流动蚯蚓法在 秀丽隐 杆线虫肠道微生物组定量分析中的应用

Summary

秀丽隐杆线虫 是一种强大的模型，用于研究驱动宿主-微生物组相互作用的分子决定因素。我们提出了一个高通量管道，分析肠道微生物组定植的单一动物水平以及 秀丽隐杆 线虫生理学的关键方面。

Abstract

肠道微生物组的组成会对动物的整个发育和生命过程中的宿主生理机能产生巨大影响。测量微生物组的组成变化对于确定这些生理变化之间的功能关系至关重要。 秀丽隐杆线虫 已成为一种强大的宿主系统，用于研究宿主-微生物组相互作用的分子驱动因素。凭借其透明的身体计划和荧光标记的天然微生物，可以使用大型颗粒分选机轻松量化单个 秀丽隐杆线虫 动物肠道微生物组内微生物的相对水平。在这里，我们描述了微生物组的实验设置、所需生命阶段线 虫 种群的收集和分析、分选机的操作和维护以及所得数据集的统计分析的程序。我们还讨论了基于目标微生物优化分选机设置的注意事项，为 秀丽隐杆 线虫生命阶段开发有效的门控策略，以及如何利用分选机功能根据肠道微生物组组成丰富动物种群。潜在应用的示例将作为协议的一部分进行介绍，包括扩展到高通量应用的潜力。

Introduction

动物的进化受到微生物的持续影响¹.从环境中的各种微生物中，动物宿主获得了特定的伙伴² ，这些伙伴扩展了宿主的能力并驱动其生理学和对疾病的易感性³。例如，肠道微生物组的宏基因组分析揭示了富含代谢类别的微生物基因，这些基因可能在肥胖小鼠中赋予更大的能量收集和储存^{4，其中许多}也存在于人类肠道微生物组⁵中。尽管微生物组的复杂性和宿主系统对大规模筛选的可处理性阻碍了进展，但仍然非常需要建立因果关系并确定微生物组影响的分子决定因素。

模式生物秀丽隐杆线虫提供了一个平台，以促进对微生物组和宿主生理学之间联系的分子理解。秀丽隐杆线虫拥有 20 个具有粘膜层和绒毛结构的肠细胞。这些细胞配备了丰富的化学感受器基因，这些基因可以感知微生物产物并产生可能调节其肠道定植者的抗菌分子^6,7。秀丽隐杆线虫的这种保守生物学导致了大量调节肠道微生物的宿主信号传导的发现，包括胰岛素信号传导、TGF-β 和 MAP 激酶 ^8,9,....

Protocol

1.微生物组混合物的制备

1. 将甘油冷冻原液中的细菌压印或划出到溶原肉汤（LB）平板或适当的生长培养基上，并在基于目标细菌菌株的最佳温度下生长过夜（ 秀丽隐杆线 虫天然微生物通常为25°C）。
2. 从LB板中，使用来自每个细菌分离株的单个菌落（例如，CeMbio系列的12个细菌）在1mL深孔板的单独孔中接种800μLLB培养基。在最佳温度下孵育过夜，以 250 rpm 振荡。
   注:该方案针对定义的天然微生物组（例如CeMbio）进行了优化，但可以通过在适当条件下或其他培养容器（管）下生长来轻松调整单个微生物。
3. 通过分光光度法评估每种微生物的生长。将 20 μL 等分试样转移到 80 μL LB 中，并将溶液加入透明平底 96 孔板中。在读板机上测量 OD₆₀₀ 。
4. 过夜生长后，将深孔培养板以4,000× g 离心10分钟以沉淀细菌，并使用96孔吸液歧管或多通道移液管通过抽吸除去上清液。
5. 使用OD 600值，使用无菌_M9 培养基将每种微生物的浓度归一化至最终OD₆₀₀ 为1.0。
6. 如果结合微生物，则确定实验所需的细菌培养量，并通过将等体积的每种细菌菌株合并到足够大小的试管（例如，5 mL 或 15 mL 试管）中来创建微生物组预混液。
7. 将 30-50 μL 的微生....

Results

定义成虫和幼虫种群门
在这里，同步的秀丽隐杆线虫 L1 生长在接种有大肠杆菌 OP50 （Eco） 的 NGM 平板上，这是一种标准的实验室日粮。在20°C下生长96小时或120小时后收集秀丽隐杆线虫种群进行LPS分析（图2A）。灭绝点图（EXT，身体密度的代理）与飞行时间（TOF，体长的代理）创建了两个视觉上分离的动物云。每个点代表一只动物，与幼虫相比，从成虫中观察到更高的EXT和TOF值（图2B）。这两个参数对人口增长和生理学是有价值的推论。例如，幼虫TOF的密度图可以可视化幼虫阶段的分布。2日龄成虫的后代以L1和L2期为主，TOF低于200，而3日龄成虫的大多数后代达到L3和L4期（图2C）。此外，2D 密度和箱须图可用于可视化成人体型和密度的变化，因为与在大肠杆菌上生长的第 2 天相比，第 3 天的 TOF 和 EXT 值增加（

Discussion

在多项研究中，流式蚯蚓法已被用于表征秀丽隐杆线虫基因和抗病原体定植和毒性的途径^21,22。在这里，提出了一种高通量的方法，该方法使用秀丽隐杆线虫来研究肠道微生物组如何调节其宿主生理学。与使用集落形成单位 （CFU） 或 16S rRNA 扩增子测序⁹、^16、17、^23、24 的现有方法相比，这种方法不需要劳动密集型计数或引入潜在的 PCR 偏倚。除了测量整个种群中的微生物组外，这种方法还允许用户可视化种群内的个体变异。这种方法仅受荧光蛋白表达或微生物染色的可用性以及LPS中检测通道数量的限制。下面将讨论实验设计的其他注意事项，以便用户可以根据自己的需要创建自定义工.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
15 mL 锥形底离心管	VWR	10026-076
96 深孔板 （1 mL）	Axygen	P-DW-11-C
96 深孔板 （2 mL）	Axygen	P-DW-20-C
96 孔 Costar 板	康宁	3694
琼脂	Millipore Sigma		标准细菌学琼脂也足够了。
吸气歧管	V&P scientific	VP1171A
漂白	Clorox
漂白剂溶液			将漂白剂与 5M 次氯酸钠 2：1 （v/v）
细胞成像 多功能酶标仪	Biotek	Cytation 5	细菌外径测量
离心	Thermo Scientific	用于 96 孔板和锥形管	Sorvall Legend XTR
荧光显微镜	Nikon	TiE
ggplot：用于绘制数据的各种 R 编程工具。	R 包	版本 3.3.2
大颗粒自动进样器	Union Biometrica	LP 采样器
大颗粒分选器	Union Biometrica	COPAS 生物分选器
左旋咪唑	Fisher	AC187870100
原肉汤 （LB）	RPI	L24066	标准 LB 使用细菌胰蛋白胨、酵母提取物和 NaCl 的自制食谱也是足够。
M9 解决方案			22 mM KH 2 PO 4 单元、42.3 mM Na2HPO 4 、85.6 mM NaCl、1 mM MgSO4
线虫生长培养基	RPI	N81800-1000.0	1 mM CaCl 2、25 mM KPO4 pH 6.0、1 mM MgSO4。
RStudio	GNU	版本 1.3.1093
次氯酸钠	Sigma-Aldrich		5M NaOH
立体显微镜	尼康	SMZ745
无菌 10 cm 直径培养皿	康宁	351029
无菌 12 孔板	VWR	10062-894
无菌 24 孔板	VWR	10062-896
无菌 6 cm 直径培养皿	Corning	351007
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787