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方法文章

一种用于测量辐射度的组织内辐射测量微探针 原位 在活体组织中

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DOI：

10.3791/64595

⸱

2023年6月2日

 ,  , 
1Department of Physics, Yale University, 2Lund Vision Group, Department of Biology, Lund University, 3Department of Physics and Astronomy, University of Pennsylvania, 4Department of Biology, Duke University

本文内容

摘要

本文介绍了一种测量辐射亮度的方法 原位 描述了在活体组织中进行的测量。本工作包括用于辐射度和辐照度不同测量的微尺度探针的构建细节，提供了用于辐射度表征的组织安装指南，并概述了分析所得数据的计算方法。

摘要

生物体通常呈现不透明状态，主要是因为其外层组织对入射光具有强烈的散射作用；而强吸收性色素（如血液）的吸收谱带通常较窄，导致在吸收峰以外波长的光在组织中的平均自由程可能相当长。由于人类无法透过组织直接观察其内部，通常会认为像脑、脂肪和骨骼等组织内部几乎没有或完全不含光线。然而，许多这类组织内部实际上表达了光响应性视蛋白，其功能目前尚不清楚。组织内部的辐亮度对于理解光合作用也至关重要。例如，巨蛤虽具有强吸收性，却能在组织深层维持高密度的共生藻类。光在沉积物和生物膜等系统中的传播过程可能十分复杂，而这些群落往往是生态系统生产力的重要贡献者。因此，已开发出一种构建光学微探针的方法，用于测量组织内部的标量辐照度（穿过某一点的光子通量）和下行辐照度（垂直穿过某一平面的光子通量），以更深入地理解这些现象。该技术同样适用于野外实验室条件。这些微探针由经加热拉制的光纤制成，随后固定于拉制的玻璃毛细管中。为调节探针的角度接收范围，将一粒直径10–100 µm、由二氧化钛混合紫外固化环氧树脂制成的微球固定在拉制并裁剪后的光纤末端。探针可插入活体组织中，并通过显微操作仪精确控制其位置。这些探针能够测量 原位 在10–100 µm的空间分辨率或单细胞尺度上，对组织内的光辐射进行表征。这些探针被用于表征到达活体小鼠皮肤下方4 mm处脂肪细胞和脑细胞的光，以及到达富含藻类的活体巨蛤组织类似深度区域的光。

引言

令人惊讶的是，陆地动物和浅海生物体内存在足够的光线，足以支持视觉生理功能，甚至进行光合作用。例如，小鼠头部中心区域的光强（在血红蛋白强吸收带之外）相对于外界环境衰减了三到四个数量级，这大致相当于室内与室外光照强度之间的差异。因此，由于强烈散射导致的组织或材料不透明性，不同于因强光吸收引起的不透明性。在强前向散射系统中，光可以长距离持续传播，类似于光在含有高浓度细胞和颗粒的水体系统中的传播方式1。 这一现象尤其值得关注，因为视蛋白在所有动物的所有组织中几乎普遍存在。因此，理解光在活体组织中如何以及在何处被衰减和散射显得尤为重要。然而，与水生系统不同，在活体组织中无法将仪器浸入介质中直接测量辐射度和辐照度，因而需要一种新的技术手段。

以往用于表征活体组织吸收和散射特性的其他方法包括测量组织反射率的探针和/或积分球2,3、扫描共聚焦显微镜等显微技术4、测量激光在组织表面的扩散情况5，以及蒙特卡罗辐射传输等建模技术6。上述实验方法通常需要特定、庞大且昂贵的设备，或对组织结构有详细的了解，且在表征组织深层光的空间分布特性方面普遍受限。

也有类似的基于探针的方法，使用皮下注射针头将光纤穿过组织7,8,9。根据我们的经验，经过改造的针头在穿刺组织方面效果良好，但需要施加较大的力，且在穿过细胞密集区域时通常会撕裂脆弱的组织。因此，这些针头通常需要通过外科手术才能将其插入组织层超过约一毫米。本文所述的方法采用润滑的拉制玻璃支撑体，能够以最小的组织损伤滑入细胞间隙，且无需额外的外科手术。

本文介绍了一种受Jorgenson及其同事研究启发的、用于测量藻垫内部光照的方法10,11，使用玻璃支撑的光学微探针和便携式电子设备，可深入致密组织内部进行探测，并适用于野外构建与使用。这些探针可被设计用于高空间分辨率地表征活体组织内的标量辐照度（来自各个方向照射到某一点的光）和下行辐射亮度（穿过水平面的光）。这些探针最初是为测量光共生巨蛤组织内的辐射传递而开发的12总组织的吸收和透射标准测量不足以表征该组织的光合性能，因为入射光是被组织表面少数细胞在高光强下吸收，还是被整个组织体积内大量细胞在低光强下吸收，二者之间存在显著差异。在第二个项目中，这些探针被用于测量 体内 小鼠脑内的辐照度13,14从而表征表达于大脑深部视蛋白所处的光环境。这些微型探针体积微小且灵敏度高，足以在小鼠毛发、皮肤和颅骨完整保留的条件下，测量其脑组织内的辐照度，并证实生理水平的光照强度足以有效激活大脑深部的视蛋白。

这种微型光学探针和测量装置可能对需要量化和表征生物组织内部光特性的研究人员具有重要价值，尤其有助于更深入地理解光合作用，或眼睛以外部位表达的视觉色素的功能。该方法可单独使用，也可与其他技术结合使用，以低成本、利用自制的小型便携设备，并通过任务相关的可调参数，全面表征活体组织内的光学特性及光传播行为。

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方案

本研究符合耶鲁大学关于脊椎动物和无脊椎动物研究的所有相关伦理规定。

1. 构建光学微探针

  1. 制作玻璃套管，材料：巴斯德吸管，5.75 英寸（见 材料表)
    1. 使用可安装的鳄鱼夹（材料表将玻璃移液管的大端固定，使锥端朝下指向地面，并确保移液管的方向垂直于地面。
    2. 悬挂一个50 g的塑料虎钳夹（材料清单从移液管的锥形末端吸取。在移液管与扳手之间放置一块电工胶带，以帮助防止打滑。
    3. 使用小型丁烷喷灯加热移液管的锥形末端（材料表）。将火焰置于虎口上方1厘米处。手持喷灯，使火焰最明亮的部分距玻璃管3厘米，并使玻璃管位于火焰尖端。当移液管长度增加约5英寸时，立即移开火焰。
    4. 使用小剪刀或玻璃刀，在移液管拉制末端的直径约为下一节所用光纤直径两倍处（见步骤1.2）将其末端剪断。用碳化硅砂纸打磨剪切后末端的锋利部位。材料表）。使用异丙醇喷瓶冲洗掉产生的微小玻璃碎片或粉尘，随后用压缩空气吹干。
  2. 拉制光纤（图1D)
    1. 使用剃刀刀片切断光纤，取下一根直径为200 µm、带SMA接头的SMA端接光纤的一个SMA连接器（材料表）。靠近其中一端SMA接头处切断。然后使用剃刀刀片去除接下来5 cm的塑料和玻璃纤维护套，使裸露的光纤暴露并从其余完好的组件中伸出。
    2. 使用丁烷喷灯烧除玻璃纤维上的聚酰亚胺聚合物涂层。用异丙醇冲洗。使用无尘布擦拭裸露的玻璃纤维以使其清洁。
    3. 下一步是将裸露的光纤安装好，以便也能用火焰拉制。将光纤的裸露端直接安装在钳形夹具中（材料表将光纤的 SMA 端置于桌面或架子边缘，使光纤裸露端自然下垂朝向地面。在距离钳形夹持裸光纤处约 12 英寸的光纤护套端，挂上两个小夹子（总重量：10 g）作为牵引负载。
    4. 开始拉制光纤时，先打开丁烷喷灯火焰。保持火焰燃烧，将丁烷喷灯置于距裸光纤1 cm处，使火焰方向垂直于光纤，并在钳子夹持裸光纤位置下方垂直距离3 cm处加热。使光纤受热后逐渐拉伸、延展、断裂，并自然坠落至地面。
    5. 检查拉制完成的光纤末端。使用碳化硅砂纸轻轻打磨去除任何不平整处，用异丙醇和无尘布清洁，并用压缩空气吹干。
      注意： 此时，可使用显微镜对拉制出的光纤进行表征，并记录其尺寸和形状。
    6. 使用不透光记号笔涂黑光纤的两侧，以防止杂散光进入（材料表）。轻轻将光纤拉过笔尖，仅使笔尖末端露出一小部分。
  3. 将拉制好的光纤安装到玻璃移液管套管内（图1A)
    1. 在体视显微镜下操作，将1.2步骤中制备的锥形光纤小心插入1.1步骤中处理过的玻璃移液管的宽端，推动光纤使其穿过移液管，直至约1 mm的裸露光纤从移液管的锥形末端伸出。
    2. 使用电工胶带将光纤的护套端固定在移液管的宽端。
    3. 将一滴氰基丙烯酸酯粘合剂滴在细针头上材料表）。小心地将粘合剂液滴滴至拉制毛细管的切割边缘，避免接触拉制光纤的裸露末端。
    4. 利用毛细作用使胶粘剂沿移液管上升，润湿移液管壁与光纤之间的区域。在移动探头组件前，让胶粘剂至少固化15分钟。
  4. 使用散射球修饰光纤尖端（图1C)
    1. 通过将一滴紫外光固化胶与二氧化钛粉末混合，制备散射球头的原料材料表) 按照约 1:1 的体积比 (v/v)。
    2. 将探针固定在带有安装杆夹持器的显微操作仪上（材料表）使探针处于水平方向。通过将金属丝或针的尖端浸入粘合剂/TiO₂散射材料中，制备工作用的散射材料储液。2 将上述制备的混合物取适量，使形成一滴粘合剂。将带有液滴的金属丝或针固定在水平探针尖端附近。使用安装在实验台上的鳄鱼夹进行此操作较为方便。
    3. 在探针尖端沉积一个散射球。使用显微操作器缓慢而小心地将探针的光纤尖端推入粘合剂/TiO₂液滴中2然后迅速将光纤尖端从胶水中抽出。重复两到三次，直至在光纤尖端形成所需大小的球形胶滴。
      注意：散射球的直径在为锥形光纤直径的两到八倍时将保持稳定。最终的最佳尺寸取决于具体的应用需求。
    4. 将光纤的SMA端连接至光纤耦合的紫外光源，对球体进行固化材料表).
      ​注意：本研究中使用光源的功率为 5.3 mW。在此功率下，建议固化时间至少为 12 小时或过夜。 固化后是表征和测量最终光学探针尖端尺寸的理想时机。 

2. 光学测量用组织的制备与安装（图2 和 图3）

  1. 为实验准备用于固定样品的培养皿。使用丁烷喷灯加热巴斯德移液管的粗端，制成冲头，用于在35 mm × 10 mm塑料培养皿底部熔出直径0.5 cm的孔。用绝缘胶带或实验室胶带将培养皿底部的孔密封。为提高效率，可一次性制备多个。
  2. 按照包装说明制备液态明胶（材料表）。
    注意：与化学供应商提供的化学级明胶相比，市售食品级无味明胶更适合本实验用途，因为化学级明胶的光学透明度较低，机械性能也不如食品级产品稳定。
  3. 进行组织的解剖与制备，以供使用。
    注意：根据经验，任何厚度不超过1 cm的扁平组织均可通过适用于目标系统的适当解剖技术成功用于本实验。对于大砗磲组织，使用8 mm活检打孔器制备出平整、规则的圆形组织样本用于实验12。对于该系统，由于每次测量所需时间较长，为确保实验结束时样本仍处于类生命状态，每次只能有效制备一个样本。
  4. 取两个2.1步骤中的培养皿，各加入约四分之一体积的液态明胶，静置于室温（RT）直至接近凝固但尚未完全凝胶化。在其中一个培养皿中，将活检组织置于培养皿底部孔洞内形成的黏性明胶垫中，用巴斯德移液管轻轻加入室温明胶，直至填满整个培养皿（图3）。另一个培养皿则完全填充明胶，作为空白样本。
  5. 将样本培养皿放入冰箱中约10–30分钟，直至明胶完全固化且触感略具弹性。
    注意：在低温环境中，此步骤可能非必需；但在热带地区操作时，必须进行冷藏以确保明胶完全固化。
  6. 在显微操作仪上制作培养皿的固定装置（图2）
    1. 裁剪一块6 cm × 6 cm、厚度为1/4英寸的有机玻璃板（材料表）。
    2. 在塑料方块中央钻孔或熔出一个与培养皿直径相同的孔（约35 mm），确保培养皿能紧密嵌入并靠摩擦力固定。可在培养皿边缘贴胶带以略微增大尺寸和摩擦接触面积。
    3. 在塑料方块的一角钻孔或熔出一个直径为1/4英寸的孔，用于通过1/4英寸螺钉和螺母将方块固定在显微操作仪上。
    4. 用黑色绝缘胶带覆盖整个塑料方块，以减少到达探头的杂散光。同样，用胶带在方块侧面制作裙边，使其延伸至插入的培养皿底部以下（>10 mm），以进一步减少杂散光（图2B）。
    5. 使用螺栓及配套硬件将培养皿固定装置连接至显微操作仪，该操作仪需具备三维调节功能，并能在大于样本厚度的范围内实现精细的垂直移动（材料表中提及的操作仪部件1和部件2为合适示例）。将该显微操作仪固定于光学面包板上。

3. 组织活检的测量装置设置

  1. 将光源安装在测量区域上方，使光线到达样品放置平面时呈准直状态（图2A）。例如，将一个5 cm准直透镜（材料表）连接至一根5 mm液体光导（材料表），并通过固定在光学面包板（材料表）上的夹具和支架将其抬高至样品上方>0.6 m处。然后，将光导连接至宽带光源，例如材料表中列出的等离子体光源。
  2. 将探头固定在垂直取向的支架上，使其朝向光源。使用夹具、管夹或胶带将探头牢固地固定在光学平台立柱上。
    注意：在大砗磲实验中，使用了专门设计的杆状支架，例如材料表中列出的显微操作器。本研究中，该装置通过磁铁固定在光学面包板（材料表）上。探头和样品均使用操作器可提供额外的对准自由度，虽便于操作但非必需。夹紧立柱时需格外小心，避免过度夹紧导致移液管外壳破裂。
  3. 将样品操作器置于垂直安装的探头附近。使用样品操作器调节样品台位置，使探头位于培养皿底部0.5 cm开口的中心。操作时需格外谨慎，避免触碰或碰撞已安装探头的尖端。
    注意：可在样品区域上方安装臂式立体显微镜，有助于实验前观察探头尖端、样品台与样品的俯视对准情况（图2A）。
  4. 将探头光纤的SMA端连接至USB光纤光谱仪（材料表），并使用USB线缆将光谱仪连接至计算机。

4. 数据采集

  1. 实验装置
    1. 将探针和操纵器置于与步骤3.4中相同的数据采集对准位置。
    2. 使用棉签或细针头小心涂抹少量硅基润滑剂（材料表在探针将插入组织的部分涂抹硅基润滑剂，以降低探针侧面与组织样本之间的摩擦力。每次进行基线或组织测量前，均需重新涂抹硅基润滑剂。
    3. 移除空白样品培养皿上覆盖孔洞的胶带，并将其放入样品 holder（步骤 2.7），确保通过摩擦力牢固固定。
    4. 使用显微操作器将样品缓慢下放至探针上，使探针进入明胶中 通过 培养皿底部的孔洞。继续推进，直至探针距离明胶层底部约5 mm处。
    5. 打开光源。使用光谱仪软件调节光谱仪的积分时间，使信号尽可能强但不饱和。将平均扫描次数设置为2到5次，平滑像素值设置为6。在此基线条件下，可用的积分时间范围通常为1-50 ms。
  2. 采集参考光谱
    1. 采集暗场测量数据。
      1. 光谱仪参数用空白样品设定完毕后，将探头光纤从光谱仪上取下，并用光谱仪附带的不透明金属盖盖住端口。
      2. 从光谱仪获取暗测量值（通常在图形用户界面中使用暗光灯泡图标），以表征无入射光时光谱仪的噪声水平。根据数据采集策略保存该测量结果。
    2. 采集光源测量数据。将探针光纤重新连接至光谱仪，等待信号稳定后，采集另一组光谱。该测量用于表征在无组织存在的情况下，经明胶传递至探针的光。
  3. 采集组织光谱
    1. 移除样品培养皿底部的胶带，并将其放入样品架中。
    2. 使用三维操控将样本皿与探针对齐，使组织活检样本位于探针尖端正上方中心位置。
    3. 将硅胶涂抹于探针上（参见4.1.2），缓慢将样品下放至探针，直至探针尖端穿过支撑组织样品的明胶并刚好进入组织样品。
      注意：某些光谱仪和计算机程序支持对检测到的光进行实时监测。可利用此功能判断探头进入组织的时机。当探头尖端与组织直接接触时，光谱强度会突然下降。
    4. 通过确保所测光谱既不过于嘈杂也不饱和，来验证积分时间是否适合测量。如有必要，调整积分时间。
      1. 每次调整积分时间后，均需执行并保存新的暗电流测量（步骤4.2.1）。不得更改平均扫描次数或平滑像素数量。
      2. 在确定合适的测量参数后，进行测量并保存光谱。
    5. 使用显微操作器将样品向下移动指定距离。本研究使用的操作器上，每个小刻度为 0.001 英寸或 25.4 µm。每次测量时，样品向下移动五个刻度，即 127 µm。重复步骤 4.3.4。
    6. 继续在组织的每个垂直位置保存光谱。
      注意：对于此处描述的系统，在单个组织样本内的测量中，所需的积分时间在1 ms到5 s之间变化。最终，探针尖端将从组织顶部穿出并可见于该位置图4A）。这是最终测量，用于表征入射到组织表面的光。
  4. 数据的加载与处理
    1. 使用光谱仪的软件将所有采集的光谱（暗光谱、光源光谱和组织测量光谱）转换为分隔符分隔的文本文件。
    2. 使用 Matlab 或其他选定的编程语言，加载样本的所有测量文件。对于每个组织测量光谱，减去具有相同积分时间的暗光谱，然后除以该积分时间。
      注意：本研究中使用了 Matlab 脚本进行数据的加载与处理（补充文件 1).
    3. 通过将探头置于组织内测得的光谱除以在空明胶中测得的基线光谱，计算入射光到达组织中每个位置的百分比。
      注意：组织顶部的测量值（步骤 4.3.6）应与明胶中的基线测量值（步骤 4.1）非常接近，两者相除后结果应接近 100%。根据实验条件，可任选空明胶的光谱或组织最顶端的光谱作为参考光谱。然而，在实验开始前仍必须采集一次光源光谱。这是因为，如果探头损坏或在到达组织顶部前实验意外失败，则此前获得的数据仍可使用；但若无对应的初始光源参考光谱，则这些数据将无法使用。
    4. 可视化数据；等高线图可能有助于分析图4B).

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结果

本方案描述了构建一种微光学探针的步骤，该探针可用于测量下行辐照度（从单一方向到达某一点的光）；若加装一个光散射球形探头，则可用于测量标量辐照度（从所有方向到达某一点的光）。这些探针能够在接近活体组织内单个细胞尺度的空间分辨率下测量辐照度。本方案还介绍了一种代表性组织样本制备方法，用于配合上述探针进行辐照度测量，以及一种典型的数据观察与分析方法。

图1展示了微探针制备的产物。拉制后的光纤应在约3 cm长度上形成锥形，锥面应无划痕，末端应平整，直径为15–30 µm（图1D）。可通过碳化硅砂纸打磨末端，或再次刻痕并折断，以改善尖端的平整度。同样，用作光纤外壳的拉制玻璃移液管也不应有锋利或破损的边缘。当在光纤平整的截断末端形成散射球时，其形状应为球形（图1C）。在固化前，若散射球形状不规则，可将其再次插入母体胶滴中并迅速将光纤抽出，以去除不规则部分。快速移动可将胶球从光纤末端拉出，而较慢的移动则会导致胶体在光纤...

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讨论

本方案描述了一种以接近单细胞尺度的空间分辨率，系统性表征大体积活体组织内光学环境的技术。这种低成本、灵活性高且适合野外使用的实验方法，可为任何研究光在生物系统内传播特性的科研人员提供帮助。根据经验，与现有方法7相比，这些探针在制备过程中需要更多的练习和操作技巧，但能够减少对组织的损伤，并更全面地表征更大体积的致密组织。

该方法包含四个部分。第一部分是构建探针，其设计灵感来源于先前的装置设计10,11。当前的方法旨在对厚组织进行系统性、低损伤的全面扫描，因为拉制的玻璃针可轻柔地在细胞间滑动。该方法也适用于野外实验室环境12,13,14。本方案可制备出尖端直径约为 20 µm 的探针，用于测量下行辐亮度，以及可选的直径为 50–100 µ...

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致谢

作者感谢Sanaz Vahidinia向我们引荐了Jorgensen博士的同事及其工作。本研究得到了美国陆军研究办公室（编号：W911NF-10-0139）、美国海军研究办公室（通过MURI奖项编号：N00014-09-1-1053）以及NSF-INSPIRE奖项NSF-1343158的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1" 径向球轴承中心+D11+A2:D31+A2:A2:D31Edmond Optics37-935用于降低样品的操纵器部件2
1/4" 厚丙烯酸板McMaster-Carr8505K754用于制作培养皿支架
3/4" 迷你弹簧夹Anvil99693用作拉制光纤时的配重
8 mm 活检打孔器Fisher ScientificNC9324386用于组织样本
丁烷喷灯McMaster-CarrMT-51拉制光纤和移液管时的热源
准直透镜ThorlabsLLG5A1-A通过液体光导准直光源
压缩空气McMaster-Carr7437K35用于干燥拉制后的光纤和移液管
氰基丙烯酸酯胶水 - 液态McMaster-Carr66635A31用于固定拉制移液管顶部的锥形光纤端部
电工胶带McMaster-Carr76455A21用于在移液管中固定光纤，并增加夹具的握持力
细粒碳化硅砂纸McMaster-Carr4649A24在精确刀片支架上裁成小三角形效果良好
明胶Knox10043000048679用于在培养皿中固定组织活检样本
玻璃巴斯德移液管Fisher Scientific13-678-20B一次性玻璃移液管，长度为5.75"
胰岛素注射器，31G针头BD320440用于施加胶水
异丙醇McMaster-Carr54845T42用于清洁拉制后的光纤和移液管
Kimwipe擦拭纸Cole-ParmerSKU 33670-04用于擦拭清洁光纤和玻璃移液管
LED驱动器ThorlabsLEDD1B用于为紫外LED供电
测量用光源Cole-ParmerUX-78905-05低热量白色光源，用于测量
线性公制X-Y-Z轴齿条齿轮平台Edmond Optics55-023用于降低样品的操纵器部件1
液体光导ThorlabsLLG5-4T用于测量中的光源传输
磁性底座SiskiyouMGB 8-32与磁条配合使用
磁条SiskiyouMS-6.0用于将设备磁性固定在光学面包板上
操纵器 #1SiskiyouMX10R四轴操纵器，带移液管支架
遮光笔，小型WindowTintTOP01用于遮蔽光纤侧面，防止杂散光进入探头
光学面包板Edmond Optics03-640用于稳定固定探头支架、样品、显微镜和光源
光纤Ocean OpticsP-100-2-UV-VIS建议准备约4根光纤
等离子体光源ThorlabsHPLS345用于组织辐射测量
塑料钳形夹McMaster-Carr5070A11用作拉制移液管时的配重
聚苯乙烯培养皿Thomas scientific3488N10样品容器，容量需足以容纳样本厚度及上方约10 mm的明胶层
剃须刀片McMaster-Carr3962A3用于剥离光纤护套
硅油润滑剂Thomas scientific1232E30用于减少探头与组织之间的摩擦
数据分析软件Matlab选用的数据分析软件
光谱仪 + 光谱仪软件AvantesAvaSpec-2048L光谱仪可为任意品牌，该型号兼容SMA端接光纤，并附带独立运行光谱仪的软件
二氧化钛粉末Sigma Aldrich718467-100G用于制作散射球
Toolour台式夹具ToolourToolour0004用于拉制过程中固定移液管，以及存放成品探头
扳机式杠杆夹mcMaster-Carr51755A2适用于拉制或固化过程中固定光纤
紫外固化胶粘剂Delo PhotobondGB368用于制作散射球
紫外光源ThorlabsM365FP1用于固化散射球中的胶粘剂，该光源兼容SMA光纤，强度越高，固化时间越短
白色LED光源ThorlabsMCWHF2用于表征拉制光纤和散射球

参考文献

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