需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用

方法文章

原位移植患者来源的癌细胞可模拟晚期结直肠癌

3.4K 次观看

⸱

DOI：

10.3791/64629

⸱

2023年2月10日

 ,  ,  , 
1Stem Cells and Cancer Laboratory, Vall d’Hebron Institute of Oncology (VHIO), 2Preclinical Therapeutics Core, University of California San Francisco, 3CIBERONC

本文内容

摘要

本方案描述了将患者来源的癌细胞原位植入免疫缺陷小鼠盲肠壁的操作。该模型可重现晚期结直肠癌的转移性疾病，能够在具有临床相关性的肺转移和肝转移场景中评估新型治疗药物。

摘要

近十年来，研究人员利用患者来源的癌细胞和三维肿瘤类器官建立了更为复杂的结直肠癌（CRC）临床前模型。由于患者来源的肿瘤类器官能够保留原始肿瘤的特征，这些可靠的临床前模型可用于抗癌药物筛选以及药物耐药机制的研究。然而，结直肠癌患者的死亡大多与转移性疾病的存在相关。因此，至关重要的是在能够真实再现人类癌症转移关键分子特征的相关体内模型中评估抗癌疗法的疗效。我们建立了一种原位模型，即将结直肠癌患者来源的癌细胞直接注射到小鼠盲肠壁中。这些肿瘤细胞在盲肠内形成原发性肿瘤，并转移至肝脏和肺部，这与晚期结直肠癌患者的临床表现高度一致。该结直肠癌小鼠模型可用于评估药物反应，通过微计算机断层扫描（µCT）进行监测。µCT是一种具有临床相关性的小型成像方法，可轻松识别患者体内的原发性肿瘤或转移灶。本文中，我们详细描述了将患者来源的癌细胞植入免疫缺陷小鼠盲肠壁所需的手术操作及相关实验方法。

引言

结直肠癌（CRC）是全球癌症死亡的第二大原因1生成能力 体外 或 体内 源自个体患者肿瘤细胞的肿瘤模型推动了肿瘤学领域精准医学的发展。在过去十年中，全球许多研究团队已广泛使用患者来源类器官（PDOs）或患者来源异种移植模型（PDXs）2类器官是多细胞结构 体外 类似于原始肿瘤组织特征的结构，能够自我组装和自我更新3这些有希望的 体外 模型可成功用于药物筛选并促进转化研究。另一方面，PDX模型在所有相关层面均能真实再现原始结直肠癌的特征，从组织病理学到分子特性及药物反应。2,4.

体内 患者来源的异种移植（PDX）模型通常在免疫缺陷小鼠中以皮下肿瘤形式生长。通过这种方法，PDX模型已成为癌症研究的金标准，尤其适用于研究药物敏感性或耐药性。然而，结直肠癌（CRC）相关死亡主要与肝脏、肺部或腹膜腔中转移病灶的存在有关，而目前的两种模型（PDO 或 PDX）均无法重现晚期临床状态。此外，已有研究表明，肿瘤生长的特定部位决定了影响药物疗效和疾病预后的关键生物学特征2。因此，迫切需要建立可在临床相关的转移环境下评估抗癌药物疗效的临床前模型6。

微型计算机断层扫描（µCT）成像仪可作为缩小版的临床CT扫描仪，能够在小鼠体内以与癌症患者CT图像成比例的图像分辨率，实现原发性肿瘤和转移灶的成像7。为了弥补µCT技术在软组织对比度方面的不足，可使用含碘的放射性造影剂来增强对比效果，从而评估肿瘤负荷。采用双对比剂方法时，口服和腹腔注射的碘造影剂在不同时间点给予。口服给予的造影剂有助于界定肠道内肿瘤组织与盲肠内容物之间的边界。 另一方面，腹腔注射的造影剂则有助于识别肿瘤团块的外部边界，因为肿瘤常会生长并侵入腹膜8。

本文描述了一种在免疫缺陷小鼠盲肠壁进行患者来源癌细胞原位移植的实验方案，以及利用µCT扫描监测肠道肿瘤生长的方法。本研究表明，该模型能够模拟结直肠癌患者中晚期肠道肿瘤及转移性疾病的临床情况，而此类情况无法通过PDO或PDXO模型进行研究。由于结直肠癌的原位PDX模型能够重现结直肠癌患者的临床特征，我们得出结论：迄今为止，该模型是评估抗肿瘤药物对中晚期肠道肿瘤及转移性疾病疗效的最佳模型。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

方案

已从所有患者处获得书面知情同意。本项目已获得西班牙巴塞罗那瓦尔德布伦大学医院研究伦理委员会批准（批准编号：PR(IR)79/2009 PR(AG)114/2014, PR(AG)18/2018）。人结肠组织样本来自结肠癌和直肠癌患者原发性腺癌或肝转移灶的非坏死区域活检组织，这些患者均接受了肿瘤切除手术。动物实验遵循欧盟动物护理指令（86/609/EEC），并经瓦尔德布伦研究所（VHIR）动物实验伦理委员会批准（编号：40/08 CEEA、47/08/10 CEEA 和 12/18 CEEA）。

注意：8周龄的雌性NOD-SCID（NOD.CB17-Prkdcscid/NcrCrl）小鼠购自查尔斯河实验室（Charles River Laboratories）。

1. 患者细胞的获取

  1. 肿瘤提取
    注意：以下操作在动物实验室内于室温（RT）下的生物安全柜中进行。
    1. 从患者的手术或活检样本以及在小鼠皮下生长的PDX模型中获取肿瘤样本。
    2. 进行原位注射时，应使用已建立的皮下PDX肿瘤模型制备肿瘤细胞，而非直接使用患者来源的组织9。
    3. 通过将含有1 × 105个肿瘤细胞的磷酸盐缓冲液（PBS）（50 µL）与Matrigel基质（50 µL）混合后，皮下接种至NOD-SCID小鼠 flank 部位以生成PDX肿瘤2。
      1. 每隔一天使用游标卡尺测量肿瘤生长情况。
        注意：重要的是，本实验室已建立包含350多个PDX模型的生物样本库。本方案中使用的结直肠癌PDX（CRC-PDX）模型均为实验室中已建立的PDX模型，已在小鼠体内传代超过三代，并通过了纳入/排除标准且结果为阳性（表1）。
    4. 当皮下肿瘤达到动物伦理委员会（CEEA）规定的最大尺寸（直径1 cm），或动物达到实验终点标准时，采用颈椎脱臼法处死小鼠。
    5. 使用剪刀和镊子将肿瘤完整取出，并仔细剥离周围皮肤及非肿瘤组织。
    6. 将收获的肿瘤置于4 °C的PBS中保存，直至进行下一步操作。
      注意：应在肿瘤从患者病灶或小鼠皮下异种移植部位取出后尽快将其消化为单细胞悬液。组织离体24小时后细胞活力显著下降，将导致受体小鼠中移植效率降低。
  2. 细胞制备
    注意：以下操作在组织培养室内的生物安全柜中于室温（RT）下进行。
    1. 在10 cm培养皿中加入1 mL完全CoCSCM 6Ab培养基（表2），用刀片将肿瘤组织剪碎（有助于更易切碎组织）。将均质化的组织转移至15 mL锥形管中。
    2. 加入完全CoCSCM 6Ab培养基至终体积5 mL（同一管中加入的组织悬液不超过3 mL）。
      注意：患者来源的原发性结直肠癌组织天然可能被细菌和真菌污染。必须使用六种抗生素混合液（青霉素、链霉素、制霉菌素、卡那霉素、庆大霉素和两性霉素B）去除原始患者样本中的病原体。将含有细菌污染的肿瘤细胞注射入免疫缺陷小鼠可能导致动物死亡。
    3. 加入50 µL DNase I（0.08 kU/mL）和50 µL胶原酶（1.5 mg/mL）（消化液；表2），在细胞培养箱中37 °C、45°倾斜位置孵育1小时。孵育前用5 mL移液器充分混匀溶液，并每隔15分钟混匀一次。
      注意：需通过反复吹打实现肿瘤组织的解离和消化，以获得单细胞悬液。这对于注射前准确计数细胞、实现受体小鼠中肿瘤细胞的均一植入至关重要。
    4. 加入5 mL完全CoCSCM 6Ab培养基，用5 mL移液器充分混匀。
    5. 使用100 µm细胞筛网过滤溶液，收集至新的无菌50 mL离心管中。
    6. 在室温下以500 × g 离心8分钟。
    7. 吸除上清液。
    8. 将沉淀重悬于3 mL 1×红细胞裂解缓冲液中。
    9. 室温孵育10分钟。
    10. 加入3 mL完全CoCSCM 6Ab培养基，吹打混匀后在室温下以500 × g 离心10分钟，吸除上清液。
    11. 用5–10 mL完全CoCSCM 6Ab培养基重悬细胞沉淀，使用细胞计数仪测定总细胞数。
    12. 在室温下以500 × g 离心10分钟，弃上清后将细胞重悬于10 mL PBS中。
    13. 调整细胞浓度至20 × 106 个细胞/mL，充分混匀以获得均一的细胞悬液。
    14. 在组织培养室中准备29 G注射器（0.5 mL U 100针头，0.33 mm [29 G] × 12.7 mm），用于盲肠注射（每只小鼠一支注射器）。向注射器中加入50 µL肿瘤细胞悬液（每针含1 × 106 个细胞），并置于冰上保存。确保细胞悬液中无气泡。
      注意：将肿瘤细胞装入注射器时必须排除气泡，以避免向盲肠壁注入过量体积，导致组织破裂和样本丢失。装液时必须充分混匀细胞悬液，以防止同一批实验中小鼠间肿瘤大小不均一。

2. 盲肠原位注射

注意：以下操作在动物设施的特定病原体阴性（SPF）房间内的实验台上进行。所使用的设备此前已清洁并灭菌。此外，在动物设施的不同个体或区域之间操作时，设备还需在便携式灭菌器中再次灭菌。

  1. 用消毒清洁剂喷洒并擦拭，清洁手术部位。
  2. 使用小鼠脱毛仪去除小鼠腹部毛发。
  3. 将小鼠置于仰卧位。使用 2% 异氟烷对动物进行麻醉。通过轻轻捏压四肢并观察是否无反应来确认麻醉效果。
  4. 在小鼠眼睛中放置 50–100 µL 兽用眼膏（3 mg/g Lacryvisc），以防止麻醉期间角膜干燥。
  5. 用氯己定或聚维酮碘以环形方式多次擦拭小鼠腹部，进行消毒。
  6. 使用手术剪在下腹部做一条长约 1 cm 的纵向切口。小心将皮肤向两侧分离，暴露皮下腹膜。
  7. 在腹膜上做一条 0.5–1 cm 的切口，大小足以使盲肠外置。
    注意：将盲肠外置时应避免过度操作内脏器官，否则会显著增加手术致死率。
  8. 使用预先裁剪好的无菌纱布小心地将盲肠与小鼠组织分离。
  9. 在整个操作过程中，用生理盐水保持盲肠湿润。
  10. 用镊子小心夹住盲肠以固定，将针头浅表刺入盲肠壁。避免在毛细血管或血管处注射。排除细胞悬液中的气泡。
  11. 缓慢注入全部 50 µL 肿瘤细胞悬液，通常耗时约 10 秒。避免针头穿破盲肠腔，否则会导致肿瘤细胞悬液通过肠蠕动被排出体外。
    注意：将肿瘤细胞悬液注射至小鼠盲肠是整个操作中最困难的步骤。建议在此步骤中使用聚焦强光照明并配合放大镜。进针时应与盲肠表面平行。盲肠组织非常脆弱，因此必须使用手术镊轻轻夹持固定，施加轻柔压力，避免组织破裂导致出血。成功植入的标志是在盲肠壁形成一个白色小泡（细胞团块）。若无法观察到该小泡，可能提示盲肠已被穿破，细胞已进入盲肠腔，随后将被肠道清除。
  12. 注射后，缓慢将针头从盲肠拔出，并用棉签轻压注射部位，防止肿瘤细胞外漏并减少轻微出血。
  13. 用生理盐水清洗盲肠，去除任何残留物。
  14. 将盲肠放回动物腹腔内。
  15. 使用 5/0 缝线缝合腹膜。
  16. 使用 5/0 缝线缝合腹部皮肤。
  17. 通过皮下注射给予术后抗生素（100 mg/kg 阿莫西林或 20 mg/kg 恩诺沙星）和镇痛剂（5 mg/mL Metacam/美洛昔康）。将小鼠置于加热垫上，直至其完全恢复意识，然后将其放回与其他动物同笼的饲养盒中。

3. 使用µCT扫描评估原位肿瘤生长

注意：以下操作在动物设施的临床前成像平台（PIP）中进行。

  1. 所有动物实验操作均须遵循机构伦理委员会的相关规定。
  2. 细胞注射后2周开始通过显微计算机断层扫描（µCT）监测肿瘤体积，此后每周进行一次。
  3. 将造影剂碘帕醇（iopamiro，300 mg/mL）用生理盐水新鲜稀释，两种剂量均按3:1比例稀释。通过灌胃给予300 mL碘帕醇。
    注：由于µCT对软组织对比度较差，建议使用造影剂以提高技术的灵敏度。本方案包括口服碘基造影剂（iopamiro）以界定肠腔内肿瘤负荷，以及二次腹腔注射相同造影剂以明确肠道内脏面的肿瘤负荷。前期已开展预实验，确定造影剂到达小鼠盲肠并在排泄前所需的确切时间。对于iopamiro，该时间为约2小时。
  4. 2小时后，腹腔注射300 mL预先稀释的iopamiro。该步骤有助于界定肿瘤在腹壁面的边界。
  5. 使用2%异氟烷对动物进行麻醉。
  6. 通过轻捏小鼠足部确认动物已充分麻醉后，将其置于µCT扫描床中。最佳体位为仰卧位（面部朝上）。
  7. 在控制软件中启动实时模式（透视模式），将腹部区域置于扫描仪的视野（FOV）内。通过前后及侧向移动扫描床，直至达到理想位置。将X射线管和探测器旋转90°，并在y轴方向移动扫描床，使动物完全居中。
  8. 使用以下参数进行µCT扫描成像：30 mm视野（FOV），采集时间26秒，管电压90 kV，电流200 µA，采用FX µCT成像系统。
  9. 扫描结束后将动物放回笼中恢复。提供保温支持，并在送回饲养环境前持续监测动物直至其从麻醉中恢复。
  10. 每次µCT扫描生成的数据文件大小约为250 Mb，文件格式为VOX。为使各类影像分析软件均可读取，需使用µCT系统的数据库管理软件将文件转换为DICOM格式。将生成的文件批次存储于便携式硬盘，以便在配备影像分析软件的任意计算机上进行分析。
    注：在图像分析过程中，盲肠通常表现为含有高密度造影剂（iopamiro）的扩张肠段，多位于尾腹部左侧。在盲肠的内脏弯曲处可见肠壁增厚，与邻近肠段相比更为明显，该增厚区域即为肿瘤生长部位。
  11. 确定肿瘤位置后，在不同切面（轴向、冠状和矢状面）寻找最大直径。测量这三个轴的长度，并按照椭球公式计算肿瘤体积：体积 = 4/3π × (x半轴 × y半轴 × z半轴)10。

4. 对荷原位肿瘤小鼠的治疗干预

  1. 每周监测荷原位肿瘤的小鼠。
  2. 当大多数小鼠中检测到肿瘤的µCT扫描信号时，于次周再次进行µCT扫描以确认肿瘤的存在。
    注意：开始治疗的时间取决于所使用的PDX模型，通常在盲肠接种肿瘤细胞后3–12周之间。
  3. 将小鼠随机分为四组：对照溶剂组（n = 10–15只小鼠）、待测药物组（n = 10–15只小鼠）、标准护理化疗组（n = 10–15只小鼠）以及联合治疗组（n = 10–15只小鼠）。
  4. 通过腹腔注射方式给予小鼠生理盐水（对照溶剂组）、待测药物（20 mg/kg）（待测药物组）、伊立替康（50 mg/kg）（标准护理组），或待测药物（20 mg/kg）联合伊立替康（50 mg/kg）（联合治疗组）。给药频率为每周一次，持续至实验结束。
  5. 在整个实验过程中，每周通过µCT扫描监测肿瘤生长情况。
  6. 实验结束时，采用颈椎脱臼法处死小鼠，并采集肝脏、肺脏及其他可能受累器官中的病灶组织。
  7. 将组织样本放入包埋盒中，用4%甲醛固定液浸泡过夜。以盲肠无肿瘤的小鼠肠道组织作为对照。
  8. 从甲醛中取出包埋盒，用70%乙醇浸泡至少3小时。
  9. 按照组织病理学实验室的标准操作流程，将包埋盒中的组织进行石蜡包埋。
  10. 按照组织病理学实验室的标准操作流程，对盲肠、肝脏和肺组织进行苏木精-伊红（H&E）染色。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

结果

每周对原位植入患者来源癌细胞的小鼠进行监测 µCT扫描。实验结束时，对动物实施安乐死。取出肠道、盲肠（图 1AB肝脏、肺部 同时收集了任何其他可能的病变组织，将其包埋于包埋盒中，并使用4%甲醛固定过夜。以盲肠无肿瘤的小鼠肠道组织作为对照。图 1C）。最后，将组织盒更换至70%乙醇中至少3小时，并进行石蜡包埋。苏木精和伊红（H&E) 使用组织病理学设施标准方案对盲肠、肝脏和肺部进行染色以鉴定肿瘤细胞图 2, 图 3以及 图 4).

在另一项实验中，研究人员每周对携带原位肿瘤的小鼠进行监测。当肿瘤 µ在大多数小鼠中检测到CT扫描信号后（约2-4周，具体取决于PDX模型），将动物随机分为四...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

讨论

近几十年来，许多新型抗癌疗法已在不同类型肿瘤（包括结直肠癌（CRC））的患者中进行了开发和测试。尽管在许多情况下，临床前模型中已观察到令人鼓舞的结果，但这些疗法在晚期转移性结直肠癌患者中的治疗效果却常常有限。因此，迫切需要建立能够在临床相关的转移性场景下评估新型治疗药物疗效的临床前模型。

该论文详细描述了一种基于将患者肿瘤细胞植入免疫缺陷小鼠盲肠壁的先进结直肠癌原位患者来源异种移植模型12。

该方法耗时较长，且对注意力集中程度要求较高。平均而言，包含30只小鼠的实验注射过程总共可能需要约11小时，其中包括：1）PDX肿瘤组织采集（1小时）；肿瘤处理（4小时）；以及盲肠植入（6小时）。操作必须在无菌条件下进行，尽量缩短肿瘤处理和注射的时间，同时需非常小心地操作内脏器官，以避免手术相关死亡。因此，强烈建议先使用肿瘤细胞系或PDX细胞进行多次预实验，以培训研究人员并使其熟悉操作流程。此外，该过程必须由两名研究人员共同参与，一人负责肿瘤的采集与处理，并协助动物缝合，另一人负责实施手术操作...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

致谢

我们感谢Cellex基金会、CIBERONC网络以及Carlos III健康研究所提供的支持。此外，我们还要感谢在瓦尔德希布伦研究与创新研究所（VHIR）的临床前影像平台进行实验工作。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
试剂
脱铁转铁蛋白MERCK LIFE SCIENCE S.L.U.T1147-500MG
B27添加剂Life Technologies S.A (西班牙)17504044
2%氯己定水溶液DH MATERIAL MÉDICO, S.L.1111696250
胶原酶MERCK LIFE SCIENCE S.L.U.C0130-500MG
D-(+)-葡萄糖MERCK LIFE SCIENCE S.L.U.G6152
DMEM /F12 LIFE TECHNOLOGIES S.A.21331-020
DNase I  MERCK LIFE SCIENCE S.L.U.D4263-5VL
EGFPEPRO TECH EC LTD.AF-100-15-500 µg
基础FGFPEPRO TECH EC LTD.100-18B
两性霉素BLife Technologies S.A (西班牙)15290026
庆大霉素LIFE TECHNOLOGIES S.A.15750037
肝素钠盐MERCK LIFE SCIENCE S.L.U.H4784-250MG
胰岛素MERCK LIFE SCIENCE S.L.U.I9278-5ML
碘帕醇
异氟烷 --
卡那霉素LIFE TECHNOLOGIES S.A.15160047
L-谷氨酰胺LIFE TECHNOLOGIES S.A.25030032
Matrigel基质CULTEK, S.L.U.356235/356234/354234
美卡曲辛（5 mg/mL）--
非必需氨基酸LIFE TECHNOLOGIES S.A.11140035
制霉菌素MERCK LIFE SCIENCE S.L.U.N4014-50MG
青霉素-链霉素溶液（Pen/Strep）Life Technologies S.A (西班牙)15140122
磷酸盐缓冲液（PBS），无菌Labclinics S.AL0615-500
孕酮MERCK LIFE SCIENCE S.L.U.P0130-25G
腐胺MERCK LIFE SCIENCE S.L.U.P5780-5G
红细胞裂解缓冲液 Labclinics S.A00-4333-57
丙酮酸钠LIFE TECHNOLOGIES S.A.11360039
亚硒酸钠MERCK LIFE SCIENCE S.L.U.S5261-25G
必需耗材
8周龄NOD.CB17-Prkdcscid/NcrCrl小鼠--
BD Micro-Fine 0.5 ml U 100 针头 0.33 mm (29G) x 12.7 mm BECTON DICKINSON, S.A.U.320926
24号刀片--
100 µm 细胞筛Cultek, SLU45352360
镊子和手术剪--
加热垫--
眼用凝胶 Lacryvisc（3 mg/g）--
Surfasafe--
PROLENE 5-0 缝线 JOHNSON&JOHNSON S, A.8720H
仪器/软件
Quantum FX µCT 成像系统Perkin ElmerPerkin Elmerhttp://www.perkinelmer.com/es/product/quantum-gx-instrument-120-240-cls140083

参考文献

  1. Sung, H., et al. Global Cancer Statistics 2020: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA: a Cancer Journal for Clinicians. 71 (3), 209-249 (2021).
  2. Puig, I., et al. A personalized preclinical model to evaluate the metastatic potential of patient-derived colon cancer initiating cells. Clinical Cancer Research. 19 (24), 6787-6801 (2013).
  3. Clevers, H. Modeling development and disease with organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
  4. Byrne, A. T., et al. Interrogating open issues in cancer precision medicine with patient-derived xenografts. Nature Reviews. Cancer. 17 (4), 254-268 (2017).
  5. Vatandoust, S., Price, T. J., Karapetis, C. S. Colorectal cancer: Metastases to a single organ. World Journal of Gastroenterology. 21 (41), 11767-11776 (2015).
  6. Cespedes, M. V., et al. Orthotopic microinjection of human colon cancer cells in nude mice induces tumor foci in all clinically relevant metastatic sites. The American Journal of Pathology. 170 (3), 1077-1085 (2007).
  7. Durkee, B. Y., Weichert, J. P., Halberg, R. B. Small animal micro-CT colonography. Methods. 50 (1), 36-41 (2010).
  8. Boll, H., et al. Double-contrast micro-CT colonoscopy in live mice. International Journal of Colorectal Disease. 26 (6), 721-727 (2011).
  9. O'Brien, C. A., Pollett, A., Gallinger, S., Dick, J. E. A human colon cancer cell capable of initiating tumour growth in immunodeficient mice. Nature. 445 (7123), 106-110 (2007).
  10. Jensen, M. M., Jorgensen, J. T., Binderup, T., Kjaer, A. Tumor volume in subcutaneous mouse xenografts measured by microCT is more accurate and reproducible than determined by 18F-FDG-microPET or external caliper. BMC Medical Imaging. 8, 16(2008).
  11. Herpers, B., et al. Functional patient-derived organoid screenings identify MCLA-158 as a therapeutic EGFR x LGR5 bispecific antibody with efficacy in epithelial tumors. Nature Cancer. 3 (4), 418-436 (2022).
  12. Chicote, I., Camara, J. A., Palmer, H. G. Advanced colorectal cancer orthotopic patient-derived xenograft models for cancer and stem cell research. Methods in Molecular Biology. 2171, 321-329 (2020).

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

重印与许可

探索更多文章

结直肠癌模型盲肠注射转移性疾病肿瘤细胞悬液免疫缺陷小鼠微型计算机断层扫描肝转移肺转移
原位移植患者来源的癌细胞可模拟晚期结直肠癌
联系我们
向图书馆推荐

隐私政策

使用条款

政策

版权所有 © 2026 MyJoVE Corporation。保留所有权利。