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前 RNA 剪接分析：从基础科学到应用研究

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DOI：

10.3791/64630

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2022年9月12日

1Departamento de Biologia Celular e do Desenvolvimento, Instituto de Ciências Biomédicas, Universidade de São Paulo

本文内容

摘要

文章讨论：

Voss， PG， Haudek， KC， Patterson， RJ， Wang， JL. 珠子上半乳糖凝集素-3-u1 snrnp 复合物对剪接活性的互补。可视化实验杂志。（166），e61990 （2020）。

Wong， J.， Martelly， W.， Sharma， S.一种基于报告基因的细胞检测，用于监测剪接效率。可视化实验杂志。（175），e63014 （2021）。

van der Feltz， C. ACT1-CUP1 测定确定出芽酵母中剪接体突变体的底物特异性敏感性。可视化实验杂志。（184），e63232 （2022）。

Carvalho， FA， Barros， M. R. A.， Girotto， T. P. F.， Perona， MG， Oliveira， CC 利用 grafix 检测酿酒酵母剪接体亚复合物的瞬时相互作用子。可视化实验杂志。（165），e61994 （2020）。

Basei， FL， Moura， LAR， Kobarg， J. 使用 E1a 小基因工具研究 mRNA 剪接变化。可视化实验杂志。（170），e62181 （2021）。

Gatti da Silva， G. H.， Coltri， P. P.一种报告基因检测，用于分析哺乳动物细胞中含含子 microRNA 的成熟。可视化实验杂志。（184），e63498 （2022）。

社论

真核生物细胞表型的主要驱动因素之一是基因表达。基因表达的控制至关重要，并且依赖于多种蛋白质和 RNA，从转录到翻译过程1。这些步骤的改变可能会引发几种不同的疾病。RNA加工和剪接构成了一组重要的反应，负责产生成熟的RNA分子2,3,4,5。剪接去除内含子并连接外显子以产生能够执行功能和结构活性的成熟 RNA 分子。剪接的效率和速率极大地影响了在不同条件下观察到的表型6。

剪接由一种名为剪接体的复杂大分子机制进行，该机制由五个 snRNA 和 100 多种蛋白质组成 5,7。除了核心蛋白质成分外，剪接体还具有反式作用蛋白，这可能直接影响该过程的调节8,9。剪接的重要性反映在由该过程改变引起的广泛疾病中，包括神经退行性疾病、神经肌肉疾病和几种类型的癌症 3,10,11。剪接动力学和剪接体组装的研究可以极大地影响对这些疾病生物学的理解。

剪接体组装始于 U1 snRNP 与最近转录的前 mRNA 的特定区域（5' 剪接位点 5,8）的结合。U1 snRNA对5'剪接位点的有效配对和识别不仅定义了应该使用的剪接位点，而且还控制了哪些前RNA将首先剪接，或者更有效地剪接6,12,13。使用不同的剪接位点可以从同一基因生成成熟RNA的多种替代亚型。选择性剪接是蛋白质组学多样性的主要来源，允许在发育过程中或在不同的细胞和组织中产生所需的RNA和蛋白质14,15。替代RNA转录本可以产生截短或无功能的蛋白质亚型，这可能导致疾病10,16。因此，U1 snRNP复合物的蛋白质成分在剪接1中具有重要的调控作用。半乳糖凝集素-1 和半乳糖凝集素-3（Gal1 和 Gal3）是 U1 snRNP17,18 的组成部分。Voss等人19提出了一种核提取物分离方法，以获得Gal3-U1富含snRNP的复合物，能够挽救U1耗尽细胞中的剪接活性。该分析有助于理解 Gal3 与剪接体的结合机制，类似的方法可用于探索其他潜在的剪接调节蛋白。

U1 snRNP与5'剪接位点的结合是剪接保真度的重要介质20。5'剪接位点的突变至关重要，会导致U1 snRNP配对丢失，从而导致剪接缺陷2。例如，囊性纤维化是由 CFTR 基因21 中突变的 5' 剪接位点引起的。Wong 等人 22 描述了一种用 U1 snRNA 中的互补突变补偿 5' 剪接位点突变的方法。该方法成功地促进了外显子包涵，产生成熟的 RNA 并导致剪接缺陷的拯救。除了为这些疾病提供可能的基于RNA的疗法外，这种方法还可用于分析前mRNA中的单个调控序列23。

van der Feltz24 在酵母模型系统中也探索了 U1 snRNA 与剪接位点结合的保真度。出芽酵母 酿酒 酵母已被广泛用于探索剪接动力学和剪接体组装25。剪接动力学和剪接体组成在真核生物中保存良好，酵母已被广泛用于监测组装过程中中间复合物的形成26。ACT1-CUP1 报告基因测定基于一对基因的表达：ACT1 包含一个具有最佳剪接位点序列的内含子，以及表达铜螯合剂的 CUP1，保护细胞免受这种金属离子造成的损害。只有当 ACT1 被正确拼接时才表示 CUP1，因此创建报告器系统27。可以监测不同铜浓度条件下的细胞生长，以解决不同内含子序列或使用不同调节蛋白的剪接效率。van der Feltz24 提出了一种使用该报告系统和铜活力测定分析剪接调节蛋白效果的方法。类似的方法可用于设计内含子序列的变异，并结合不同的蛋白质，以解决酵母中的剪接成功问题。

除了 snRNP 关联外，蛋白质的结合在剪接体组装过程中也至关重要1。剪接体活性的控制直接取决于其蛋白质组成及其形成过程中发生的相互作用。蛋白质成分的结构和功能特征对于激活复合物很重要 5,7。Carvalho等人28使用基于Grafix方法的方法，该方法依赖于甘油梯度分析中的不可逆蛋白质交联。该分析解决了蛋白质的组成和组装过程中发生的瞬时相互作用，这对于活性复合物的组装和剪接成功至关重要。使用这种方法分析其他动态大分子复合物可能非常有用，并提供对蛋白质组织和相互作用的见解。

剪接的化学和速度也受到不同剪接体组分8的动态关联的影响。最近，小分子剪接抑制剂的使用表明，由于剪接反应速度降低，特定步骤可以在体外停滞29,30。Basei等人31提出了一种分析替代性剪接对剪接调节因子Nek4影响的方法。讨论了使用微型基因导致 HEK293 细胞中促肿瘤或抗肿瘤表型的转录亚型的普遍性。剪接的失调或剪接位点的不同用途可能导致替代转录本的产生，从而导致不同类型的癌症16。在治疗期间使用剪接调节剂或抑制剂可以确定剪接位点的选择，从而定义产生的替代亚型，无论是促肿瘤还是抗肿瘤。紫杉醇和顺铂目前用作化疗药物。通过使用 E1A 微型基因，解决了这些药物在选择性剪接中的影响。使用小基因进行选择性剪接分析是监测反式作用蛋白和剪接变化对治疗和特定药物使用的影响的重要策略。

据报道，在这条线中，许多内含子 microRNA （miRNA） 与肿瘤表型32,33 相关。内含子miRNA合成和生物发生的控制和调控可以与剪接反应的控制有关。miRNAs可以调节细胞中mRNA的稳定性和流行率，影响RNA的稳定性和翻译速率34。Gatti da Silva 和 Coltri35 描述了一种报告系统来评估内含子 miRNA 的生物发生和成熟，这可以与细胞表型的改变和促肿瘤或抗肿瘤特征的确定直接相关。通过调节剪接调节蛋白 HuR，该系统可以分析内含子致癌 miRNA 的生物发生和功能活性。

分析前 RNA 剪接和特定细胞中不同 RNA 的成熟对于理解和解释基因组信息至关重要。酵母和哺乳动物剪接体是保守的，基础研究可以改进应用于治疗和生物医学的不同方法的使用。尽管目前有大量可用的基因组数据，但这些信息在表型中的表达可能是细胞特异性的，并且依赖于 RNA 加工和剪接。了解这一过程的复杂调节对于未来的研究至关重要。

披露

作者没有什么可透露的。

致谢

作者感谢Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo （FAPESP） 资助号 2019/21874-5 和圣保罗大学的持续研究支持。

参考文献

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