本方案描述了将患者来源的癌细胞原位植入免疫缺陷小鼠盲肠壁的操作。该模型可重现晚期结直肠癌的转移性疾病，能够在具有临床相关性的肺转移和肝转移场景中评估新型治疗药物。
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本文内容
摘要
摘要
近十年来，研究人员利用患者来源的癌细胞和三维肿瘤类器官建立了更为复杂的结直肠癌（CRC）临床前模型。由于患者来源的肿瘤类器官能够保留原始肿瘤的特征，这些可靠的临床前模型可用于抗癌药物筛选以及药物耐药机制的研究。然而，结直肠癌患者的死亡大多与转移性疾病的存在相关。因此，至关重要的是在能够真实再现人类癌症转移关键分子特征的相关体内模型中评估抗癌疗法的疗效。我们建立了一种原位模型，即将结直肠癌患者来源的癌细胞直接注射到小鼠盲肠壁中。这些肿瘤细胞在盲肠内形成原发性肿瘤，并转移至肝脏和肺部，这与晚期结直肠癌患者的临床表现高度一致。该结直肠癌小鼠模型可用于评估药物反应，通过微计算机断层扫描（µCT）进行监测。µCT是一种具有临床相关性的小型成像方法，可轻松识别患者体内的原发性肿瘤或转移灶。本文中，我们详细描述了将患者来源的癌细胞植入免疫缺陷小鼠盲肠壁所需的手术操作及相关实验方法。
引言
结直肠癌（CRC）是全球癌症死亡的第二大原因1生成能力 体外 或 体内 源自个体患者肿瘤细胞的肿瘤模型推动了肿瘤学领域精准医学的发展。在过去十年中，全球许多研究团队已广泛使用患者来源类器官（PDOs）或患者来源异种移植模型（PDXs）2类器官是多细胞结构 体外 类似于原始肿瘤组织特征的结构，能够自我组装和自我更新3这些有希望的 体外 模型可成功用于药物筛选并促进转化研究。另一方面，PDX模型在所有相关层面均能真实再现原始结直肠癌的特征，从组织病理学到分子特性及药物反应。2,4.
体内 患者来源的异种移植（PDX）模型通常在免疫缺陷小鼠中以皮下肿瘤形式生长。通过这种方法，PDX模型已成为癌症研究的金标准，尤其适用于研究药物敏感性或耐药性。然而，结直肠癌（CRC）相关死亡主要与肝脏、肺部或腹膜腔中转移病灶的存在有关，而目前的两种模型（PDO 或 PDX）均无法重现晚期临床状态。此外，已有研究表明，肿瘤生长的特定部位决定了影响药物疗效和疾病预后的关键生物学特征
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方案
已从所有患者处获得书面知情同意。本项目已获得西班牙巴塞罗那瓦尔德布伦大学医院研究伦理委员会批准（批准编号：PR(IR)79/2009 PR(AG)114/2014, PR(AG)18/2018）。人结肠组织样本来自结肠癌和直肠癌患者原发性腺癌或肝转移灶的非坏死区域活检组织，这些患者均接受了肿瘤切除手术。动物实验遵循欧盟动物护理指令（86/609/EEC），并经瓦尔德布伦研究所（VHIR）动物实验伦理委员会批准（编号：40/08 CEEA、47/08/10 CEEA 和 12/18 CEEA）。
注意：8周龄的雌性NOD-SCID（NOD.CB17-Prkdcscid/NcrCrl）小鼠购自查尔斯河实验室（Charles River Laboratories）。
1. 患者细胞的获取
- 肿瘤提取
注意：以下操作在动物实验室内于室温（RT）下的生物安全柜中进行。- 从患者的手术或活检样本以及在小鼠皮下生长的PDX模型中获取肿瘤样本。
- 进行原位注射时，应使用已建立的皮下PDX肿瘤模型制备肿瘤细胞，而非直接使用患者来源的组织9。
- 通过将含有1 × 105个肿瘤细胞的磷酸盐缓冲液（PBS）（50 µL）与Matrigel基质（5....
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结果
每周对原位植入患者来源癌细胞的小鼠进行监测 µCT扫描。实验结束时，对动物实施安乐死。取出肠道、盲肠（图 1AB肝脏、肺部 同时收集了任何其他可能的病变组织，将其包埋于包埋盒中，并使用4%甲醛固定过夜。以盲肠无肿瘤的小鼠肠道组织作为对照。图 1C）。最后，将组织盒更换至70%乙醇中至少3小时，并进行石蜡包埋。苏木精和伊红（H&E) 使用组织病理学设施标准方案对盲肠、肝脏和肺部进行染色以鉴定肿瘤细胞图 2, 图 3以及 图 4).
在另一项实验中，研究人员每周对携带原位肿瘤的小鼠进行监测。当肿瘤 µ在大多数小鼠中检测到CT扫描信号后（约2-4周，具体取决于PDX模型），将动物随机分为四.......
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讨论
近几十年来，许多新型抗癌疗法已在不同类型肿瘤（包括结直肠癌（CRC））的患者中进行了开发和测试。尽管在许多情况下，临床前模型中已观察到令人鼓舞的结果，但这些疗法在晚期转移性结直肠癌患者中的治疗效果却常常有限。因此，迫切需要建立能够在临床相关的转移性场景下评估新型治疗药物疗效的临床前模型。
该论文详细描述了一种基于将患者肿瘤细胞植入免疫缺陷小鼠盲肠壁的先进结直肠癌原位患者来源异种移植模型12。
该方法耗时较长，且对注意力集中程度要求较高。平均而言，包含30只小鼠的实验注射过程总共可能需要约11小时，其中包括：1）PDX肿瘤组织采集（1小时）；肿瘤处理（4小时）；以及盲肠植入（6小时）。操作必须在无菌条件下进行，尽量缩短肿瘤处理和注射的时间，同时需非常小心地操作内脏器官，以避免手术相关死亡。因此，强烈建议先使用肿瘤细胞系或PDX细胞进行多次预实验，以培训研究人员并使其熟悉操作流程。此外，该过程必须由两名研究人员共同参与，一人负责肿瘤的采集与处理，并协助动物缝合，另一人负责实施手术操作.......
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致谢
我们感谢Cellex基金会、CIBERONC网络以及Carlos III健康研究所提供的支持。此外，我们还要感谢在瓦尔德希布伦研究与创新研究所（VHIR）的临床前影像平台进行实验工作。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 试剂 | |||
| 脱铁转铁蛋白 | MERCK LIFE SCIENCE S.L.U. | T1147-500MG | |
| B27添加剂 | Life Technologies S.A (西班牙) | 17504044 | |
| 2%氯己定水溶液 | DH MATERIAL MÉDICO, S.L. | 1111696250 | |
| 胶原酶 | MERCK LIFE SCIENCE S.L.U. | C0130-500MG | |
| D-(+)-葡萄糖 | MERCK LIFE SCIENCE S.L.U. | G6152 | |
| DMEM /F12 | LIFE TECHNOLOGIES S.A. | 21331-020 | |
| DNase I | MERCK LIFE SCIENCE S.L.U. | D4263-5VL | |
| EGF | PEPRO TECH EC LTD. | AF-100-15-500 µg | |
| 基础FGF | PEPRO TECH EC LTD. | 100-18B | |
| 两性霉素B | Life Technologies S.A (西班牙) | 15290026 | |
| 庆大霉素 | LIFE TECHNOLOGIES S.A. | 15750037 | |
| 肝素钠盐 | MERCK LIFE SCIENCE S.L.U. | H4784-250MG | |
| 胰岛素 | MERCK LIFE SCIENCE S.L.U. | I9278-5ML | |
| 碘帕醇 | |||
| 异氟烷 | - | - | |
| 卡那霉素 | LIFE TECHNOLOGIES S.A. | 15160047 | |
| L-谷氨酰胺 | LIFE TECHNOLOGIES S.A. | 25030032 | |
| Matrigel基质 | CULTEK, S.L.U. | 356235/356234/354234 | |
| 美卡曲辛（5 mg/mL） | - | - | |
| 非必需氨基酸 | LIFE TECHNOLOGIES S.A. | 11140035 | |
| 制霉菌素 | MERCK LIFE SCIENCE S.L.U. | N4014-50MG | |
| 青霉素-链霉素溶液（Pen/Strep） | Life Technologies S.A (西班牙) | 15140122 | |
| 磷酸盐缓冲液（PBS），无菌 | Labclinics S.A | L0615-500 | |
| 孕酮 | MERCK LIFE SCIENCE S.L.U. | P0130-25G | |
| 腐胺 | MERCK LIFE SCIENCE S.L.U. | P5780-5G | |
| 红细胞裂解缓冲液 | Labclinics S.A | 00-4333-57 | |
| 丙酮酸钠 | LIFE TECHNOLOGIES S.A. | 11360039 | |
| 亚硒酸钠 | MERCK LIFE SCIENCE S.L.U. | S5261-25G | |
| 必需耗材 | |||
| 8周龄NOD.CB17-Prkdcscid/NcrCrl小鼠 | - | - | |
| BD Micro-Fine 0.5 ml U 100 针头 0.33 mm (29G) x 12.7 mm | BECTON DICKINSON, S.A.U. | 320926 | |
| 24号刀片 | - | - | |
| 100 µm 细胞筛 | Cultek, SLU | 45352360 | |
| 镊子和手术剪 | - | - | |
| 加热垫 | - | - | |
| 眼用凝胶 Lacryvisc（3 mg/g） | - | - | |
| Surfasafe | - | - | |
| PROLENE 5-0 缝线 | JOHNSON&JOHNSON S, A. | 8720H | |
| 仪器/软件 | |||
| Quantum FX µCT 成像系统 | Perkin Elmer | Perkin Elmer | http://www.perkinelmer.com/es/product/quantum-gx-instrument-120-240-cls140083 |
参考文献
- Sung, H., et al. Global Cancer Statistics 2020: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA: a Cancer Journal for Clinicians. 71 (3), 209-249 (2021).
- Puig, I., et al.
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重印与许可
