本方案描述了开放式顶盖器官芯片（Open-Top Organ-Chip）的功能及其建立和成熟原代组织（皮肤、肺泡、气道和肠道）全层器官芯片培养所需的关键培养模式，为研究人类上皮/间充质与血管微环境界面的多种功能特性提供了机会。 体外.
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本文内容
摘要
摘要
几乎所有人体器官都由上皮组织覆盖，这些组织由一层或多层紧密连接的细胞构成，并排列成三维（3D）结构。上皮组织的主要功能之一是形成屏障，以保护下方组织免受物理和化学损伤以及病原体的侵害。此外，上皮组织介导营养物质、激素及其他信号分子的转运，常形成生化梯度，从而引导细胞在器官内的定位与区室化。由于上皮组织在决定器官结构与功能中起核心作用，因此成为多种人类疾病的重要治疗靶点，而这些疾病往往无法通过动物模型充分再现。除了明显的物种间差异外，在动物体内研究上皮屏障功能和转运特性还面临难以在活体系统中获取这些组织的困难。尽管二维（2D）人源细胞培养体系在回答基础科学问题方面具有价值，但其预测体内情况的能力通常较差 在体内 预测。为克服这些局限，在过去十年中，大量微加工仿生平台（称为器官芯片）已 emerged 作为传统体外和动物实验的有前景替代方案 体外 以及动物实验。本文中，我们介绍一种开放式器官芯片（Open-Top Organ-Chip，或称 Open-Top Chip），该平台旨在模拟特定器官的上皮组织，包括皮肤、肺和肠道。该芯片为重建上皮组织的多细胞结构与功能提供了新的机遇，能够在力学活性系统中通过整合组织特异性成纤维细胞和内皮细胞，重建三维间质组分。该开放式芯片为在多个分辨率尺度上——从单个细胞到多层组织结构——研究上皮/间充质及血管相互作用提供了前所未有的工具，从而可在健康与疾病状态下对上皮化器官的细胞间分子对话进行解析。
引言
历史上，科学家们一直依赖临床前动物实验进行药物发现，但由于这些方法与人类实际效果的相关性较差，越来越多的方法正受到质疑1. 该实施的 "3Rs" 替代、减少和优化动物实验的原则敦促科学家寻找新的 体外 支持临床前药物和化学物质毒理学风险评估的替代方法2然而，许多 体外 迄今为止开发的模型缺乏重现人类活体器官动态特性所必需的生物学结构、细胞复杂性以及力学环境3,4.
常规 体外 临床前研究系统通常采用在刚性塑料表面培养的人源细胞二维单层培养体系。这些方法可用于开展简单的机制性研究，并实现对候选药物的快速筛选。由于二维模型相对成本较低且稳定性高，常与自动化高通量系统联用，以加速药物研发早期阶段潜在候选药物的识别。5,6然而，此类二维模型无法为治疗候选物在组织层面、器官层面或系统层面的响应建模提供可转化的方法，而这种可转化性是在药物开发的临床前阶段准确预测其安全性和有效性的必要条件。平面细胞培养无法重现人体组织的天然微环境，包括复杂的多细胞相互作用、生物力学特性以及三维（3D）结构。
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方案
人结肠类器官是根据辛辛那提儿童医院机构生物安全委员会（IBC 2017-2011）的指南，从肠道切除组织中获得的。
1. 表面活化
- 活化缓冲液的制备
- 将交联剂和溶剂缓冲液试剂置于生物安全柜（BSC）中，在使用前于室温（RT）下平衡10分钟。
- 使用无菌避光容器或用铝箔包裹的透明15 mL锥形管，将5 mg交联剂溶于5 mL溶剂缓冲液中，以防止交联剂溶液暴露于直射光下。
- 涡旋混合溶液1分钟以去除所有团块，然后将50 µL交联剂溶液直接加入芯片的底部通道，另取150 µL加入敞口腔室中。
- 使用移液器从芯片表面移除多余的交联溶液。随后再向芯片底部通道加入50 µL交联溶液，向敞口腔室加入150 µL，以排除任何残留的气泡。
- 使用紫外交联仪进行活化
- 在生物安全柜（BSC）内轻轻取下芯片盖，并将其存放于无菌容器中。
- 将含有交联剂溶液的芯片转移至培养皿中，盖上培养皿以避免污染，并将培养皿连同芯片置于紫外交联仪下。
注意：需取下培养皿盖以最大化紫外光照射。 - 设置紫外交联仪的峰值波长为365 nm，强度为100 µJ/cm2，开启紫外灯照射20分钟。
注意：经过20分钟紫外处理后，....
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结果
表面微图案化
细胞外基质（ECM）的微图案化技术可用于复现肠道隐窝界面的空间构型。开放式芯片构型可经改造，整合专门设计的微图案化印模，以模拟结肠上皮-基质界面的天然拓扑结构。图 6A，) 以及微米尺度的肠隐窝图 6C-E请注意，我们为皮肤、气道和肺泡模型使用了平坦（非图案化）表面。在此案例中，使用印章是为了获得均匀的水凝胶表面以接种上皮细胞。我们选择了一种能够模拟人类肠黏膜自然结构的设计，该设计由模拟肠隐窝的正负交替穹顶结构组成。
器官模型
我们使用开放式芯片原型培养并分化了四种不同的上皮组织（皮肤、肺泡、气道和肠道），以验证这一仿生平台。'其多功能性。器官芯片的组织学切片证实了上皮细胞的存在，这些细胞在表型上具有独特性，并分别代表了：皮肤中的复层上皮、
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讨论
Open-Top芯片是一种能够在受控微环境中实时研究内皮、间质与上皮之间复杂细胞相互作用的赋能平台。该技术相较于传统的器官型培养和类器官培养具有关键优势，例如整合了与重建人体组织微环境相关的物理和生化信号，包括流体剪切力（流动）、周期性拉伸，以及实现上皮表面拓扑结构的重建 通过 微图案化。在此平台内生长的人类细胞协同作用，以重现可被分析的组织特异性功能 通过 传统技术，包括免疫组织化学以及利用顶部和/或底部腔室流出液（或渗出液）进行的生化检测。当前的设计可便捷地接触上皮层，细胞在此直接与组织特异性成纤维细胞及其他基质细胞接触生长，模拟上皮组织的多细胞结构。值得注意的是，开放式芯片原型为解决其他类器官芯片平台应用中常见的挑战提供了可行方案。它不仅能够在基质腔室中整合多种不同类型的细胞，从而构建出高度复杂的三维组织，还允许轻松地将已形成的组织构建物从芯片装置中取出，用于后续分析，包括传统的H&E染色。
当前设计存在一些局限性。例如，原型开放式器官芯片中位于血管微通道与基质区室（水凝胶）之间的弹性膜明显更厚（≈ 50 µm.......
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披露
作者声明存在以下财务利益/个人关系，这些利益或关系可能被视为潜在的竞争利益：Varone Antonio 曾是 Emulate 公司的员工，可能持有 Emulate 公司的股权。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 10x EMEM | Lonza | 12-684F | 培养基；间质 |
| 18号针头 | 微群组 | 316H18RW | 不锈钢316焊接管，18RW全硬 |
| 19 号针头 | 微群组 | 316H19RW | 不锈钢316焊接管，19RW全硬 |
| 2-Stop PharMed BPT | Cole-Palmer | EW-95723-12 | 管，0.25 mm，12个/包 |
| 70% 乙醇和擦拭纸 | - | - | 用于表面灭菌 |
| 8-溴腺苷 3′,5′8-溴-环单磷酸腺苷钠盐 | Sigma | B7880 | 培养基添加剂 |
| A-83-01 | Tocris | 2939 | |
| 腺嘌呤 | Sigma | A9795 | |
| 高级DMEM/F12 | 赛默飞世尔科技 | 12634010 | |
| 气道上皮细胞 | Lifeline Cell Technology | FC-0016 | |
| 铝箔 | - | - | - |
| 肺泡细胞 | 细胞生物技术 | H6621 | |
| 抗ABCA3 | ABCAM | ab24751 | 小鼠单克隆抗体 [3C9] |
| 抗水通道蛋白5 Alexa Fluor 647 | ABCAM | ab215225 | 兔单克隆抗体 [EPR3747] |
| 抗水通道蛋白5 | ABCAM | ab92320 | 兔单克隆抗体 [EPR3747] |
| 抗βIV微管蛋白 | ABCAM | ab11315 | 小鼠单克隆抗体 [ONS.1A6] |
| 抗CD31（PECAM-1） | ABCAM | ab9498 | 小鼠单克隆 [JC/70A] 抗体 |
| 抗-CK5 | ABCAM | ab75869 | 兔重组单克隆抗体 [AY1E6] |
| 抗细胞角蛋白10 | ThermoFisher | MA5-13705 | 小鼠单克隆抗体（DE-K10） |
| 抗细胞角蛋白14 | ABCAM | ab7800 | 小鼠单克隆抗体 |
| 抗E-钙黏蛋白 | ABCAM | ab1416 | 小鼠单克隆抗体 |
| 抗丝聚蛋白 | ThermoFisher | PA5-79267 | 兔多克隆抗体 |
| 抗-HTI-56 | Terrace Biotech | TB-29AHT1-56 | 小鼠单克隆抗体（IgG1） |
| 抗-HTII-280 | Terrace Biotech | TB-27AHT2-280 | 小鼠单克隆抗体（IgM） |
| 抗兜甲蛋白 | ThermoFisher | MA5-11803 | 小鼠单克隆抗体（SY5） |
| 抗-TAp63 亚型α, -β, -γ | 生物工程 | 618902 | 兔多克隆抗体 |
| 抗 Ki67 | ABCAM | ab8191 | 小鼠单克隆抗体 [B126.1] |
| 抗LAMP3 | ABCAM | ab111090 | 兔多克隆抗体 |
| 抗成熟SP-B | Seven Hill | WRAB-48604 | 兔多克隆抗体 |
| 抗 MUC5AC | ThermoFisher | PA5-34612 | 兔多克隆抗体 |
| 抗黏蛋白-2 | SantaCruz Biotechnology | sc-7314 | 小鼠单克隆抗体（IgG1） |
| 抗 p63 | Dako | GA662 | 小鼠单克隆抗体 p63 蛋白（Dako Omnis） 克隆 DAK-p63 |
| 抗PCNA | ThermoFisher | PA5-32541 | 兔多克隆抗体 |
| 抗足蛋白（AT-1）α) | ABCAM | ab128994 | 兔多克隆抗体 |
| 抗Pro + 成熟表面活性蛋白B | ABCAM | ab40876 | 兔多克隆抗体 |
| 抗表面活性剂C | Seven Hill | WRAB-9337 | 兔多克隆抗体 |
| 抗泌尿球蛋白/SCGB1A1 | Hycult Biotech | HM2178 | 小鼠单克隆抗体 [AY1E6] |
| 抗VE-钙黏蛋白 | ABCAM | ab33168 | 兔多克隆抗体 |
| 抗ZO-1 | ThermoFisher | 33-9100 | 小鼠单克隆抗体 [1A12] |
| 抗坏血酸 | Sigma | A4544 | |
| 移液管吸液 | Corning / Falcon | 357558 | 2 mL，聚苯乙烯，独立包装 |
| 吸液头 | - | - | 无菌（高压灭菌） |
| B27 | 赛默飞世尔科技 | 17504044 | |
| PBS 溶液中的封闭剂 BSA（10X） | ThermoFisher | 37525 | 阻断剂 |
| 氯化钙 | Sigma | C7902 | |
| CHIR 99021 | Tocris | 4423 | |
| I 型胶原蛋白 | Advanced Biomatrix | 5133 | 10 mg/mL（基质） |
| I 型胶原蛋白 | Advanced BioMatrix | 5005 | 3 mg/mL（血管ECM） |
| IV型胶原蛋白 | Sigma | C5533 | |
| IV型胶原蛋白 | Sigma | C5533-5MG | 人胎盘胶原蛋白，5 mg 粉末，重悬至 1 mg/mL |
| 结肠成纤维细胞 | 细胞生物技术 | H6231 | |
| 结肠微血管内皮细胞 | 细胞生物技术 | H6203 | |
| 锥形管 | - | - | 15 mL 和 50 mL 聚丙烯，无菌 |
| 交联剂（ER-1） | Emulate | 10461 | 5 mg 粉末 |
| DAPI（4',6-二脒基-2-苯基吲哚，双乳酸盐） | ThermoFisher | D3571 | DNA探针 |
| 真皮成纤维细胞 | ATCC | PCS-201-010 | |
| 真皮微血管内皮细胞 | ATCC | CRL-3243 | |
| 地塞米松 | Sigma | D4902 | |
| DMEM | ThermoFisher | 11054020 | |
| DMEM/F-12 | GIBCO | 11320082 | |
| DMEM/F-12，GlutaMAX | GIBCO | 10565-018 | 气液界面培养基的基础培养基 |
| 驴抗小鼠 IgG H&L（Alexa Fluor 488） | ABCAM | ab150105 | 驴抗小鼠二抗 |
| 驴抗小鼠IgG H&L（Alexa Fluor 568） | ABCAM | ab175472 | 驴抗小鼠二抗 |
| 驴抗小鼠 IgG H&L（Alexa Fluor 647） | ABCAM | ab150107 | 驴抗小鼠二抗 |
| 驴抗兔IgG H&L（Alexa Fluor 488） | ABCAM | ab150073 | 驴抗小鼠二抗 |
| 驴抗兔IgG H&L (Alexa Fluor 568) | ABCAM | ab175470 | 驴抗小鼠二抗 |
| 驴抗兔IgG H&L（Alexa Fluor 647） | ABCAM | ab150075 | 驴抗小鼠二抗 |
| 杜尔贝科’s PBS（DPBS-/-）（不含 Ca²⁺、Mg²⁺） | 康宁 | 21-031-CV | 1x |
| 表皮生长因子（EGF）人源，大肠杆菌重组表达 | PromoCell | C-60170 | 培养基添加剂 |
| F-12 Ham’s | Invitrogen | 21700-108 | 对于血管ECM |
| FibriCol | Advanced BioMatrix | 5133-20ML | I型胶原溶液（10 mg/mL） |
| 纤连蛋白 | 康宁 | 356008 | |
| 人源天然纤连蛋白 | 康宁 | 47743-654 | 人血浆纤连蛋白 |
| 精细尖头精密镊子 | Aven | 18056USA | Technik Style 5B-SA 精密不锈钢镊子 |
| Glutamax | Invitrogen | 21700-108 | |
| Glutamax | Invitrogen | 35050061 | |
| 山羊抗小鼠IgG H&L（Alexa Fluor 594） | ABCAM | ab150080 | 山羊抗小鼠二抗 |
| 山羊抗小鼠IgG H&L（Alexa Fluor 647） | ABCAM | ab150115 | 山羊抗小鼠二抗 |
| 山羊抗小鼠IgG H&L（FITC） | ABCAM | ab6785 | 山羊抗小鼠二抗 |
| 山羊抗小鼠 IgG1 Alexa Fluor 568 | ThermoFisher | A-21124 | 山羊抗小鼠 IgG1 二抗 |
| Alexa Fluor 488 标记的山羊抗小鼠 IgM | ThermoFisher | A-21042 | 山羊抗小鼠 IgM 二抗 |
| 手持式真空吸引器 | 康宁 | 4930 | - |
| 热灭活 HyClone FetalClone II 血清（FCS） | GE Healthcare Life Sciences | SH30066.03 | |
| 血细胞计数板 | - | - | - |
| 猪肠黏膜来源肝素钠盐 | Sigma | H3149 | |
| HEPES | 赛默飞世尔科技 | 15630080 | |
| 人 [Leu15] - 胃泌素 | Sigma | G9145 | |
| 人结肠类器官 | 来自临床切除样本 | 来自临床切除样本 | |
| 人EGF重组蛋白 | 赛默飞世尔科技 | PHG0311L | |
| 人表皮生长因子 | 赛默飞世尔科技 | PHG0311 | |
| HyClone FetalClone II 血清（U.S.） | GE Healthcare | SH30066.02HI | 无菌 FBS 热灭活 |
| 氢化可的松-21-半琥珀酸钠盐 | Sigma | H4881 | |
| 氢化可的松 | PromoCell | C-64420 | 培养基添加剂 |
| 冰桶 | - | - | - |
| Ismatec IPC-N | Cole-Palmer | EW-78000-41 | 低速数字蠕动泵；q24-通道（每12个芯片配1个） |
| ITES | BioWhittaker | 17-839Z | |
| 角质形成细胞生长因子（KGF），又称碱性成纤维细胞生长因子7（FGF-7），人源，HEK中重组表达 | PromoCell | C-63821 | |
| 角质形成细胞 | ATCC | PCS-200-010 | |
| 层粘连蛋白 | Biolamina | CT521-0501 | |
| 层粘连蛋白521 CTG（CT521） | Biolamina | CT521-0501 | 人重组层粘连蛋白521 |
| 肺成纤维细胞 | 细胞生物技术 | H6013 | |
| 肺成纤维细胞 | Lifeline Cell Technology | FC-0049 | |
| 肺微血管内皮细胞 | Lonza | CC-2527 | |
| 肺平滑肌细胞 | Lifeline Cell Technology | FC-0046 | |
| 手动计数器 | - | - | - |
| Masterflex（TPE）转移管 | Cole-Palmer | FV-96880-02 | PharMed BPT，1/32" ID x 5/32" 光密度 |
| 199培养基，无酚红 | 赛默飞世尔科技 | 11043023 | |
| 微量离心管 | - | - | 1.5 mL，无菌 |
| 显微镜（带相机） | - | - | 用于明场成像 |
| N2 | Sigma | 17502001 | |
| N-乙酰半胱氨酸 | Sigma | A5099 | |
| Noggin（HEK293T 条件培养基） | Sigma | N17001 | |
| 正常山羊血清 | ThermoFisher | 50062Z | 封闭液 |
| O-磷酸丝氨酸乙醇胺 | Sigma | P0503 | |
| 多聚甲醛（4% 质量/体积） | EMS | 15710 | 固定剂 |
| 青霉素-链霉素 | GIBCO | 15140122 | |
| 青霉素-链霉素 | Sigma | P4333 | 10,000 U/mL；10 mg/mL |
| 移液器吸头 | - | - | P20、P200 和 P1000 无菌，低黏附 |
| 移液器 | Gilson | F167380 | P20、P200 和 P1000 |
| PluriQ 血清替代物（或替代的 KO 血清替代物） | AMSBIO（或 Thermo） | N/A（或 C1910828010） | |
| 聚-L-赖氨酸包被的显微镜玻片 | Sigma | P0425 | 载玻片 |
| Primocin | InvivoGen | ant-pm-1 | |
| 孕酮 | Sigma | P8783 | |
| ProLong Gold | ThermoFisher | P36931 | 含DAPI的抗荧光淬灭封片剂 |
| 视黄酸 | Sigma | R2625 | |
| ROCK抑制剂（Y27632） | Tocris | TB1254-GMP/10 | |
| R-spondin（HEK293T 条件培养基） | Sigma | SCC111 | |
| SAGM SingleQuots 补充剂 | Lonza | CC-4124 | |
| SAGMTM 小气道上皮细胞生长培养基 BulletKitTM | Lonza | CC-4124 | 培养基添加剂 |
| SB2001190 | Tocris | 1264/10 | |
| 血清移液管 | - | - | 2 mL、5 mL、10 mL 和 25 mL 低内毒素、无菌 |
| 小气道上皮细胞生长培养基（SAGM） | Lonza | CC-4124 | |
| 溶剂缓冲液（ER-2） | Emulate | 10462 | 25 mL 瓶 |
| Steriflip-HV | Millipore | SE1M003M00 | 无菌过滤锥形管 |
| Sterilin 100 mm 方形培养皿 | 赛默飞 | 103 | 无菌，每6个芯片1个 |
| T25 培养瓶 | - | - | - |
| T75 培养瓶 | - | - | - |
| 三碘甲状腺原氨酸 | Sigma | T5516 | |
| Triton X-100（0.3%（vol/vol）） | Sigma | T8787 | 通透化试剂 |
| 台盼蓝 | Sigma | 93595 | 0.4% 溶液 |
| TrypEE溶液 | Sigma | 12604013 | 细胞解离溶液 |
| TWEEN-20 | Sigma | P2287 | 透化剂 |
| 紫外光烘箱（峰值频率 365nm，强度 100 µJ/cm2) | VWR | 21474-598 | UVP，长波紫外，365 nm 60 Hz 型号 CL-1000L |
| 真空装置 | - | - | 最低压力：-70 kPa |
| 血管内皮生长因子165（VEGF-165）人源，大肠杆菌重组表达 | PromoCell | C-64420 | |
| VEGF-165 | PromoCell | C-64420 | 培养基添加剂 |
| FITC 标记的血管性血友病因子 | ABCAM | ab8822 | 羊多克隆抗体 |
| 水浴（或微珠） | - | - | 设为 37 °C |
| Wnt3A（L-Wnt3A 条件培养基） | ATCC | CRL-2647 |
参考文献
- Van Norman, G. A. Limitations of animal studies for predicting toxicity in clinical trials: Is it time to rethink our current approach. JACC: Basic to Translational Science. 4 (7), 845-854 (2019).
- Wange, R. L., Brown, P. C., Davis-Bruno, K. L.
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重印与许可
