流动蚯蚓法在 秀丽隐 杆线虫肠道微生物组定量分析中的应用

Summary

秀丽隐杆线虫 是一种强大的模型，用于研究驱动宿主-微生物组相互作用的分子决定因素。我们提出了一个高通量管道，分析肠道微生物组定植的单一动物水平以及 秀丽隐杆 线虫生理学的关键方面。

Abstract

肠道微生物组的组成会对动物的整个发育和生命过程中的宿主生理机能产生巨大影响。测量微生物组的组成变化对于确定这些生理变化之间的功能关系至关重要。 秀丽隐杆线虫 已成为一种强大的宿主系统，用于研究宿主-微生物组相互作用的分子驱动因素。凭借其透明的身体计划和荧光标记的天然微生物，可以使用大型颗粒分选机轻松量化单个 秀丽隐杆线虫 动物肠道微生物组内微生物的相对水平。在这里，我们描述了微生物组的实验设置、所需生命阶段线 虫 种群的收集和分析、分选机的操作和维护以及所得数据集的统计分析的程序。我们还讨论了基于目标微生物优化分选机设置的注意事项，为 秀丽隐杆 线虫生命阶段开发有效的门控策略，以及如何利用分选机功能根据肠道微生物组组成丰富动物种群。潜在应用的示例将作为协议的一部分进行介绍，包括扩展到高通量应用的潜力。

Introduction

动物的进化受到微生物的持续影响¹.从环境中的各种微生物中，动物宿主获得了特定的伙伴² ，这些伙伴扩展了宿主的能力并驱动其生理学和对疾病的易感性³。例如，肠道微生物组的宏基因组分析揭示了富含代谢类别的微生物基因，这些基因可能在肥胖小鼠中赋予更大的能量收集和储存^{4，其中许多}也存在于人类肠道微生物组⁵中。尽管微生物组的复杂性和宿主系统对大规模筛选的可处理性阻碍了进展，但仍然非常需要建立因果关系并确定微生物组影响的分子决定因素。

模式生物秀丽隐杆线虫提供了一个平台，以促进对微生物组和宿主生理学之间联系的分子理解。秀丽隐杆线虫拥有 20 个具有粘膜层和绒毛结构的肠细胞。这些细胞配备了丰富的化学感受器基因，这些基因可以感知微生物产物并产生可能调节其肠道定植者的抗菌分子^6,7。秀丽隐杆线虫的这种保守生物学导致了大量调节肠道微生物的宿主信号传导的发现，包括胰岛素信号传导、TGF-β 和 MAP 激酶 ^8,9,10。

秀丽隐杆线虫在发育过程中利用微生物作为其生长的饮食，并利用成虫的微生物组。随着年龄的增长，一些微生物可能会在肠腔中过度积累，宿主与微生物的关系从共生转变为发病机制¹¹。在它们的自然栖息地中，秀丽隐杆线虫会遇到各种各样的细菌物种^12,13。对在自然栖息地（腐烂的水果、植物茎和动物载体）收集的代表性样本进行16S rDNA测序，发现秀丽隐杆线虫的天然微生物组以4个细菌门为主:变形菌门、拟杆菌门、厚壁菌门和放线菌门。 在这些分区中，基于栖息地的细菌多样性和丰富度存在很大差异^12,13,14,15。已经建立了几个明确的群落，包括 63 个成员 （BIGbiome）^{16 和 12} 个成员 （CeMbio） 集合，代表了为秀丽隐杆线虫研究社区创建的顶级微生物组属¹⁷。微生物组和成分菌株都可以对秀丽隐杆线虫的生理机能产生不同的影响，例如体型、生长速度和应激反应 9,16,17。这些研究为将秀丽隐杆线虫确立为微生物组研究的模型提供了资源和示例。

这里介绍了一个基于大型颗粒分选机（LPS）的工作流程（图1），该工作流程利用 秀丽隐杆线 虫系统在群体规模上同时测量微生物组组成和宿主生理学的基本测量。从微生物方面来看，该工作流程适用于组装定义的微生物组或单个微生物，以测试群落的稳健性和可塑性，并增加微生物相互作用。从宿主侧来看，该工作流程可实现高通量检测，以测量微生物组中荧光微生物的定植水平，并在发育、体型和繁殖方面获得宿主生理读数。综上所述， 秀丽隐杆 线虫微生物组模型能够进行高通量筛选，以确定调节宿主生理学的代谢和遗传决定因素。

Protocol

1.微生物组混合物的制备

1. 将甘油冷冻原液中的细菌压印或划出到溶原肉汤（LB）平板或适当的生长培养基上，并在基于目标细菌菌株的最佳温度下生长过夜（ 秀丽隐杆线 虫天然微生物通常为25°C）。
2. 从LB板中，使用来自每个细菌分离株的单个菌落（例如，CeMbio系列的12个细菌）在1mL深孔板的单独孔中接种800μLLB培养基。在最佳温度下孵育过夜，以 250 rpm 振荡。
   注:该方案针对定义的天然微生物组（例如CeMbio）进行了优化，但可以通过在适当条件下或其他培养容器（管）下生长来轻松调整单个微生物。
3. 通过分光光度法评估每种微生物的生长。将 20 μL 等分试样转移到 80 μL LB 中，并将溶液加入透明平底 96 孔板中。在读板机上测量 OD₆₀₀ 。
4. 过夜生长后，将深孔培养板以4,000× g 离心10分钟以沉淀细菌，并使用96孔吸液歧管或多通道移液管通过抽吸除去上清液。
5. 使用OD 600值，使用无菌_M9 培养基将每种微生物的浓度归一化至最终OD₆₀₀ 为1.0。
6. 如果结合微生物，则确定实验所需的细菌培养量，并通过将等体积的每种细菌菌株合并到足够大小的试管（例如，5 mL 或 15 mL 试管）中来创建微生物组预混液。
7. 将 30-50 μL 的微生物（最终 OD₆₀₀ 为 1.0）点到每个线虫生长培养基 （NGM） 琼脂平板的中心或孔¹⁸ 上。让接种的微生物组在最佳温度（此处为25°C）下生长过夜。
   注意:根据蠕虫书中的说明或使用预混合的NGM粉末¹⁸提前准备NGM琼脂平板。例如，对于 12 孔板，添加 3 mL NGM，对于 24 孔板，添加 1.5 mL。

2. 同步 秀丽隐杆线虫 的制备，用于在微生物组上生长

1. 在接种 有大肠杆菌 OP50的NGM平板（直径6cm）上培养约100条蠕虫，直到蠕虫达到妊娠成年期。为了该方案的目的，使用了 秀丽隐杆 线虫N2菌株，尽管该方案可以很容易地适用于其他线虫菌株。
2. 加入 6 mL M9 缓冲液（加 0.01% triton X-100;M9-TX）到板上，上下移液，将大约 100 条妊娠成虫洗掉到 15 mL 锥形管中。
3. 通过将两份漂白剂与一份 5 M NaOH 混合来制备新鲜制成的漂白剂溶液。
4. 将蠕虫以3,000× g 离心30秒以沉淀蠕虫。吸出使体积降至 4 mL，然后加入 2 mL 漂白剂溶液。
5. 盖紧盖子并摇晃管子。在10倍放大倍率的立体显微镜下监测溶液中的成虫。当成年体开始分裂时，通常在3.5分钟后，停止摇晃并以3,000× g 离心30秒。
6. 用移液管吸出至最小体积。在 M9-TX 中重悬、离心和吸出四次以洗去漂白剂。
7. 重悬于 4-6 mL M9-TX 中，并将试管放在旋转器上过夜，让鸡蛋在 L1 阶段孵化和同步。
8. 第二天，从试管中取出 10 μL M9-TX 中的 L1 蠕虫，并将它们放在干净的培养皿上。在20倍总放大倍率的立体显微镜下计算活的L1蠕虫的数量。
9. 基于L1密度，移液适当的体积，将~50个同步的L1幼虫滴在微生物组接种的NGM板的边缘，并在20°C下孵育。 让蠕虫生长到所需的年龄（成年期的第 2 天或第 3 天）。

3. 收集蠕虫种群进行肠道微生物组分析

1. 用 1-2 mL M9-TX 将蠕虫从细菌草坪上洗到灭菌的 2 mL 96 孔深板中。
   注意:对于产生显着生物膜的微生物菌株，用液体摇动板5分钟以分解微生物碎片。
2. 将深孔板以300× g 离心1分钟以沉淀蠕虫，然后使用吸气歧管除去液体。
   注意: 如果没有吸气歧管，用户可以使用多通道移液器手动取出液体。确保移液器吸头不接触孔底部，以免丢失蠕虫样品。
3. 使用 1.2 mL 多通道移液器向深孔板的每个孔中加入 1.8 mL M9-TX。通过上下移液几次混合，并以300× g 离心1分钟。重复此步骤四次以去除液体中的细菌。
4. 最终洗涤后，使用吸气歧管将每个孔中的体积降至 100 μL。
   注意:要利用重力将成虫与幼虫分开，请将板放在工作台上30-60秒，让成虫沉入井底。然后，吸出板以从悬浮液中除去幼虫。
5. 向每个孔中加入100μL的M9-TX中的10mM左旋咪唑，并让蠕虫麻痹5分钟。左旋咪唑处理后，如果需要，向每个孔中加入步骤2.3中描述的4%的漂白剂溶液2分钟，以减少细菌团块。漂白剂处理后用 M9-TX 洗涤两次，第二次洗涤后吸出至最终体积 100 μL。
6. 将蠕虫转移到含有 150 μL 10 mM 左旋咪唑的 M9-TX 平底 96 孔板中。将蠕虫密度保持在每孔 50-100 个，如果种群过于拥挤，则将蠕虫分成多个孔。

4. 设置大颗粒分选机和自动进样器

1. 打开空压机、计算机和 LPS 仪器。检查并清空废液箱。然后，将 500 mL 漂白剂添加到空的废物箱中。如果体积低，请检查并重新填充护套和水箱。确保 250 μm 流体和光学核心组件 （FOCA） 就位。
2. 运行对照颗粒进行质量控制。打开 LPS 仪器软件。在软件窗口中，选中 启用激光 以打开 488 nm 和 561 nm 激光器。
   注意:如果对照颗粒在过去 4.2 周内运行过，并且在此期间未更改 FOCA，则可以跳过步骤 4.5-2-2。
3. 选择"设置>控制粒子"。在提示中选择"否"以转到默认设置。每次使用前涡旋对照颗粒（10 mL dH₂O 和 10 mL 对照颗粒在 50 mL 锥形管中）并将它们加载到样品端口上。
4. 准备就绪后，单击 "获取 "以记录 500 个事件。确保事件速率读数在 15–30 个事件/秒之间。
   注意: 如果事件速率不是 15–30 个事件/秒，则应联系工程师调整机器设置。
5. 检查所有参数的变异系数 （CV）。如果CV<15%，则通过质量控制，可以关闭LPS软件。如果 CV > 15%，请再次运行并用新制作的控制颗粒调整千分尺，以将激光与流通池对齐。
6. 连接并打开自动进样器。打开自动进样器仪器软件。这将打开自动进样器和 LPS 软件。在 LPS 软件窗口中，转到"文件">"新建实验"，然后转到"文件">"新建样品"。 选中启用激光以打开 488 nm 和 561 nm 激光器（如果尚未完成）。
7. 在 LPS 软件窗口中使用飞行时间 （TOF）、消光 （EXT） 和荧光通道创建采集点图模板。捕获所有蠕虫的良好起始最大数量是 TOF 和 EXT 的 8,000 个。 荧光标度将根据每种微生物而有所不同。包括在非荧光微生物（例如OP50）上生长的对照蠕虫样品和单独每种荧光微生物（如果混合微生物）作为每次实验的对照。
   1. 在图形主体中单击鼠标右键以修改缩放比例。使用对照动物，例如第 1 天成虫或同步的 L1（或感兴趣的种群）来协助 TOF 和 EXT 门控选择。
8. 在自动进样器窗口中，选择 Prime。转到 "文件">"打开脚本 "以选择正确的内置脚本，然后单击 "确定"。
   1. 仅用于分析，选择带有 "获取"的脚本。对于排序，请选择带有 "分配"的脚本。对于从 96 孔板采集，请选择具有 96 孔的脚本;要从 384 孔板采集，请选择 384 孔的脚本。对于样品体积（40 或 100 μL），选择具有相应体积的脚本。
9. 转到自动进样器软件菜单上的 板模板 ，选择所需的孔进行分析。加载对照样品。将板加载到自动进样器载物台上并固定后，按自动进样器窗口上的 运行板 。出现提示时保存文件。
   注意:在连接 LP 采样器之前，可以使用 LPS 样品端口上的 50 mL 锥形管完成控制样品和设置。
10. 采集完成后，单击LPS软件窗口顶部功能区上的 "存储 数据"按钮，然后再次保存数据。

5. 分析每只动物的秀丽隐杆线虫 特征和肠道微生物组水平

1. 原始数据存储在三种文件类型中:.lmd、.bxr3、.txt。将标记为 .txt 文件的文本文件加载到 R 程序中进行分析。在 R¹⁹ 中完成以下步骤。
2. 使用 tidyverse²⁰ 包作为分析框架。
3. 使用 ggplot 函数（包含在 tidyverse 中）使用 TOF 值作为 x 轴和 EXT 值作为 y 轴来绘制 LPS 数据。正常图将显示两个点云。确保一个靠近原点和 x 轴，表示较小的颗粒，例如幼虫和小碎片，第二组颗粒朝向图的右上方，代表成年线虫。
4. 使用此分组作为指导，选择适当的 TOF 和 EXT 截止值。根据生理学的变化，不同微生物上的 秀丽隐杆线 虫菌株的门控可能会有所不同（例如，深色动物与透明动物或卵携带的变化可能会改变 EXT 系数）。
5. 使用函数子集通过 TOF 和 EXT 门控将成虫和幼虫分开。在此示例中，使用 TOF > 1,200 和 EXT > 1,000 设置来为成年动物设门。
6. 分析生成的数据集是否存在统计差异;在此实验中使用 R 中的 t 检验函数。
   1. 为了确定微生物组对 秀丽隐杆线虫大小和光密度的影响，分别比较不同条件之间的TOF和EXT值。TOF是蠕虫大小的代理，可以指示动物在特定时间的生长速度变化。由于卵子散射的光，EXT变化在发育结束和成年期之间最大，可用于评估这种过渡和繁殖力的时间变化。评估后代的比例和分布（如果在分析过程中保留）。
   2. 为了确定肠道微生物组定植水平的变化，首先通过除以每只动物的单个TOF值来归一化荧光值（例如，红色或绿色列）。随着蠕虫的体型变大并成虫，它们的肠道体积也会变大。归一化有助于减少样本动物大小分布差异造成的伪影。使用标准化的动物来评估不同条件下肠道微生物组定植的变化。
      注意:原始数据示例和相应的 R 脚本可在补充文件 1 JOVE_worm_microbiome.txt和补充文件 2 JOVE_worm_microbiome.r 中找到。参见图2和图3，了解使用两种荧光细菌对宿主和微生物组进行这些分析的代表性示例。

6. 按肠道微生物组特征对 秀丽隐杆线虫 动物进行分类

1. 如步骤3所述，收集在荧光标记的微生物（例如RFP）上生长的 秀丽隐杆线虫 种群。蠕虫应放入 50 mL 锥形管中，其中至少含有 5 mL 样品。目标是大约 2,000 条蠕虫/mL，包括所有成虫和后代。
   注意:这也可以使用LP进样器在平底96孔板中完成。将蠕虫密度保持在每孔 50-100 个。
   1. 如果 LP 采样器已使用，则关闭并断开 LP 采样器。在分拣之前，将样品和吹扫管线重新连接到LPS。
2. 打开 LPS 软件，转到"文件">"新建实验"，然后转到"文件">"新建样品"。 创建一个点图，其中 TOF 位于 x 轴，Extinction 位于 y 轴上。创建另一个点图，其中 TOF 位于 x 轴上，红色位于 y 轴上。使用与以前相同的轴刻度和激光设置。选中启用激光器以打开 488 nm 和 561 nm 激光器
   注意:如果之前已创建这些图，请转到"文件">"打开实验"和"文件>打开样品"以加载图形。
   1. 将控制样品管放在样品端口上。在"采集/分配"对话框中，单击 "采集"。出现提示时保存文件。在测量了足够多的蠕虫以区分种群后，单击 "中止"。
      注意:流速应约为 15–30 个事件/秒。如果没有，请调整蠕虫浓度，以确保对每个液滴的单个动物进行分析或分类。在LPS中，蠕虫以不同的位置（直与卷曲或弯曲）穿过激光的路径。根据它们的位置，它们可能需要不同的时间来通过激光和探测器。
   2. 在 TOF vs Extinction 点图中，在成年人口周围画一个门。在TOF与红点图中，在红值高和低的区域周围绘制门，作为具有不同微生物组定植水平的成虫的感兴趣区域。转到 查看 > 门层次结构 ，并确保荧光门列在成人人口门下。优化设置后，转到 "文件 "> "保存实验 "和 "文件 > 保存样品"。
      注意:在此示例中，根据成人的TOF / EXT门选择动物，并分类到具有红色荧光蛋白表达细菌的高或低定植的池中。但是，LPS 测量的参数的任何组合都可用于识别感兴趣的人群。
3. 在分类之前，确保已装载正确的收集设备。要将 96 孔板加载到收集设备上，请在"采集/分配"对话框的"移动阶段"部分下选择 "加载板 A "> "移动 "，以允许收集阶段移动到加载 96 孔板的准备位置。
4. 对于批量分选，选择适当的试管尺寸，然后单击 移动 以加载 15 mL 或 50 mL 锥形管。在"采集/分配"（Acquire/Dispense） 对话框的"排序"（Sorting） 部分中，从所创建区域的下拉列表中选择排序门。输入定义区域中的物体数量，以分配到流通池喷嘴正下方的收集管。单击"采集/分配"对话框下的 "批量排序 "按钮。
5. 要分液到 96 孔板，请转到 96 孔板>校准板>设置>板。然后转到查看>板模板，选择蠕虫将被分拣到的孔，输入要分拣到每个孔中的对象数量，并选择感兴趣的门控区域。如果将多个门控区域分类到同一板中，请选中"每个孔的门控"框。单击"确定"保存更改。
6. 分配排序编号和位置后，单击"采集/分配"对话框中的" 填充板 "按钮，开始分配到 96 孔板。
   1. 在填充整个 96 孔板之前，对 96 孔板中的动物或对照子集进行测试分选，并使用立体显微镜进行分析，以确保已分选出适当的数量和所需的动物种群。确认准确分选后，对实验样品重复步骤6.3-6.6。单击 LPS 软件窗口顶部功能区上的 "存储 数据"按钮以再次保存数据。
      注意:也可以收集分类动物的所有测量值（EXT，TOF，RFP，GFP等），并与未分类的动物进行比较。如果需要，这可以允许同时运行分析和排序模式。

Results

定义成虫和幼虫种群门
在这里，同步的秀丽隐杆线虫 L1 生长在接种有大肠杆菌 OP50 （Eco） 的 NGM 平板上，这是一种标准的实验室日粮。在20°C下生长96小时或120小时后收集秀丽隐杆线虫种群进行LPS分析（图2A）。灭绝点图（EXT，身体密度的代理）与飞行时间（TOF，体长的代理）创建了两个视觉上分离的动物云。每个点代表一只动物，与幼虫相比，从成虫中观察到更高的EXT和TOF值（图2B）。这两个参数对人口增长和生理学是有价值的推论。例如，幼虫TOF的密度图可以可视化幼虫阶段的分布。2日龄成虫的后代以L1和L2期为主，TOF低于200，而3日龄成虫的大多数后代达到L3和L4期（图2C）。此外，2D 密度和箱须图可用于可视化成人体型和密度的变化，因为与在大肠杆菌上生长的第 2 天相比，第 3 天的 TOF 和 EXT 值增加（

Discussion

在多项研究中，流式蚯蚓法已被用于表征秀丽隐杆线虫基因和抗病原体定植和毒性的途径^21,22。在这里，提出了一种高通量的方法，该方法使用秀丽隐杆线虫来研究肠道微生物组如何调节其宿主生理学。与使用集落形成单位 （CFU） 或 16S rRNA 扩增子测序⁹、^16、17、^23、24 的现有方法相比，这种方法不需要劳动密集型计数或引入潜在的 PCR 偏倚。除了测量整个种群中的微生物组外，这种方法还允许用户可视化种群内的个体变异。这种方法仅受荧光蛋白表达或微生物染色的可用性以及LPS中检测通道数量的限制。下面将讨论实验设计的其他注意事项，以便用户可以根据自己的需要创建自定义工...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
15 mL 锥形底离心管	VWR	10026-076
96 深孔板 （1 mL）	Axygen	P-DW-11-C
96 深孔板 （2 mL）	Axygen	P-DW-20-C
96 孔 Costar 板	康宁	3694
琼脂	Millipore Sigma		标准细菌学琼脂也足够了。
吸气歧管	V&P scientific	VP1171A
漂白	Clorox
漂白剂溶液			将漂白剂与 5M 次氯酸钠 2：1 （v/v）
细胞成像 多功能酶标仪	Biotek	Cytation 5	细菌外径测量
离心	Thermo Scientific	用于 96 孔板和锥形管	Sorvall Legend XTR
荧光显微镜	Nikon	TiE
ggplot：用于绘制数据的各种 R 编程工具。	R 包	版本 3.3.2
大颗粒自动进样器	Union Biometrica	LP 采样器
大颗粒分选器	Union Biometrica	COPAS 生物分选器
左旋咪唑	Fisher	AC187870100
原肉汤 （LB）	RPI	L24066	标准 LB 使用细菌胰蛋白胨、酵母提取物和 NaCl 的自制食谱也是足够。
M9 解决方案			22 mM KH 2 PO 4 单元、42.3 mM Na2HPO 4 、85.6 mM NaCl、1 mM MgSO4
线虫生长培养基	RPI	N81800-1000.0	1 mM CaCl 2、25 mM KPO4 pH 6.0、1 mM MgSO4。
RStudio	GNU	版本 1.3.1093
次氯酸钠	Sigma-Aldrich		5M NaOH
立体显微镜	尼康	SMZ745
无菌 10 cm 直径培养皿	康宁	351029
无菌 12 孔板	VWR	10062-894
无菌 24 孔板	VWR	10062-896
无菌 6 cm 直径培养皿	Corning	351007
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787