需的文件类型，用于评估 Micro-C 文库的质量。生成的 *.stats 文件包含比对率、顺式-反式比值以及按 read 对之间距离分层的读段方向信息。这些参数在 图 2 中进行了可视化展示，Micro-C 文库质量的评估在代表性结果部分进行讨论。处理软件还会生成 mcool 文件，可直接加载至 HiGlass（https://docs.higlass.io/）以生成相互作用矩阵9。

结果

Micro-C 文库构建是否成功，可在实验方案的多个步骤中进行评估。其中最重要的一步是选择适当的 MNase 消化程度。因此，必须对 MNase 浓度进行梯度优化，以确保每个样本中单核小体占比稳定达到双核小体的 70%–90%。需要注意的是，MNase 对常染色质和异染色质的消化效率不同，对异染色质的消化效率较低。因此，最佳消化程度取决于所研究的染色质区域以及细胞类型，因为不同细胞类型中常染色质与异染色质的相对比例具有特异性。因此，建议仔细优化所需 MNase 浓度，并首先通过低投入测序来评估 Micro-C 实验的成功与否。

经MNase梯度处理的染色质典型的MNase滴定图谱如图所示 图1A此处，每个反应使用250,000个细胞的染色质，并以四倍稀释的MNase进行消化。最高浓度（10 U MNase，第2泳道）显示染色质过度消化，几乎完全由单核小体DNA（约150 bp）组成。值得注意的是，与MNase浓度较低的样品相比，该泳道中单核小体条带在琼脂糖凝胶中的迁移位置更靠下，表明核小体DNA已被过度消化。过度消化的核小体在邻近连接反应中的连接效率较低，因此第2泳道样品不适用于Micro-C实验。第3泳道（2.5 U MNase）显示出接近适合Micro-C实验的消化程度：此时单核小体条带为主要产物，提示核小体过度消化的亚核小体弥散条带已减少，但仍存在。第4泳道（0.635 U MNase）在此滴定示例中代表Micro-C实验的理想消化条件：存在清晰的单核小体条带，且无亚核小体DNA；单核小体与双核小体DNA条带强度几乎相等，表明单核小体产率达到66%或更高。需注意，双核小体DNA的大小约为单核小体DNA的两倍（约320 bp vs. 约150 bp），因此其每摩尔DNA的条带强度是单核小体DNA的两倍。第5泳道（0.156 U MNase）显示染色质消化不足，几乎未产生核小体DNA，因此为不理想样品。

总之，在本示例中，使用 0.625 U MNase 消化 2.5 × 105 个小鼠 ES 细胞（相当于在 200 µL 体系中使用 2.5 U MNase 消化 1 × 106 个细胞）是进行 Micro-C 实验制备性消化的最佳起始条件。然而，也应考虑介于第 3 泳道和第 4 泳道样品所用条件之间的中间 MNase 浓度（相当于在 200 µL 体系中使用 5 U MNase 消化 1 × 106 个细胞）。需要特别注意的是，MNase 对染色质的消化不能线性放大，不建议将制备性消化规模放大超过 4 倍。若需从超过 1 × 106 个细胞制备 Micro-C 文库，建议将染色质按每份 1 × 106 个细胞分装进行消化，在 MNase 失活后再合并样品。

为了评估邻近连接实验方案的成功与否，应通过1.5%琼脂糖凝胶电泳（图1B）将输入对照样本（经MNase消化但未进行邻近连接，步骤3.8）与邻近连接后的样本（步骤5.3）进行比较。邻近连接后的单核小体条带大小约为300 bp，与双核小体相似。因此，单核小体与双核小体条带信号的比值应从以单核小体为主（泳道1）转变为以双核小体为主（泳道3和泳道4）。由于本步骤中的琼脂糖凝胶用于切取并纯化双核小体DNA，建议将样品分装至多个泳道，以避免加样过载。

建议通过最小循环数的PCR来评估所制备测序文库的质量和数量。在此过程中，取1 µL磁珠（占总样本的1/20）中的DNA，在10 µL PCR反应体系中进行16个循环的扩增。经过16个PCR循环后，最小PCR文库的总浓度通常在50–500 ng之间。理论上，若剩余19 µL样本也进行16个循环扩增，则对应可获得1–10 µg的文库。建议使用能够从总DNA中产生约100 ng文库所需的最少PCR循环数。假设PCR扩增呈对数增长，则可通过将19 µL输入样本在16个循环后获得的理论DNA浓度连续除以2，来推算生成100 ng文库所需的PCR循环数。例如，若1 µL样本经16个循环扩增后产量为100 ng，则相当于19 µL样本扩增后产量为1,900 ng。在此情况下，理想状态下总DNA经12个循环扩增可产生118 ng的测序文库（1,900 ng/[2 × 2 × 2 × 2] = 118 ng）。最小PCR反应中剩余的9 µL样本可用于通过琼脂糖凝胶电泳评估文库质量（图1C）。电泳结果应显示一条清晰的420 bp条带，且无接头二聚体（120 bp）条带。可能会出现较小的片段，这些片段对应于未使用的PCR引物。

接下来，在进行耗资较大的深度测序之前，建议通过低投入测序分析并确认Micro-C样本制备是否成功。通常，文库的测序深度应达到5 × 106 至 1 × 107 条读段，并根据以下标准进行评估：测序读段重复率、顺式与反式染色体相互作用比率，以及测序读段方向频率。Micro-C文库使用Distiller进行处理，这是一个全流程分析流程，利用cooler、pairtools和cooltools工具，将测序读段文件（Fastq格式）处理为读段配对文件（Bedpe格式）以及可扩展的相互作用矩阵（Cool和Mcool格式）10,11,12。该流程还会生成一个摘要文件，非常适合用于评估Micro-C文库的质量10（https://github.com/open2c/distiller-nf）。PCR重复率可反映测序文库的复杂性，可从生成的*.stats文件中提取。由500万个或更多细胞制备的高质量Micro-C文库，其PCR重复率应低于5%–10%。需要注意的是，某些测序平台在簇生成过程中会产生PCR重复，这与文库本身的复杂性无关。图2A展示了两个实验的相对重复率：一个是我们认为质量良好的样本，另一个是质量较差的样本。在此示例中，两个样本均表现出可接受的比对率。评估Micro-C文库质量的下一个标准是顺式与反式相互作用比率以及读段方向频率。在细胞核内，染色体占据各自独立的染色体区域，因此很少与其他染色体发生相互作用。较高的反式染色体相互作用检出率表明存在较高频率的随机连接。应注意，在本分析层级上，质量较差的样本相较于质量良好的样本表现出更高的反式染色体相互作用率（图2B）。对于Micro-C实验，顺式染色体相互作用率达到70%或更高为理想结果。

Micro-C 文库的片段大小与二核小体 DNA 条带相似，可能在邻近连接样品中共纯化，从而污染实验。这些污染物始终为顺式染色体相互作用。因此，评估测序读段的方向性比例非常重要。二核小体污染的程度可通过低输入量测序进行估计。二核小体 DNA 来源于两个相邻但未被 MNase 切割的核小体，因此其产生的测序读段始终呈现正向-反向（F 和 R）的方向性，且读段对之间的距离约为 320 bp。相比之下，邻近连接的片段可形成四种连接方向，产生 F-R、R-R、R-F 和 F-F 的读段对，理想情况下其丰度应相等（图 2C）。此外，这些读段对之间的距离呈现多样性。为估算二核小体污染物的数量，可从 distiller 生成的 *stats 文件中计算读段方向性的频率（图 2D）。值得注意的是，在本研究中，劣质样品的 F-R 读段比例（红色）高于优质样品，当按读段对距离进行分层时，这一差异更加明显（图 2E）。当读段对按距离分为小于 <562 bp 和 ≥562 bp 两组时，F-R 读段的比例在二核小体片段中占主导地位，尤其是在 Micro-C 文库中。其中，距离 <562 bp 的读段主要为 F-R 类型，而距离 ≥562 bp 的读段在四种可能的方向中分布均匀，表明 F-R 读段的全局性过度代表主要来源于二核小体污染物。562 bp 作为分组阈值是由 distiller 生成的 *stats 文件中的分箱方式决定的。尽管这对质量控制并非必需，但可通过提取 distiller 同时生成的 *pairs 文件中的距离信息，实现更精确的分组分析。需要强调的是，二核小体读段并不会降低 Micro-C 样品的质量，因为在数据处理过程中可以识别并忽略这些读段。然而，它们不包含有关三维相互作用的有价值信息，反而会稀释有效信息读段的比例。

因此，精确的MNase滴定以及通过低输入量测序进行的充分质量控制，是优化Micro-C实验质量的最佳工具。

凝胶电泳实验；亚核小体和二核小体DNA片段；micro-C文库分析。
图1：Micro-C实验流程的中间阶段。（A）用不同浓度MNase消化的2.5 × 105个小鼠胚胎干细胞（ES细胞）染色质的琼脂糖凝胶电泳结果。单核小体、二核小体和三核小体条带由箭头标示。M：DNA ladder（第1/6泳道）；每250,000个细胞使用10 U MNase（第2泳道）；每250,000个细胞使用2.5 U MNase（第3泳道）；每250,000个细胞使用0.625 U MNase（第4泳道）；每250,000个细胞使用0.156 U MNase（第2泳道）。（B）Micro-C制备样品（第3和第4泳道）以及MNase消化的输入对照（第1泳道）的1.0%琼脂糖凝胶电泳结果。第1和第2泳道（M：DNA ladder）经增强以突出单核小体与二核小体片段强度的相对变化。单核小体和二核小体条带由箭头标示。邻近连接样品中的二核小体条带包含二核小体和Micro-C文库DNA。（C）从1 µL样品扩增得到的Micro-C测序文库的1.0%琼脂糖凝胶电泳结果。第1泳道（M）：DNA ladder；第2泳道（S）：Micro-C文库。（D）最终Micro-C文库的Fragment Analyzer检测图谱。请点击此处查看该图的放大版本。

Hi-C测序分析、图谱比较、核小体连接、数据分析、顺式/反式染色体相互作用。
图2：优质样本与劣质样本在低起始量测序中的样本统计结果。（A）比对成功（绿色）与未比对上（红色）的测序读段百分比柱状图。（B）顺式和反式染色体相互作用的比对读段比例（已标准化）。数据集以顺式比对读段为基准进行标准化。顺式比对读段根据成对末端测序样本中第一和第二读段之间的距离进行分层：≤1 kbp（黄色）、>1 kbp 且 ≤10 kbp（橙色），以及 >10 kbp（红色）。（C）具有双核小体大小的潜在分子种类示意图。（D）优质样本与劣质样本所有读段对方向性的百分比。（E）与（D）相同，但按距离分层（左侧，<562 bp；右侧，≥562 bp）。请点击此处查看该图的放大版本。

组分1x4.4x
10x NEBuffer 2.110 µL44 µL
2 µL 100 mM ATP2 µL8.8 µL
100 mM DTT5 µL22 µL
H2O68 µL299.2 µL
10 U/µL T4 PNK5 µL22 µL
总量90 µL396 µL

表1：Micro-C主混合液1。末端切刻反应主混合液的组成。

组分1x4.4x
1 mM Biotin-dATP10 µL44 µL
1 mM Biotin-dCTP10 µL44 µL
10 mM dTTP 和 dGTP 混合液1 µL4.4 µL
10x T4 DNA 连接酶缓冲液5 µL22 µL
200x BSA0.25 µL1.1 µL
H2O23.75 µL104.5 µL

表2：Micro-C主混合液2。末端标记反应所用主混合液的组成。

组分1x4.4x
10x NEB T4 连接酶反应缓冲液50 µL220 µL
H2O422,5 µL1859 µL
T4 DNA 连接酶25 µL110µL

表3：Micro-C主混合液3。 临近连接反应主混合液的组成。

组分1x4.4x
10x NEBuffer 1.120 µL88 µL
H2O180 µL792 µL
ExoIII 核酸酶10 µL44 µL

表4：Micro-C主混合液4。用于生物素去除反应的主混合液组成。

讨论

Micro-C 实验的成功依赖于实验方案中几个关键步骤的精确操作。首先，使用额外的交联剂 DSG 或 EGS 进行交联时，可能因细胞类型不同而导致细胞聚集。在交联反应中添加 0.1%–0.5% 的 BSA 可显著减少聚集现象，同时不影响交联效率。交联效率低下会导致染色体间相互作用频率升高，提示存在随机连接。其次，但最为关键的步骤是使用 MNase 对染色质进行消化。染色质消化不足或过度（消化不足或过度消化）会导致邻近连接效率降低，或非邻近连接的二核小体比例升高。连接反应的效率可通过琼脂糖凝胶电泳（图 1B）进行评估，此外，低输入量测序也是最佳评估方法。如果低输入量测序结果显示较高的重复序列率（连接效率低）或二核小体比例升高，则应重新评估 MNase 的消化程度。值得注意的是，在执行实验流程过程中样品的损失可能导致文库复杂度降低。样品浓度最好在 DNA 纯化后（步骤 5.3）或通过最小循环数 PCR（步骤 8）进行评估。通常情况下，从 5 × 106 个哺乳动物细胞中纯化得到的 DNA 总产量为 >2 µg。应在 MNase 消化、ExoIII 消化以及 DNA 纯化后控制 DNA 浓度。内源性核酸酶的活性可能引起 DNA 降解，其丰度具有细胞类型和物种特异性。此外，基于柱的 DNA 纯化方法可能因与去蛋白化反应中的 SDS 不兼容而导致样品损失。若在此步骤中 DNA 浓度过低，可考虑采用乙醇沉淀法。

由于Micro-C需要针对特定样本进行MNase滴定，因此将其应用于小细胞群体（如来自各种模式生物的小型器官、胚胎和单细胞、类器官或患者活检样本）具有挑战性。在此，Hi-C 3.0提供了一种成熟的替代方案，利用序列特异性限制性内切酶进行终点反应8,9。

Micro-C 是一种广泛应用的高分辨率染色体构象技术，具有高动态范围和低噪声比，因此特别适用于研究短程染色体特征4,5,8，例如染色体环结构。Micro-C 的分辨率能够有效捕获启动子-增强子环，这些结构超出了 Hi-C 的检测极限，从而更深入地解析基因组结构与调控之间的关系13,14,15。此外，近期 DNA 捕获策略已与 Micro-C 相结合，将靶向基因组位点的位点特异性分辨率提升至前所未有的水平，揭示了三维基因组超结构的新见解16,17,18。总之，我们认为 Micro-C 及其衍生技术将成为解析三维基因组在转录调控中作用的关键技术，进而推动细胞类型分化与维持机制的研究。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

感谢Christl Gaubitz和Kathleen Stewart-Morgan对本文稿的审阅。感谢Anja Groth及Groth实验室在建立我们实验室过程中提供的支持。感谢CPR/reNEW基因组学平台工作人员的支持：H. Wollmann、M. Michaut和A. Kalvisa。诺和诺德基金会干细胞医学中心（reNEW）由诺和诺德基金会资助，项目编号为NNF21CC0073729。诺和诺德基金会蛋白质研究中心（CPR）由诺和诺德基金会资助，项目编号为NNF14CC0001。感谢诺和诺德干细胞医学中心reNEW哥本哈根分部Brickman实验室提供的小鼠胚胎干细胞。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1 mM 生物素-dATPJenna Bioscience NU-835-Bio14-S
1 mM 生物素-dCTPJenna BioscienceNU-809-BioX-S
10 mM dGTPNEBN0442S
10 mM dTTP NEBN0443S
10 U/ml T4 PNKNEBM0201L
100 U/L 外切核酸酶 IIINEBM0206L
10x NEBuffer 1.1NEBB7001S
10x NEBuffer 2.1NEBB7202S
10x T4 DNA连接酶缓冲液 NEBB0202A
不含 Mg²⁺ 的 1x DPBS+ 和 Ca2+ThermoFisher 14190144
1x LIF
2-巯基乙醇 50 mM Gibco313500100.1 mM β-巯基乙醇 
37% 甲醛 Sigma Aldrich252549-500ML注意。参见制造商提供的材料安全数据表（MSDS）
400 U/ml T4 DNA连接酶 NEBM0202L
5 U/ml Klenow片段NEBM0210L
琼脂糖BIO-RAD1613102注意。参见制造商提供的材料安全数据表（MSDS）
BSA 20 mg/mlNEBB9000S
CaCl2
细胞计数仪
二甲基亚砜（DMSO）Sigma AldrichD8418-100ML注意。参见制造商提供的材料安全数据表（MSDS）
Dynabeads MyOne 链霉亲和素 C1Invitrogen65001
DynaMag-2 磁力架Invitrogen12321D磁铁，用于1.5 ml离心管的磁铁
DynaMag-PCR 磁力架Invitrogen492025磁铁，用于PCR管的磁铁
EDTA 超纯 0.5 M pH 8.0Invitrogen15575-038
EGTA 超纯 0.5 M pH 8.0BioWorld40121266-1
乙醇 96% VWR Chemicals20824365质量控制系统 
溴化乙锭 Invitrogen15585-011
乙二醇双（琥珀酰亚胺基琥珀酸酯）（EGS）ThermoFisher21565
胎牛血清Sigma AldrichF752415% FBS
紫色上样缓冲液（6X）NEBB7024S
甘氨酸 PanReac AppliChemA1067.0500
Halt蛋白酶抑制剂（100倍浓缩液）ThermoFisher78430注意。参见制造商提供的材料安全数据表（MSDS）
IGEPAL CA-630（NP-40）Sigma Aldrich18896-50ML
MgCl 1 MInvitrogenAM9530G
微球菌核酸酶（MNase）沃辛顿LS004798
小鼠胚胎干细胞 
NaClSigma AldrichS9888-1KG
NEBNext Illumina多重测序接头（双端索引引物）NEBE7600S用于测序文库的扩增引物
NEBNext Ultra II DNA文库构建试剂盒（适用于Illumina）NEBE7645L测序文库制备试剂盒 
NEBNext Ultra II Q5 Master Mix NEBM0544S注意。参见制造商提供的材料安全数据表（MSDS）
非必需氨基酸溶液Gibco111400501x NEAA
青霉素-链霉素（10,000 U/mL）Gibco151401481% 青霉素-链霉素
蛋白酶K（40 mg/ml）GoldBioP-480-1注意。参见制造商提供的材料安全数据表（MSDS）
QIAquick 胶回收试剂盒QIAgen28706称为：DNA凝胶回收试剂盒 
QIAquick PCR 纯化试剂盒QIAgen28106称为：商业DNA纯化试剂盒 
Qubit dsDNA HS 检测试剂盒InvitrogenQ32854高灵敏度DNA定量仪器 
快速加载紫色1 kb plus DNA LadderNEBN0550S
SPRIselect 片段筛选磁珠贝克曼库尔特B23319顺磁性微珠 
ThermoMixer CEppendorf 5382000015称为：恒温混匀仪
Tris默克10708976001
胰蛋白酶
Tween 20Sigma AldrichP7949-100ML
超纯10% SDSInvitrogen15553-035
超纯苯酚-氯仿-异戊醇（PCI）Invitrogen15593-031
Fragment Analyzer

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