心脏内注射人前列腺癌细胞构建骨转移异种移植小鼠模型

摘要

本文介绍了一种通过心内注射人前列腺癌细胞以建立具有骨转移病灶的小鼠模型的实验方案。

摘要

前列腺癌（PC）是男性最常见的恶性肿瘤，其死亡率位居第二，主要原因在于骨转移发生率高达65%–75%。因此，深入了解前列腺癌骨转移的过程及相关机制，对于开发新的治疗方法至关重要。为此，建立骨转移的动物模型是一项必不可少的工具。本文报道了通过心内注射前列腺癌细胞构建骨转移小鼠模型的详细操作步骤。通过生物发光成像系统可判断前列腺癌细胞是否准确注入心脏，并可用于监测癌细胞的转移过程，因其在追踪转移病灶发展方面具有显著优势。该模型能够模拟播散性癌细胞在骨内自然发展形成微转移灶的过程，重现前列腺癌骨转移的病理进程，为深入研究该疾病的分子机制及其体内治疗效果提供了有效的研究工具。

引言

前列腺癌是112个国家中男性最常见的癌症，在人类发展指数较高的国家中其致死率位居第二^1,2。前列腺癌患者的大多数死亡由转移引起，其中约65%–75%的病例会发生骨转移^3,4。因此，迫切需要预防和治疗前列腺癌骨转移，以改善前列腺癌患者的临床预后。骨转移动物模型是研究前列腺癌骨转移各阶段复杂过程及其分子机制不可或缺的工具，有助于发现治疗靶点并开发新型治疗方法⁵。

建立前列腺癌骨转移实验动物模型的最常用方法包括原位注射、骨干内注射（如胫骨内注射）以及心内注射前列腺癌细胞。原位注射的骨转移模型是通过将前列腺癌细胞直接注射到小鼠前列腺中而建立的^6,7。该实验动物模型在临床特征上与前列腺癌骨转移非常相似。然而，转移主要发生在腋窝淋巴结和肺部，而非骨骼^8,9。胫骨内注射模型则是将前列腺癌细胞直接注入胫骨，具有较高的骨内（胫骨）肿瘤形成率¹⁰

方案

选取6至8周龄的雄性BALB/c裸鼠（n = 10），每笼5只，饲养于屏障系统内的独立通风鼠笼中，在SPF级动物房内进行实验，环境条件为12小时光照/12小时黑暗循环，自由摄取SPF级饲料和无菌水。实验前所有小鼠均适应性喂养1周。所有动物实验均经上海中医药大学动物福利委员会批准。

1. 细胞准备

1. 在前列腺癌细胞注射当天，用预冷的无菌 PBS（pH 7.4）清洗在 10 cm 细胞培养皿中培养至 80%–90% 汇合度的荧光素酶标记的 PC-3 细胞（PC-3-luciferase），清洗两次。加入 1.5 mL 0.25% 胰蛋白酶消化 3 分钟，随后用含 10% 血清的 F-12 培养基 6 mL 终止消化，将细胞收集至 15 mL 离心管中。
   注：PC-3-luciferase 细胞系是通过将 pLV-luciferase 载体转染至 PC-3 细胞系后获得的¹⁵。
2. 取 20 µL 细胞悬液加入细胞计数板（见材料表），使用自动细胞计数仪测定细胞浓度。
3. 室温（RT）下以 800 × g 离心 5 分钟。
4. 用移液器吸弃上清液，将细胞沉淀重悬于 F-12 培养基（见材料表）中，调整细胞终浓度为 1 × 10^....

结果

生物发光成像在监测心内注射模型的转移病灶发展方面具有显著优势。癌细胞注射后不久（24小时内），即可利用生物发光成像技术观察癌细胞进入全身循环的过程。图 3A）。当癌细胞被正确注入动脉循环时，全身将可见明显的生物发光信号。仅注射部位（心脏）显示生物发光信号的小鼠数据应排除在最终数据收集之外。后肢中观察到了转移性病灶。图 3B-D) 细胞注射后2周。随着时间推移，转移病灶逐渐增大，并出现在其他部位，包括胸骨、肋骨和下颌骨。

X射线图像显示骨质破坏，代表骨转移性病灶。图 4A）。骨破坏亦通过显微CT扫描检测。显微CT扫描采用显微CT（µ与3Dcalc、锥形重建及模型可视化软件应用相关的CT80。通过重建位图数据构建了三维模型。图中展示了胫骨近端骨破坏的代表性显微CT图像。 图 4B

讨论

通过心内注射人前列腺癌细胞以建立骨转移模型，是研究前列腺癌骨转移功能与机制以及评估治疗效果的理想小鼠模型。研究表明，骨损伤最常发生在胫骨近端和股骨远端¹⁷，这可能与其较高的血管化程度和代谢活性有关。

由于骨转移是乳腺癌患者中常见的转移性病变，因此通过心内注射乳腺癌细胞建立的骨转移模型也常用于乳腺癌研究^18,19。因此，本研究工作有助于利用乳腺癌和前列腺癌细胞建立心内注射诱导的骨转移模型。

为确保肿瘤形成的稳定性，需注意以下几个关键点。细胞在从培养物上脱离后应尽快注射。在癌细胞注射后，应将小鼠随机分配至各实验组。注射体积应保持一致，且应由同一人采用相同技术对所有小鼠进行癌细胞注射。

整个操作过程包含多个关键步骤。如果注射位点定位正确，在注射过程中应观察到搏动性血液。持注射器的手失去稳定性，以及在推动注射器活塞时.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1 mL 注射器和针头	山东威高集团医用高分子制品股份有限公司	20200411	将细胞注射至小鼠脑室
麻醉机	深圳瑞沃德生命科技有限公司	R500IP	用于小鼠麻醉的设备
自动细胞计数仪	上海司莫生物技术有限公司	IC1000	用于细胞计数
BALB/c 裸鼠	上海斯莱克实验动物有限责任公司	雄性	6–8 周龄雄性小鼠
生物发光成像系统	上海佰泰科技有限公司	Vieworks	若注射的细胞标记有荧光素酶，可用于追踪肿瘤生长及肺转移情况
离心管（15 mL，50 mL）	上海月年生物科技有限公司	430790, Corning
EDTA 溶液	武汉伊莱瑞特生物科技有限公司	G1105	用于骨组织脱钙
F-12 培养基	上海月年生物科技有限公司	21700075, GIBCO	细胞培养基
福尔马林溶液	上海月年生物科技有限公司	BL539A	用于固定每只小鼠的标本
异氟烷	深圳瑞沃德生命科技有限公司	VETEASY	用于麻醉
Lipofectamine 2000	上海月年生物科技有限公司	11668027, Thermo fisher	质粒转染试剂
PC-3 细胞系	中国科学院细胞库	TCHu 158	前列腺癌细胞系
磷酸盐缓冲液	碧云天生物技术研究所	ST447	用于洗涤人骨肉瘤细胞
胰蛋白酶（0.25%）	上海月年生物科技有限公司	25200056, Gibco	用于细胞消化
载体（pLV-荧光素酶）	上海月年生物科技有限公司	VL3613	用于转染的质粒
X 射线成像系统	布鲁克（北京）科技有限公司	FX PRO	用于获取 X 射线图像以检测肿瘤生长
μCT80	深圳普门科技服务有限公司	Scanco Medical AG, 瑞士	用于检测骨破坏。该微型 CT 配备 3DCalc、锥形束重建以及   和 μCT Ray V3.4A 模型可视化软件。