本文介绍了一种通过自发性基因工程小鼠模型获取小鼠未分化甲状腺癌（ATC）肿瘤的标准流程。此外，我们还提供了关于原发性和转移性病灶的肿瘤动态学及病理学信息。该模型将有助于研究人员理解肿瘤发生机制，并促进药物研发。
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本文内容
摘要
摘要
间变性甲状腺癌（ATC）是一种罕见但致命的恶性肿瘤，预后极差。由于ATC患者的标准治疗手段几乎耗尽，迫切需要对ATC的癌变机制、疾病进展及治疗方法进行更深入的研究。然而，由于该病发病率较低，阻碍了全面的临床研究和组织样本的收集，导致在开发有效治疗方案方面进展甚微。我们通过基因工程技术，在C57BL/6背景下构建了一种可条件性诱导的ATC小鼠模型（mATC）。该ATC小鼠模型的基因型为TPO-cre/ERT2；BrafCA/wt；Trp53ex2-10/ex2-10，并通过腹腔注射他莫昔芬进行诱导。利用该模型，我们研究了肿瘤动态变化（诱导4个月后肿瘤面积范围为12.4 mm2至32.5 mm2）、生存期（中位生存期为130天）和转移情况（91.6%的小鼠出现肺转移）曲线以及病理特征（通过Cd8、Foxp3、F4/80、Cd206、Ki67和Caspase-3免疫组化染色进行表征）。结果表明，自发性mATC在肿瘤生长动态和免疫微环境方面与人类ATC肿瘤高度相似。综上所述，该mATC模型具有高度一致的病理生理特征和统一的基因型，在一定程度上解决了临床ATC组织样本短缺及样本异质性的问题。因此，该模型将有助于开展ATC的机制研究和转化研究，并为评估小分子药物及免疫治疗药物在ATC中的治疗潜力提供有效平台。
引言
甲状腺癌是最常见的内分泌系统恶性肿瘤之一1，起源于甲状腺上皮细胞。近年来，全球范围内甲状腺癌的发病率迅速上升2。根据肿瘤细胞分化程度的不同，甲状腺癌可分为不同类型。依据临床行为和组织学特征，甲状腺癌可分为分化型癌，包括乳头状甲状腺癌（PTC）和滤泡状甲状腺癌（FTC）、低分化癌（PDTC）以及未分化或间变性甲状腺癌（ATC）3。与行为温和、预后较好的常见类型PTC相比4，ATC是一种罕见但高度侵袭性的恶性肿瘤，占所有甲状腺肿瘤的2%至3%5。尽管ATC较为罕见，但它导致了约50%的甲状腺癌相关死亡，患者生存期极差（6-8个月）6,7。超过50%的ATC病例在确诊时已发生肺转移8。除了ATC本身具有高度侵袭性外，临床上尚未开发出有效的治疗方法。因此，ATC患者的预后极为不乐观9,10,11。这表明迫切需要对ATC发生发展的分子机制及其治疗策略进行更深....
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方案
本研究所涉及的动物实验程序已获得中国四川省成都市四川大学华西医院动物伦理委员会的批准。
1. TBP 小鼠的诱导
- 确定小鼠基因型
- 约3周龄时，将雌性小鼠与雄性小鼠分笼饲养。同时使用耳标钳固定耳标，将耳标置于耳部下半部分的中三分之一处，注意避开毛细血管最密集的区域。
- 轻柔但牢固地固定小鼠。牢固抓住小鼠尾巴根部，将小鼠放置在可使其抓握的表面上。
- 用另一只手轻柔而稳固地按住小鼠肩部，然后迅速用拇指和食指捏住颈部背侧皮肤。用小指夹住尾巴以固定。
- 用酒精棉片擦拭尾部，使用无菌剪刀剪取小于<5 mm的皮肤样本，并放入带有标签的洁净样本容器中。无需去除小鼠体毛。使用无菌海绵压迫尾部以实现止血。
- 随后，裂解小鼠尾组织并进行聚合酶链式反应（PCR）以鉴定基因型。
注意：每剪取一只小鼠尾组织后，必须用酒精棉擦拭剪刀表面，以避免不同小鼠尾组织间的基因交叉污染。将小鼠放回笼中后，需观察5分钟，检查伤口部位是否有出血迹象。本研究中所用引物列表及PCR反应条件详见表1。
- 他莫昔芬诱导的TBP小鼠模型
- 称取0.3 g他莫昔芬，加入15 mL玉米油中，通过超声处理（功率=20%，时间=20分钟，温度=4 °C）溶....
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结果
我们诱导小鼠发生未分化甲状腺癌（mATC），以研究肿瘤生长、小鼠生存时间及病理特征。诱导后，一旦发现以下任一情况，立即处死小鼠并采集样本（甲状腺、肺和肝脏）：1）肿瘤压迫引起的呼吸困难；2）食欲减退和异常发声；3）异常嗜睡；4）体重减轻超过20%。在取样过程中，我们发现所有小鼠（12/12）在诱导后均成功形成肿瘤。我们记录了小鼠的生存时间、肿瘤特征/大小以及转移病灶情况。
肉眼观察结果如下：1）肿瘤有触痛，左右两侧肿瘤大小不一致；2）大多数小鼠（12只中的11只）出现肺转移，但均未发现肝转移。具体而言，整个过程中通过动物高频超声与光声成像系统（Vevo®3100）对肿瘤大小进行监测17。根据超声数据绘制了肿瘤生长曲线（图1A），以观察肿瘤大小的动态变化。此外，肿瘤在早期生长较慢（从第0天到第60天，平均肿瘤面积从9.47 mm2 变化至11.75 mm2），而在晚期生长显著加快（从第60天到第100天，平均肿瘤面积从11.75 mm.......
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讨论
甲状腺肿瘤解剖方案中的关键步骤
在解剖过程中，必须准确认识甲状腺的解剖位置。甲状腺是一个蝴蝶状的腺体，位于下颌下腺背侧，靠近甲状软骨和气管。在操作过程中，需小心避免切断颈部两侧的血管。
mATC 品系的改良与实验问题排查
甲状腺未分化癌（ATC）是一种罕见且高度侵袭性的恶性肿瘤。mATC 与 ATC 患者的临床特征具有一定相似性。具体而言，mATC 小鼠的主要死因为窒息，这与 ATC 患者的致死原因一致。因此，在实验过程中应注意以下事项：1）操作时应轻柔抓握小鼠，并密切关注其呼吸状况；2）在疾病晚期应密切监测，以防小鼠突然死亡而导致无法及时获取样本；3）甲状腺和肺组织表面的血液可能会影响组织观察与拍照效果，可通过摘除眼球减少小鼠血容量，从而减少组织表面血量。
使用小鼠ATC模型的局限性
人类ATC的发生和发展过程复杂多变，而小鼠ATC（mATC）的遗传背景相对简单，仅能模拟部分人类ATC的特.......
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
本工作得到中国国家重点研发计划（2021YFA1301203）；国家自然科学基金（82103031、82103918、81973408、82272933）；四川大学华西医院临床研究孵化项目（22HXFH019）；成都市科学技术局国际合作项目（2020-GH02-00017-HZ）；四川省自然科学基金（2022NSFSC1314）的资助； "四川大学华西医院学科卓越发展计划1.3.5项目" （ZYJC18035、ZYJC18025、ZYYC20003、ZYJC18003）；四川省科技计划项目（2023YFS0098）。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 100x 柠檬酸抗原修复液（pH 6.0） | MXB | 货号 MVS-0101 | |
| 50倍EDTA抗原修复液（pH 9.5） | ZSGB-GIO | 货号 ZLI-9071 | |
| Brafflox/wt 小鼠 | 与中国成都亿腾生物制药技术有限公司生命科学研究所合作 | ||
| Caspase-3 | 碧云天 | 货号 AC033 | |
| CD8 | 细胞信号技术公司 | 货号# 98941；RRID:AB_2756376 | |
| CD206 | 细胞信号技术公司 | 货号 24595；RRID:AB_2892682 | |
| 麻醉诱导舱 | RWDlifescience | ||
| 增强型DAB显色试剂盒 | MXB | 货号 DAB-2031 | |
| 伊红染色液 | ZSGB-GIO | 货号 ZLI-9613 | |
| F4/80 | Abcam | 货号 100790；RRID:AB_10675322 | |
| Foxp3 | 细胞信号技术公司 | 货号 12653；RRID:AB_2797979 | |
| 全封闭组织脱水机 | Leica Biosystems | ASP300S | |
| 苏木精染色液 | ZSGB-GIO | 货号 ZLI-9610 | |
| HistoCore Arcadia 全自动组织包埋机 | Leica Biosystems | ||
| Ki67 | Beyotime | 货号 AF1738 | |
| 旋转切片机 | RWDlifescience | Minux S700 | |
| SPlink 检测试剂盒（生物素-链霉亲和素 HRP 检测系统） | ZSGB-GIO | 货号 SP-9001 | |
| TPO-cre/ERT2 小鼠 | 与中国成都亿邦制药科技有限公司生命科学研究所合作 | ||
| Trp53flox/wt 小鼠 | 与中国成都亿邦制药科技有限公司生命科学研究所合作 | ||
| 超声波细胞破碎仪 | 宁波新益超声波设备有限公司 | JY92-IIN | |
| 超声耦合剂 | Keppler | KL-250 | |
| 超声系统 | VisualSonics | Vevo 3100 |
参考文献
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics, 2019. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 69 (1), 7-34 (2019).
- Parenti, R., Salvatorelli, L., Magro, G. Anaplastic thyroid carcinoma: Current treatments and potenti....
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重印与许可
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