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方法文章

小鼠自发性自身免疫性甲状腺炎模型的建立

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⸱

DOI：

10.3791/64609

⸱

2023年3月17日

 ,  ,  ,  , 
1Thyroid and Parathyroid Surgery Center, West China Hospital of Sichuan University, 2The Laboratory of Thyroid and Parathyroid Disease, West China Hospital of Sichuan University, 3State Key Laboratory of Biotherapy and Cancer Center, West China Hospital, Sichuan University and Collaborative Innovation Center

本文内容

勘误通知

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

摘要

已建立多种桥本甲状腺炎的动物模型，其中包括NOD小鼠的自发性自身免疫性甲状腺炎。H-2h4小鼠是一种简单且可靠的HT诱导模型。本文描述了该建模方法，并对病理过程进行评估，以增进对SAT小鼠模型的理解。

摘要

近年来，桥本甲状腺炎（HT）已成为最常见的自身免疫性甲状腺疾病。其特征是淋巴细胞浸润以及可检测到特异性血清自身抗体。尽管其潜在机制尚不明确，但桥本甲状腺炎的发病风险与遗传和环境因素相关。目前，已有多种自身免疫性甲状腺炎模型，包括实验性自身免疫性甲状腺炎（EAT）和自发性自身免疫性甲状腺炎（SAT）。

在小鼠中，实验性自身免疫性甲状腺炎（EAT）是桥本甲状腺炎（HT）的常用模型，通常采用脂多糖（LPS）联合甲状腺球蛋白（Tg）免疫，或添加完全弗氏佐剂（CFA）进行诱导。EAT小鼠模型已在多种小鼠品系中广泛建立。然而，疾病进展更可能与Tg抗体反应相关，而该反应在不同实验中可能存在差异。

SAT 也被广泛用于研究 NOD.H-2h4 小鼠中的桥本甲状腺炎（HT）。NOD.H-2h4 小鼠是通过非肥胖糖尿病（NOD）小鼠与 B10.A(4R) 小鼠杂交获得的一种新品系，无论是否给予碘喂养，均可显著诱导出桥本甲状腺炎。在诱导过程中，NOD.H-2h4 小鼠表现出高水平的抗甲状腺球蛋白抗体（TgAb），并伴有淋巴细胞浸润甲状腺滤泡组织。然而，针对此类小鼠模型，目前尚缺乏对碘诱导过程中病理变化的全面评估研究。

本研究建立了一种用于桥本甲状腺炎（HT）研究的SAT小鼠模型，并在长期碘诱导后评估了其病理变化过程。通过该模型，研究人员可以更深入地理解HT的病理发展机制，并筛选针对HT的新型治疗方法。

引言

桥本甲状腺炎（HT），也称为慢性淋巴细胞性甲状腺炎或自身免疫性甲状腺炎，于1912年首次被报道1。HT的特征是淋巴细胞浸润并损伤甲状腺滤泡组织。实验室检查主要表现为甲状腺特异性抗体升高，包括抗甲状腺球蛋白抗体（TgAb）和抗甲状腺过氧化物酶抗体（TPOAb）2。HT的发病率为0.4%–1.5%，占所有甲状腺疾病的20%–25%，近年来该数值呈上升趋势3。此外，大量研究报道HT与乳头状甲状腺癌（PTC）的发生及复发相关4,5；其潜在机制尚存争议。自身免疫性甲状腺炎也是女性不孕的重要因素之一6。因此，明确HT的发病机制至关重要，而建立稳定且简便的动物模型是实现这一目标的关键。

为了研究桥本甲状腺炎（HT）的病因，目前主要采用了两种小鼠模型，包括实验性自身免疫性甲状腺炎（EAT）和自发性自身免疫性甲状腺炎（SAT）7,8。通过使用特定的甲状腺抗原（包括粗制甲状腺组织、纯化的甲状腺球蛋白[TG]、甲状腺过氧化物酶[TPO]、重组TPO胞外域以及选定的TPO肽段）对易感小鼠进行免疫，以建立EAT小鼠模型。此外，在免疫过程中还常联合使用佐剂，如脂多糖（LPS）、完全弗氏佐剂（CFA）以及其他非常规佐剂，以打破免疫耐受9,10,11,12,13,14,15,16,17。

SAT 模型是研究自身免疫性甲状腺炎自发性发生的重要模型，该模型基于 NOD.H-2h4 小鼠。NOD.H-2h4 小鼠是通过 NOD 小鼠与 B10.A(4R) 小鼠杂交后，再多次回交至 NOD 背景而获得的一个新品系，携带自身免疫性甲状腺炎易感基因 IAk18,19。NOD.H-2h4 小鼠不发生糖尿病，但自身免疫性甲状腺炎和干燥综合征（SS）的发生率很高19。研究发现，细胞间黏附分子-1（ICAM-1）在 3–4 周龄 NOD.H-2h4 小鼠的甲状腺组织中高表达。此外，随着碘摄入量的增加，甲状腺球蛋白分子的免疫原性增强，进一步上调 ICAM-1 的表达，这在单核细胞浸润过程中发挥重要作用21。该模型在模拟自身免疫过程的同时，验证了碘剂量与疾病严重程度之间的关系。该建模方法稳定，成功率高。SAT 模型已应用多年以诱导自身免疫性甲状腺炎，至今仍是研究自身免疫性甲状腺炎发病机制的有效手段。然而，目前 EAT 模型的构建方法较为复杂且成本较高；不同实验室采用的免疫方法和注射部位各不相同。此外，不同遗传背景的小鼠诱导率存在差异，其潜在机制仍需进一步研究阐明。

然而，SAT 模型中甲状腺炎的发展与碘化钠、性别二态性以及饲养条件相关。为了阐明在 SAT 模型中建立自身免疫性甲状腺炎的适当方法，本文描述了在不同条件下诱导自身免疫性甲状腺炎的技术。此外，该方法还允许研究该疾病不同阶段的发病机制及免疫学进展。

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方案

下述方案已获四川大学实验动物管理和使用委员会制定的实验动物护理与使用指南批准。

1. 准备

  1. 将所有小鼠饲养于特定病原体阴性环境中，采用12小时光照-黑暗循环（分别从上午07:00和晚上07:00开始）。维持室温在22 °C。每周更换一次垫料。提供足量的标准啮齿类动物饲料和饮水。
  2. 配制NaI水溶液储备液时，称取2.5 g该化合物，在涡旋搅拌下溶于50 mL无菌纯水中，得到5%的储备液。将此储备液避光保存于4 °C冰箱中，可稳定保存长达8周。
  3. 配制NaI工作液时，取2.5 mL储备液溶于250 mL普通水中，作为NOD.H-2h4小鼠的日常饮用水，得到0.05%的工作溶液。

2. 甲状腺炎的诱导

  1. SAT 模型
    1. 将 NOD.H-2h4 小鼠（8 周龄）按单一性别（无性二型性）分组，每笼 5 只，置于屏障笼中饲养，饲养条件见步骤 1.1。
    2. 为在 NOD.H-2h4 小鼠中诱导自身免疫性甲状腺炎，给予所有小鼠饮用含 0.05% NaI 的水，持续 8 周。每周更换 NaI 水，并每周评估小鼠状态，包括外观、体重、食欲、精神状态和活动能力。
  2. EAT 模型
    1. 将 BALB/c 小鼠（8 周龄）按单一性别（无性二型性）分组，每笼 5 只，置于屏障笼中饲养，饲养条件见步骤 1.1。给予所有小鼠饮用含 0.05% NaI 的水，持续 8 周。
    2. 在前 2 周内，每周皮下注射一次 CFA 与 Tg 的混合物（200 µL）。
    3. 从第 3 周开始，每周皮下注射一次 IFA 与 Tg 的混合物（200 µL），连续注射 3 周。

3. 测量

  1. 外周血样本的制备
    1. 诱导后，通过腹腔注射以每克体重0.01 mL的麻醉剂剂量对小鼠进行麻醉。麻醉剂的配制方法为：将咪达唑仑（用于镇静，40 µg/100 µL）、美托咪啶（用于镇静，7.5 µg/100 µL）和酒石酸布托啡诺（用于镇痛，50 µg/100 µL）溶于磷酸盐缓冲液（PBS）中混合。
      注：麻醉混合液中各成分的具体浓度为：咪达唑仑13.33 µg/100 µL，美托咪啶2.5 µg/100 µL，布托啡诺16.7 µg/100 µL。小鼠给药剂量分别为：咪达唑仑4 µg/g，美托咪啶0.75 µg/g，布托啡诺1.67 µg/g。 当小鼠四肢肌肉松弛、胡须无触觉反应且足底反射消失时，表明麻醉深度已达到要求。 
    2. 小鼠麻醉后，用一只手固定小鼠，按压眼部皮肤使眼球突出。然后将毛细管插入内眼角，以与鼻平面呈30–45度角刺入。在轻轻旋转毛细管的同时施加压力，血液将通过毛细作用流入管中。
    3. 将采集的血液置于4 °C冰箱中静置2小时，随后在4 °C条件下以1,000 × g离心10分钟以获取样本。如需进一步分析，将剩余样本储存在-80 °C环境中。
  2. 甲状腺组织样本的制备
    1. 根据机构规定人道处死动物。随后解剖胸壁暴露心脏，剪开右心房，并通过连接20 mL注射器的静脉输液针向左心室灌注生理盐水，直至组织变为白色。
    2. 用大头针将小鼠固定在解剖台上，以75%乙醇对颈部进行消毒。使用组织剪从胸骨顶端至下颌沿颈部中线剪开皮肤，充分暴露颈部组织。
    3. 观察位于下颌下方的一对粉红色腺体——下颌下腺，其下方为气管前肌。使用眼科剪和镊子分离腺体与肌肉，暴露气管及甲状软骨。
    4. 使用弯头镊提起甲状软骨和气管，分离其下方组织。分别剪断软骨和气管的远端与近端，将甲状腺连同气管一并取出。
    5. 将腺体浸入4%多聚甲醛中固定12–24小时，随后转移至70%乙醇中保存。
    6. 将甲状腺活检材料的各个叶分别放入组织处理盒中，并依次经过以下梯度酒精脱水处理：70%、80%、90%、95%、100%、100%乙醇，每步40分钟；1/2二甲苯 + 1/2无水乙醇，2小时；100%二甲苯，1.5小时；100%二甲苯，1.5小时；1/2二甲苯 + 1/2石蜡，2小时；40 °C烘箱中40分钟；石蜡I中30分钟；石蜡II中30分钟。最后包埋于石蜡块中。
    7. 染色前，将5 µm厚的甲状腺组织切片在二甲苯中脱蜡（如下所示），并依次经递减浓度的乙醇复水：二甲苯I 10分钟，二甲苯II 10分钟，二甲苯III 10分钟；无水乙醇I 5分钟，无水乙醇II 5分钟；90%乙醇5分钟，80%乙醇5分钟，70%乙醇5分钟，50%乙醇5分钟。
    8. 采用苏木精-伊红（H&E）染色法对组织进行染色：苏木精染色15分钟，自来水冲洗15分钟，加入1%盐酸乙醇分化10秒，流水冲洗后依次用50%、70%和80%乙醇各冲洗3分钟。再用0.5%伊红乙醇溶液染色2分钟，流水冲洗。将石蜡切片依次置于75%乙醇2分钟、85%乙醇2分钟、无水乙醇5分钟、二甲苯5分钟。最后用中性树胶封片，加盖玻片。
    9. 为评估淋巴细胞性甲状腺炎的程度，按以下标准对甲状腺切片进行评分：0分：甲状腺组织中几乎无或无淋巴细胞浸润；1+：一个或多个病灶中腺体浸润范围超过1/8；2+：淋巴细胞浸润范围不超过腺体的1/4；3+：腺体1/4至1/2区域被淋巴细胞浸润；4+：超过腺体一半的区域遭到破坏。
      注：建议保留甲状软骨以维持小鼠甲状腺的整体结构，因其体积过小，难以从气管上完整分离。
  3. 甲状腺过氧化物酶抗体（TPOAb）的检测
    注：本实验室已建立稳定表达小鼠TPO的中国仓鼠卵巢（CHO）细胞系。通过XbaI和NheI酶切获得小鼠TPO cDNA，将其克隆至pcDNA5/FRT载体中。质粒构建成功后转染CHO细胞，并用潮霉素B（100 g/mL）进行筛选。
    1. 构建mTPO-CHO细胞后，将第3.1.3步获得的小鼠血清稀释（1:50），与mTPO-CHO细胞共同孵育2小时。孵育结束后，加入碘化丙啶（1 g/mL）排除死细胞，使用异硫氰酸荧光素标记的亲和纯化山羊抗小鼠IgG抗体，通过流式细胞术分析样本。通过FSC-A和SSC-A通道筛选存活的单细胞群体，并从该群体中选择FITC和PI标记的细胞21。
    2. 以未免疫的BALB/c或C57BL/6小鼠血清结合IgG作为阴性对照，以能识别小鼠TPO的抗人TPO单克隆抗体22作为阳性对照23。TPO结合数据以几何均值表示。
  4. 甲状腺球蛋白抗体（TgAb）的检测
    注：按照试剂盒说明书使用ELISA试剂盒检测甲状腺球蛋白。
    1. 根据说明书在微量离心管中稀释标准品。将试剂盒从冰箱取出，室温平衡30分钟。
    2. 设置标准孔、空白孔和待测孔。空白孔仅加入缓冲液，标准孔加入标准溶液，待测孔加入10 µL样本。加样时尽量避免接触孔壁，并轻轻震荡使液体沉降至孔底。
    3. 以经Tg、CFA和IFA免疫的BALB/c小鼠血清作为阳性对照，以饮用普通水的8周龄NOD.H-2h4小鼠血清作为阴性对照24。
    4. 将酶标板置于37 °C水浴中孵育30分钟。按1:30比例用蒸馏水稀释洗涤液。揭去封板膜，甩尽孔内液体，在吸水纸上拍干，每孔加入350 µL洗涤液，静置30秒。重复该洗涤步骤五次，最后拍干孔内液体。
    5. 除空白孔外，每孔加入50 µL酶标试剂，37 °C水浴孵育30分钟。揭去封板膜，甩尽孔内液体，在吸水纸上拍干。
    6. 每孔依次加入50 µL显色剂A和50 µL显色剂B，轻轻震荡混匀，室温避光反应5分钟。每孔加入50 µL终止液，终止反应15分钟。使用酶标仪在450 nm波长下测定各孔吸光度（OD）。TgAb数据以490 nm处的光密度（OD）值表示。
  5. 甲状腺素（T4）和促甲状腺激素（TSH）的检测
    注：按照试剂盒说明书使用ELISA法检测T4和TSH水平（取样量为10 µL）。
    1. 用检测稀释液将酶结合物稀释至1:11；使用0.01 M PBS将待测样本稀释至1:100。
    2. 向相应孔中加入10 µL标准品和样本，每孔再加入100 µL酶结合物，室温孵育1小时。
    3. 弃去孔内液体，用洗涤液清洗三次。
    4. 每孔加入100 µL 3,3',5,5'-四甲基联苯胺（TMB），室温孵育15分钟。
    5. 每孔加入50 µL终止液，轻轻混匀15–20秒。
    6. 使用酶标仪在450 nm波长下测定吸光度（OD），并计算样本浓度。
    7. 使用统计软件进行t检验或秩和检验，并绘制结果图表。

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结果

雌性和雄性小鼠的组织学变化存在显著差异，且与碘摄入持续时间及NaI溶液浓度有关。如图1所示，约10%的NOD.H-2h4小鼠在未进行碘诱导的情况下，于24周龄时即自发发展为SAT，且所有小鼠最终均出现甲状腺炎。当饮用普通水时，雄性和雌性小鼠之间的组织学变化无显著差异。在饮水中添加NaI可加速甲状腺炎的发展。在0.005%、0.05%和0.5%的NaI溶液中，分别于给予含NaI水后第16周、第8周和第8周达到SAT最严重程度。一旦甲状腺炎被诱导，淋巴细胞浸润将持续存在于小鼠整个生命周期。在诱导过程中，在相同条件下，雌性小鼠似乎比雄性小鼠更易发展为更严重的甲状腺炎，但淋巴细胞浸润程度之间并无显著差异，这可能受限于样本数量。

当给予不含额外碘的普通水时，16周龄时TgAb水平未显著升高，且雄性和雌性之间无显著差异。NOD.H-2h4小鼠的TgAb水平从24周龄开始上升，且无性别差异，TgAb水平持续上升至72周龄（图2A）。在饮水中添加NaI后，使用0.005%、0.0...

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讨论

桥本甲状腺炎（HT）是由于淋巴细胞浸润甲状腺，引发自身免疫系统紊乱，导致甲状腺功能进一步受损，并产生甲状腺特异性抗体所致。HT患者的血清TSH、TgAb和TPOAb水平显著升高27目前，研究自身免疫性甲状腺炎病因的两种主要小鼠模型被广泛使用：EAT 和 SAT29EAT 小鼠主要通过使用蛋白质和佐剂进行免疫，以建立异常的免疫环境 体内该方法已使用多年，至今仍然有效30,31此外，诱导甲状腺炎的新方法还包括注射经甲状腺球蛋白（Tg）脉冲致敏的树突状细胞（DCs）32，Tg 或 TPO 的表达 体内 通过腺病毒载体或质粒31，移植同种异体小鼠的甲状腺组织，并注射LPS。然而，甲状腺炎模型的成功构建通常受到实验小鼠模型的遗传背景、同源抗原及细胞生物学技术的更多限制。此外，特定佐剂可能诱导更为复杂的免疫环...

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披露

所有作者均声明不存在任何竞争利益。

致谢

用于作为阳性对照的抗人TPO的小鼠单克隆抗体由法国马赛的P. Carayon博士和J. Ruf博士提供。作者感谢本研究的所有参与者以及研究团队的成员。本工作部分得到了中国四川大学华西医院博士后培养基金（2020HXBH057）和四川省科技支撑计划（项目编号：2021YFS0166）的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
酒石酸布托啡诺SupelcoL-044 
盐酸右美托咪定 Sigma-Aldrich145108-58-3
酶联免疫吸附测定（ELISA）板孔Sigma-AldrichM9410-1CS
乙醇macklin64-17-5 
完全弗氏佐剂’s Adjuvant, Complete Sigma-AldrichF5881 
不完全弗氏佐剂’s Adjuvant, Incomplete Sigma-AldrichF5506
山羊抗小鼠IgG invitrogenSA5-10275 
咪达唑仑溶液 SupelcoM-908 
小鼠/大鼠甲状腺素（T4）ELISACalbiotechDKO045
多聚甲醛macklin30525-89-4 
碘化丙啶Sigma-AldrichP4864
碘化钠Sigma-Aldrich 7681-82-5
甲状腺球蛋白Sigma-Aldrich T1126
甲状腺球蛋白  ELISA试剂盒Thermo ScientificEHTGX5
TSH ELISACalbiotechDKO200
二甲苯macklin1330-20-7

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重印与许可

勘误


Formal Correction: Erratum: Generation of a Mouse Spontaneous Autoimmune Thyroiditis Model
Posted by JoVE Editors on 6/05/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: Generation of a Mouse Spontaneous Autoimmune Thyroiditis Model. The Protocol section was updated.

Step 3.1.1 of the Protocol was updated from:

After the induction, anesthetize the mice with a volume of 0.01 mL/g anesthetic by intraperitoneal injection. Prepare the anesthetic by mixing midazolam (40 µg/100 µL for sedation), medetomidine (7.5 µg/100 µL for sedation), and butorphanol tartrate (50 µg/100 µL for analgesia) in phosphate-buffered saline (PBS).

to

After the induction, anesthetize the mice with a volume of 0.01 mL/g anesthetic by intraperitoneal injection. Prepare the anesthetic by mixing midazolam (40 µg/100 µL for sedation), medetomidine (7.5 µg/100 µL for sedation), and butorphanol tartrate (50 µg/100 µL for analgesia) in phosphate-buffered saline (PBS).
NOTE: The specific concentrations of each component in the anesthesia mixture are: midazolam 13.33µg/100µL, medetomidine 2.5µg/100µL, and butorphanol 16.7µg/100µL. For specific dosages used in mice, the doses are: midazolam 4µg/g, medetomidine 0.75µg/g, and butorphanol 1.67µg/g. Anesthesia depth was confirmed when the mouse's limb muscles relaxed, the whiskers had no touch response, and there was loss of  pedal reflex.

Step 3.1.2 of the Protocol was updated from:

After the mice are anesthetized, cut off their whiskers with ophthalmic scissors to prevent blood from flowing down the whiskers and causing hemolysis. Fix the mouse with one hand and press the skin of the eye to make the eyeball protrude. Quickly remove the eyeball and draw 1 mL of blood into the microcentrifuge tube via a capillary tube.

to

After the mice are anesthetized, prepare the peripheral blood samples, by fixing the mouse with one hand and pressing the eye skin to protrude the eyeball. Then, insert the capillary tube into the inner corner of the eye and penetrate at a 30-45 degree angle to the plane of the nostril. Apply pressure while gently rotating the capillary tube. Blood will flow into the tube via capillary action.

Step 3.2.1 of the Protocol was updated from:

Dissect the chest wall to expose the heart, cut open the right atrium, and infuse saline into the left ventricle by an intravenous infusion needle attached to a 20 mL syringe until the tissue turns white.

to

Humanely euthanize the animal according to the institutional policies. Then, dissect the chest wall to expose the heart, cut open the right atrium, and infuse saline into the left ventricle by an intravenous infusion needle attached to a 20 mL syringe until the tissue turns white.

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