秀丽隐杆线虫肠道微生物组定量与分析的流式蠕虫检测技术应用

摘要

Caenorhabditis elegans 是研究驱动宿主-微生物组相互作用的分子决定因素的有力模型。我们提出了一种高通量分析流程，可在单个动物水平上同时表征肠道微生物组定植情况以及 C. elegans 生理学的关键方面。

摘要

肠道微生物组的组成可能对动物整个发育过程及生命周期中的宿主生理状态产生显著影响。检测微生物组组成的变化，对于揭示这些生理变化之间的功能关系至关重要。Caenorhabditis elegans 已成为研究宿主与微生物组相互作用分子机制的有力宿主模型。凭借其透明的身体结构以及带有荧光标记的天然微生物，可通过大型颗粒分选仪轻松定量单个 C. elegans 个体肠道微生物组中各类微生物的相对丰度。本文描述了构建微生物组实验体系、收集和分析特定生命阶段的 C. elegans 种群、分选仪的操作与维护，以及对所得数据集进行统计分析的具体步骤。我们还讨论了根据目标微生物优化分选仪参数的注意事项，针对 C. elegans 不同生命阶段设计有效设门策略的方法，以及如何利用分选仪功能依据肠道微生物组组成富集特定动物种群。本方案中将展示若干潜在应用示例，包括该方法向高通量应用扩展的潜力。

引言

动物的进化始终受到微生物的影响¹。动物宿主从环境中多种多样的微生物中获得特定的共生伙伴²，这些伙伴能够扩展宿主的功能，并影响其生理状态以及对疾病的易感性³。例如，对肠道微生物组的宏基因组分析发现，在肥胖小鼠中存在富集的微生物基因代谢类群，可能促进更高的能量获取与储存能力⁴，其中许多基因也在人类肠道微生物组中被发现⁵。然而，目前仍迫切需要建立因果关系，并明确微生物组作用的分子决定因素；但由于微生物组的复杂性以及宿主系统在大规模筛选中的可操作性受限，相关研究进展受到阻碍。

模式生物 C. elegans 为深入理解微生物组与宿主生理之间关联的分子机制提供了研究平台。C. elegans 拥有20个肠细胞，其具有黏膜层和绒毛结构。这些细胞富含化学感受器基因，可感知微生物代谢产物，并产生可能调控其肠道定植微生物的抗菌分子^6,7。基于 C. elegans 这种保守的生物学特性，研究人员已取得大量关于调控肠道微生物的宿主信号通路的重要发现....

方案

1. 微生物组混合物的制备

1. 从甘油冻存菌种中取细菌，划线或点种至LB（Luria-Bertani）培养基平板或其他适宜的生长培养基上，在适合目标菌株的最佳温度下过夜培养（通常秀丽隐杆线虫（C. elegans）的天然微生物在25 °C下培养）。
2. 从LB平板上挑取每种细菌分离株的单个菌落（例如CeMbio菌种库中的12种细菌），分别接种到1 mL深孔板的各个孔中，每孔含800 µL LB培养基。在最佳温度下以250 rpm振荡培养过夜。
   注意：本方案优化用于定义明确的天然微生物组（例如CeMbio），但也可根据适当培养条件或使用其他培养容器（如离心管）轻松调整以适用于单一微生物。
3. 通过分光光度法评估各微生物的生长情况。取20 µL菌液与80 µL LB培养基混合，将混合液加入透明平底96孔板中。使用酶标仪测定OD₆₀₀ 值。
4. 过夜培养后，将深孔培养板在4,000 × g 条件下离心10分钟，使细菌沉淀，然后使用96孔吸液 manifold 或多通道移液器吸除上清液。
5. 根据OD₆₀₀测定值，用无菌M9培养基将每种微生物的浓度标准化至最终OD₆₀₀为1.0。
6. 若需组合多种微生物，根据实验所需确定各细菌培养物的用量，并将等体积的各菌株混合于适当大小的离心管（例如5 mL....

结果

定义成虫和幼虫种群门控
此处，同步化 秀丽隐杆线虫 L1期幼虫在接种有大肠杆菌的NGM平板上培养 E. coli OP50 (Eco)，一种标准的实验室食物。 C. elegans 在培养96小时或120小时后收集菌群用于LPS分析 20 °C (图 2A）。灭绝值（EXT，作为体密度的替代指标）与飞行时间（TOF，作为体长的替代指标）的散点图呈现出两个在视觉上分离的动物群集。每个点代表一个单独的动物，成虫的EXT和TOF值均高于幼虫。图2B）。这两个参数对于种群增长和生理学研究具有重要的推断价值。例如，幼虫飞行时间（TOF）的密度图可以直观展示幼虫发育阶段的分布情况。来自2日龄成虫的子代主要处于L1和L2阶段，TOF低于200；而来自3日龄成虫的子代大多已发育至L3和L4阶段（图2C此外，二维密度图和箱线图有助于直观展示成虫体型和密度的变化，因为当在指定条件下培养.......

讨论

在多项研究中，流式蠕虫分析已被用于表征 C. elegans 基因及通路在抵御病原体定植和毒性方面的作用^21,22。本文介绍了一种适用于高通量分析的方法，利用 C. elegans 研究肠道微生物组如何调节宿主生理功能。与现有的菌落形成单位（CFU）或16S rRNA扩增子测序方法^{9,16,17,23,24}相比，该方法无需耗时的人工计数，也不会引入潜在的PCR偏差。除了可对整个群体中的微生物组进行定量外，该方法还允许用户观察群体内个体间的差异。该方法的局限性仅在于微生物是否可用荧光蛋白表达或染色标记，以及激光共聚焦扫描系统（LPS）中检测通道的数量。下文讨论了实验.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
15 mL 圆底离心管	VWR	10026-076
96 孔深孔板（1 mL）	Axygen	P-DW-11-C
96 孔深孔板（2 mL）	Axygen	P-DW-20-C
96 孔 Costar 板	Corning	3694
琼脂	Millipore Sigma		标准细菌学琼脂亦可满足需求。
吸液装置	V&P scientific	VP1171A
漂白剂	Clorox
漂白剂溶液			将漂白剂与 5M 次氯酸钠按 2:1（v/v）混合
细胞成像多功能读板仪	Biotek	Cytation 5	用于细菌 OD 测量
离心机	Thermo scientific	Sorvall Legend XTR	适用于 96 孔板和锥形管
荧光显微镜	Nikon	TiE
ggplot：用于数据绘图的各种 R 编程工具	R 包	版本 3.3.2
大颗粒自动进样器	Union Biometrica	LP Sampler
大颗粒分选仪	Union Biometrica	COPAS Biosorter
左旋咪唑	Fisher	AC187870100
溶菌肉汤（LB）	RPI	L24066	使用胰蛋白胨、酵母提取物和 NaCl 自行配制的标准 LB 培养基亦可满足需求。
M9 溶液			22 mM KH₂PO₄（单碱基），42.3 mM Na₂HPO₄，85.6 mM NaCl，1 mM MgSO₄
线虫生长培养基	RPI	N81800-1000.0	高压灭菌后添加 1 mM CaCl₂、25 mM KPO₄（pH 6.0）和 1 mM MgSO₄
RStudio	GNU	版本 1.3.1093
次氯酸钠	Sigma-Aldrich		5M NaOH
体视显微镜	Nikon	SMZ745
无菌 10 cm 直径培养皿	Corning	351029
无菌 12 孔板	VWR	10062-894
无菌 24 孔板	VWR	10062-896
无菌 6 cm 直径培养皿	Corning	351007
吐温 X-100	Sigma-Aldrich	T8787