方法文章

使用统计技术对 大肠 杆菌 Rosetta pLysS 细胞中重组几丁质脱乙酰酶表达的过程评价和动力学

DOI：

10.3791/64590

⸱

2023年3月10日

 ,  , 
1Department of Biotechnology, Manipal Institute of Technology, Manipal Academy of Higher Education (MAHE)

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

在当前的方案中，应用了一种统计技术，即中央复合设计 （CCD），以优化重组细菌几丁质脱乙酰酶 （BaCDA） 在 大肠 杆菌 Rosetta pLysS 细胞中表达的工艺条件。CCD 的使用导致 BaCDA 的表达和活性增加 ~2.39 倍。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

近年来，使用几丁质脱乙酰酶将几丁质脱乙酰为壳聚糖的更环保路线变得越来越重要。具有模拟特性的酶转化壳聚糖具有广泛的应用，特别是在生物医学领域。已经报道了几种来自不同环境来源的重组甲壳素脱乙酰酶，但还没有关于这些重组甲壳素脱乙酰酶生产工艺优化的研究。本研究使用响应面方法的中心复合设计来最大限度地提高大肠杆菌 Rosetta pLysS 中重组细菌几丁质脱乙酰酶 （BaCDA） 的产生。优化的工艺条件为 0.061% 葡萄糖浓度、1% 乳糖浓度、22 °C 的孵育温度、128 rpm 的搅拌速度和 30 小时的发酵。在最佳条件下，发酵 16 小时后开始乳糖诱导引起的表达。诱导后 14 小时记录最大表达、生物量和 BaCDA 活性。在优化条件下，表达的 BaCDA 的 BaCDA 活性增加了 ~2.39 倍。工艺优化使诱导后总发酵周期缩短了 22 小时，表达时间缩短了 10 小时。这是第一项使用中心复合设计及其动力学分析报告重组几丁质脱乙酰酶表达过程优化的研究。适应这些最佳生长条件可能会导致较少开发的莫耐兰脱乙酰酶的成本效益高、大规模生产，从而走上生物医学级壳聚糖生产的绿色路线。

引言

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甲壳素是一种结构β、1-4 糖苷连接的天然聚合物，是自然界中仅次于纤维素的第二丰富的多糖。尽管如此，由于甲壳素的不溶性，其工业应用受到限制1。这一瓶颈是通过使几丁质进行 N-脱乙酰化来解决的，N-脱乙酰化会赋予正电荷并增加所得聚合物壳聚糖1 的溶解度。甲壳素可以通过两种不同的途径修饰为壳聚糖:化学和酶促。壳聚糖的生物医学应用需要受控和明确的脱乙酰化，这在化学途径中受到限制 2,3。可以使用几丁质脱乙酰酶 （CDA） 来解决这一限制，CDA 是一种用于脱乙酰化过程的绿色酶方法 4,5。

几丁质脱乙酰酶属于碳水化合物酯酶 4 （CE-4） 家族，在碳水化合物活性酶 （CAZY） 数据库中定义。CE-4 家族的酶共享 NodB 同源性或多糖脱乙酰酶结构域作为保守区域。中央复合设计 （CCD） 是一种统计工具，用于优化几种野生型几丁质修饰酶 6,7,8,9。然而，使用野生型生物的下游步骤变得乏味，因此转向重组酶10、11、12、13、14、15、16、17。近年来，来自海洋来源的嗜盐重组 CDA 因其易于工业应用和生产生物医学级壳聚糖而变得越来越重要18,19。

在大肠杆菌中生产重组酶对工艺有限制，需要优化培养基，因为它在大肠杆菌中的表达因所使用的基因和质粒而异20。因此，筛选合适的工艺和营养参数变得很重要。一次一个因子 （OFAT） 是常用的优化方法，需要大量的资源和时间来执行分步实验。这种方法缺乏有关参数 20,21,22,23 之间相互作用的统计信息。因此，采用响应面法 （RSM） 的 CCD 研究嗜盐细菌几丁质脱乙酰酶 （BaCDA） 在大肠杆菌 Rosetta pLysS 中的表达产量和 BaCDA 活性。在大肠杆菌宿主中优化表达的参数是乳糖浓度、葡萄糖浓度、孵育温度、搅拌速率和孵育时间。在大多数大肠杆菌表达研究中，使用含有异丙基 β-d-1-硫代吡喃半乳糖苷 （IPTG） 的 Luria Bertani （LB） 培养基作为诱导剂。IPTG 的添加需要定期生长监测24。发酵过程中这些反复出现的中介也为污染开辟了途径。因此，研究小组已转向以乳糖为诱导剂的极好肉汤 （TB）。在媒体中加入乳糖而不是 IPTG 解决了这一问题;大肠杆菌消耗这种乳糖并产生异糖乳糖作为副产品，导致自动诱导条件。这种自诱导剂培养基含有甘油，其重组蛋白25 的产量有所提高。 通过优化工艺参数，重组蛋白在 TB 培养基中的过表达得到了进一步改善。在本研究中，应用中心复合设计来优化嗜盐 BaCDA 在大肠杆菌 Rosetta pLysS 细胞中的异源表达。选择的工艺参数是孵育温度、搅拌速率和孵育时间，评估的营养参数是葡萄糖和乳糖浓度。亲盐性 BaCDA 表达使用预测的优化条件进行评估，并使用 SDS-PAGE 进行交叉验证。

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方案

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1. 表达培养基和培养条件

  1. 如15所述，使用热休克法将含有 BaCDA 基因的 pET-22b 载体转化到大肠杆菌 Rosetta pLysS 感受态细胞中。
    注意:与微生物打交道时必须小心。所有微生物工作都必须在生物安全柜罩内进行，以避免污染。
  2. 在16°C和180rpm下，在含有0.05%（w / v）葡萄糖和0.2%（w / v）乳糖的TB培养基中进行初步表达研究。在 100 mL 含有 BaCDA 克隆质粒的培养基中培养 6.792 x 107 个大肠杆菌 Rosetta pLysS 细胞，直至达到固定相。在上述生长条件下，大肠杆菌 Rosetta pLysS 细胞达到 10.85 ± 0.21 的光密度600 （OD 600）。 
    注:TB 培养基的组成 （% w/v）:胰蛋白胨，1.2;酵母提取物，2.4;甘油，0.6;和 1x TB 盐（17 mM KH2PO4 和 74 mM K2HPO4）17。

2. 优化和实验设计

  1. 使用统计工具软件设计实验并在中心复合材料设计中拟合二阶多项式模型。本研究中使用的统计软件是 MINITAB 17.0（试用版）。
    1. 为此，请打开软件并单击以下按钮: 统计> DoE > 响应面 > 创建响应面 > 响应设计 > 中央合成。输出将显示为对话框。
  2. 在对话框中将孵育温度、搅拌速率、孵育时间、葡萄糖浓度和乳糖浓度这五个参数输入到五个级别（-2、-1、0、+1、+2）。
    1. 为此，请在对话框中输入带有级别的参数，输入所有参数的详细信息，然后按 OK。这将生成在中心点有 6 个重复的试验设计矩阵，需要 32 个试验游程。软件会生成一个表格，其中包含编码和未编码术语的参数及其水平，用于使用 CCD 进行过程优化（表 1）。
  3. 使用软件生成的条件执行 32 次实验。将实验结果输入到实验设计矩阵（由软件生成）中，其中包含编码和未编码单位的水平和参数（表 2）。
  4. 使用软件分析实验设计矩阵（表 2）。为此，请打开软件并将响应输入数据表。选择 Stat > DoE > 响应列 > 响应面 > 分析响应面设计 > 确定。分析输出的统计显著性，并由软件预测模型。

表 1:实验设计中使用的编码和未编码术语的参数及其水平，用于估计大肠杆菌 Rosetta pLysS 细胞中重组几丁质脱乙酰酶的表达。请点击此处下载此表格。

表 2:大肠杆菌 Rosetta pLysS 细胞中重组几丁质脱乙酰酶的实验和预测 BaCDA 活性（表达）的实验设计矩阵。请点击此处下载此表格。

3. 模型验证

  1. 使用软件中提供的响应优化器工具验证设计的模型。
  2. 在软件预测的最佳条件下重复发酵，并将实验值与软件预测值进行比较。
    1. 为此，请打开软件并选择 Stat > DoE >> Response surface（统计 DoE）响应表面>响应优化器>最大化>确定。输出是软件预测的最佳工艺条件和值。在预测的最佳条件下重复发酵并比较值。

4. 分析方法

  1. 表达、生物量和蛋白质定量
    1. 在实验设计矩阵中软件给出的 32 种条件下进行发酵（表 2）。每次运行后，通过在 4 °C 下以 5,405 x g 离心培养物 10 分钟来获得沉淀。 称量细胞沉淀以确定生物量产量。
      注意:所有微生物处理都应在无菌条件下进行（即在生物安全柜内）。
    2. 裂解细胞沉淀物，通过超声处理获得周质蛋白。向每克细胞沉淀中加入 5 mL 裂解缓冲液（50 mM Tris-HCl、300 mM NaCl、10 mM 咪唑），并以 60% 的振幅超声处理 10 个循环，脉冲为 10 秒，关闭 10 秒。通过在 4 °C 下以 5,405 x g 离心 10 分钟来收集裂解物。 通过 Bradford 测定法26 定量蛋白质浓度。
      注:为避免蛋白质变性，超声处理必须在低温条件下进行。在进行超声处理时将样品放在冰上。
    3. 使用 SDS-PAGE 然后用 ImageJ 软件分析 BaCDA 表达。在 12% 双丙烯酰胺凝胶上加载 10 μL 可溶性细胞裂解物（周质蛋白），并在 1x tris-甘氨酸-SDS （TGS） 缓冲液下以 100 V 电流运行 2 小时。运行完成后，用考马斯蓝对凝胶进行染色并脱色以去除背景27。
    4. 使用凝胶成像装置采集图像。通过使用 ImageJ 软件以像素值的形式比较条带强度来确定 BaCDA 表达式。考虑具有最低 BaCDA 活性和生物量的实验运行作为参考像素 28。
      1. 为此，请打开软件并打开图像文件，然后使用矩形框选择每个泳道。转到 Analyze 并将每个通道设置为 100%，然后使用矩形框选择每个通道中的过表达条带。转到 Analyze 并确定条带的强度，在每个泳道中重复该过程，然后将结果导出为 .xls 文件。将具有最低 BaCDA 活性的实验运行的条带强度作为参考强度，并分析每个泳道的表达。
  2. 酶活性测定
    1. 使用乙酸盐测定试剂盒15 测定 BaCDA 活性，使用乙二醇甲壳素 （1 mg/mL;EGC） 作为底物29.
    2. 在 40 μL 50 mM Tris-HCl （pH 7） 缓冲液存在下，让 20 μL BaCDA 与 40 μL 底物在 30 °C 下以 800 rpm 搅拌反应 1 小时。
    3. 1 小时后，在 4 °C 下通过 3 kDa 色谱柱以 2,111 x g 离心 100 μL 反应物 15 分钟。 弃去含有 BaCDA 的截留物，并收集反应过程中释放的含有乙酸盐的滤液。使用用于乙酸盐测定的滤液测定 BaCDA 活性。
      注:一个单位的酶定义为每分钟每微升酶从底物中释放 1 μM 乙酸盐的活性。酶活性测定一式三份进行，并相应地计算相应的酶活性。
  3. 乳糖诱导的发酵动力学
    1. 调查活性曲线以确定乳糖诱导点和表达起点。活性分析是通过在优化的发酵条件下估计生物量和 BaCDA 活性来进行的。
    2. 使用葡萄糖估计试剂盒测定培养基中的葡萄糖浓度。使用生物量、葡萄糖浓度和 BaCDA 活性与发酵时间绘制活性曲线。

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结果

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使用中心复合设计 （CCD） 优化 大肠杆菌 中周质重组酶几丁质脱乙酰酶表达的过程
在未优化的条件下生长时，pET22b-Ba CDA 构建体的最大生物量产量和 BaCDA 活性分别为 22.26 ± 0.98 g/L 和 84.67 ± 0.56 U/L15。在本研究中，采用统计方法 CCD 来寻找在大肠杆菌 Rosetta pLysS 细胞中表达周质重组酶几丁质脱乙酰酶的最佳工艺条件。孵育温度 （A）、搅拌速率 （B）、孵育时间 （C）、葡萄糖浓度 （D） 和乳糖浓度 （E） 这五个工艺参数是根据我们的初步工作选择的（表 1）。定量周质重组酶几丁质脱乙酰酶的表达，并表示为重组几丁质脱乙酰酶的 BaCDA 活性 （U/L）（表 2）。因此，参数 A、B、C、D 和 E 作为外源参数，而周质重组甲壳素脱乙酰酶表达的 BaCDA 活性被选为内源参数 （响应）。实验设计矩阵描述，最...

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讨论

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脱乙酰甲壳素，壳聚糖，有许多应用，特别是在生物医学领域30.然而，壳聚糖的乙酰化程度 （DA） 和乙酰化模式 （PA） 的可重复性是除其他环境担忧外的主要问题。因此，使用酶的更环保路线已被开发。CDA 阵列可用于制造具有独特脱乙酰化模式的壳聚糖，这将增加其生物医学应用 4,5。在我们之前的工作中，克隆的 BaCDA 基因在大肠杆菌 Rosetta pLysS 细胞中表达15。

初步筛选时，BaCDA 在 37 °C 下表达为包涵体。根据文献调查，使用较低的表达温度 （即 16 °C） 在 TB 自诱导培养基中获得可溶性 BaCDA31。然而，在 16 °C 下发酵 52 小时后，获得 84.67 ± 0.56 U/L 的最大活性。 表达温度的降低导致发酵...

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披露

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作者没有什么可披露的。

致谢

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作者要感谢马尼帕尔高等教育学院（MAHE）为新南威尔士大学提供的MAHE基金，作者要感谢科学与工业研究委员会 - 人力资源发展小组（CSIR-MHRD），印度政府提供的高级研究奖学金，授予信函编号为09/1165（0007）2K19 EMR-I，日期为2019年3月31日。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Kits
Acetate 检测试剂盒Megazyme，爱尔兰K-ACETAK该方案已略微修改和优化，可在 96 孔板中进行检测
葡萄糖估计试剂盒Agappe diagnosis Ltd.，印度12018013该方案已略微修改和优化，可在 96 孔板
中进行检测Chemicals
Acetic acidHi-media， 印度AS001用于制备SDS-PAGE染色和脱析溶液
烯酰胺Hi-media， 印度MB068用于制备SDS-PAGE凝胶
铵Hi-media， 印度MB003用于制备SDS-PAGE凝胶
Bis-acrylamideHi-media，印度MB005用于制备 SDS-PAGE 凝胶
考马斯布里安特蓝 G-250Hi-media，印度MB092用于制备 SDS-PAGE 染色和脱模溶液
考马斯布里安特蓝 R-250Hi-media，印度MB153用于制备巴德福德测定
乙二醇壳聚糖Sigma-aldrich，美国E1502用于制备乙二醇甲壳素和乙二醇甲壳素用作酶促反应的底
D-葡萄糖高培养基，印度MB037用作培养基成分。
咪唑Hi-media， 印度GRM1864用于裂解缓冲液
乳糖Hi-media， 印度GRM017用作培养基成分。
甲醇Finar，印度30930LC250用于制备 SDS-PAGE 染色和脱墨溶液
氯化钠 （NaCl）Hi-media，印度MB023用于裂解缓冲液
磷酸Hi-media，印度MB157用于制备巴德福德测定
烷基硫酸钠 （SDS）Hi-media，印度GRM6218制备 SDS-PAGE 凝胶
磷酸氢二钠 无水高培养基，印度MB024用于制备培养基用 TB 盐和酶促反应缓冲液。
磷酸二氢钠无水高培养基，印度GRM3964用于制备用于培养基的结核病盐和酶促反应的缓冲液。
四甲基乙二胺 （TEMED）Hi-media，印度MB026用于制备 SDS-PAGE 凝胶
Tris 碱Hi-media，印度MB029用于制备 SDS-PAGE 凝胶
胰蛋白胨Hi-media，印度RM7707用作培养基成分。
酵母提取物Hi-media， 印度RM027用作培养基成分。
设备
AlphaImager HP 凝胶成像装置ProteinSimple， USA92-13823-00用于捕获 SDS-PAGE 照片
台式混合器Eppendorf， Germany 9.776 660用于与 2 mL 适配器进行酶促反应
生物培养箱摇床Trishul 仪器，印度13410622用于在不同温度和 RPM 下孵育细菌培养
生物分光光度计Eppendorf，德国 6135000009用于获取所有光谱读数
冷却离心机Eppendorf，德国 5805000017用于离心培养物、裂解物和所有其他离心方案
美国国际实验室S81522039用于 SDS-PAGE 微量移液器的蛋白质样品变性
德国 Eppendorf 3123000900用于体积测量的方案
摇床Trishul 仪器，印度11770719用于摇动 SDS-PAGE 凝胶，用于染色和脱色
SDS-PAGE 装置Bio-Rad，美国1658001FC用于灌注和运行 SDS-PAGE 凝胶
超声仪Sonics 和Materials， Inc.， USAVCX 130用于通过超声裂解细菌细胞
天平Sartorius，德国BSA124 S测量整个方案中的重量
设备
Nanosep 离心设备，带 Omega 膜 （3 kDa）PALL Life Sciences，美国OD003C33用于分离底物后的酶treatment
Softwares版本在
 （试用版） 宾夕法尼亚州立大学用于设计实验模型和分析数据
ImageJ1.53o美国国立卫生研究院 （NIH）用于使用 SDS-PAGE 分析表达水平 image
Plasmid
pET22b （+） DNA—NovagenMerck- Millipore， USA69744储存在 − 20 °C
Cells
大肠杆菌罗塞塔 pLysS—NovagenMerck- Millipore， USA70956在 Luria&ndash 维护;Bertani （LB） 肉汤含 25% 甘油;80 °丙
丙硫酸物 十二用于物 内 称重 用于 MINITAB 17.0 上开发

参考文献

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