本方案描述了开放式顶盖器官芯片（Open-Top Organ-Chip）的功能及其建立和成熟原代组织（皮肤、肺泡、气道和肠道）全层器官芯片培养所需的关键培养模式，为研究人类上皮/间充质与血管微环境界面的多种功能特性提供了机会。 体外.
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摘要
摘要
几乎所有人体器官都由上皮组织覆盖，这些组织由一层或多层紧密连接的细胞构成，并排列成三维（3D）结构。上皮组织的主要功能之一是形成屏障，以保护下方组织免受物理和化学损伤以及病原体的侵害。此外，上皮组织介导营养物质、激素及其他信号分子的转运，常形成生化梯度，从而引导细胞在器官内的定位与区室化。由于上皮组织在决定器官结构与功能中起核心作用，因此成为多种人类疾病的重要治疗靶点，而这些疾病往往无法通过动物模型充分再现。除了明显的物种间差异外，在动物体内研究上皮屏障功能和转运特性还面临难以在活体系统中获取这些组织的困难。尽管二维（2D）人源细胞培养体系在回答基础科学问题方面具有价值，但其预测体内情况的能力通常较差 在体内 预测。为克服这些局限，在过去十年中，大量微加工仿生平台（称为器官芯片）已 emerged 作为传统体外和动物实验的有前景替代方案 体外 以及动物实验。本文中，我们介绍一种开放式器官芯片（Open-Top Organ-Chip，或称 Open-Top Chip），该平台旨在模拟特定器官的上皮组织，包括皮肤、肺和肠道。该芯片为重建上皮组织的多细胞结构与功能提供了新的机遇，能够在力学活性系统中通过整合组织特异性成纤维细胞和内皮细胞，重建三维间质组分。该开放式芯片为在多个分辨率尺度上——从单个细胞到多层组织结构——研究上皮/间充质及血管相互作用提供了前所未有的工具，从而可在健康与疾病状态下对上皮化器官的细胞间分子对话进行解析。
引言
历史上，科学家们一直依赖临床前动物实验进行药物发现，但由于这些方法与人类实际效果的相关性较差，越来越多的方法正受到质疑1. 该实施的 "3Rs" 替代、减少和优化动物实验的原则敦促科学家寻找新的 体外 支持临床前药物和化学物质毒理学风险评估的替代方法2然而，许多 体外 迄今为止开发的模型缺乏重现人类活体器官动态特性所必需的生物学结构、细胞复杂性以及力学环境3,4.
常规 体外 临床前研究系统通常采用在刚性塑料表面培养的人源细胞二维单层培养体系。这些方法可用于开展简单的机制性研究，并实现对候选药物的快速筛选。由于二维模型相对成本较低且稳定性高，常与自动化高通量系统联用，以加速药物研发早期阶段潜在候选药物的识别。5,6然而，此类二维模型无法为治疗候选物在组织层面、器官层面或系统层面的响应建模提供可转化的方法，而这种可转化性是在药物开发的临床前阶段准确预测其安全性和有效性的必要条件。平面细胞培养无法重现人体组织的天然微环境，包括复杂的多细胞相互作用、生物力学特性以及三维（3D）结构。7在平面表面生长的细胞通常无法获得成熟表型，因此不能像在天然组织中那样对药理学刺激产生响应。例如，培养的原代人肺泡上皮细胞 体外 呈现鳞状表型，并丢失关键的表型标志物，包括表面活性蛋白C和B（SP-C和SP-B）8除了分化不足之外，原代细胞还经常对生物应激因素失去敏感性 体外，因为与组织炎症相关的某些生化通路会失去功能9这种细胞功能的丧失似乎主要与使用刚性基底以及缺乏由组织特异性间质细胞（如肺成纤维细胞和平滑肌细胞）自然释放的可溶性因子有关10,11.
理解到化学-物理和生物学复杂性的缺乏会限制细胞的生理行为 体外 促进了更复杂的多细胞模型的发展，这些模型已被证明能更好地体外模拟人体组织的复杂性12,13自20世纪70年代初首个共培养模型建立以来14合成与天然水凝胶的引入显著提升了模拟天然组织微环境的能力，已成为促进细胞分化、引导细胞自组织形成类组织结构以及恢复天然组织功能的不可或缺的工具15,16例如，在适当的三维支架中培养时，人类细胞可自行排列成功能性结构（如球状体或类器官），表达干细胞标志物，并具有自我更新能力17相比之下，人类细胞（包括干细胞）在传统二维基质上培养时，经过数次传代后会迅速老化并进入衰老状态18此外，水凝胶可以被 "定制的" 以匹配特定组织特性，如孔隙率、孔径、纤维厚度、黏弹性、表面形貌和刚度，或进一步通过引入组织来源的细胞组分和/或生物活性分子进行工程化改造，从而模拟生理或病理条件19,20尽管基于3D水凝胶的模型在药物测试中具有巨大潜力，但其在药物研发中的应用尚不能完全重现复杂的细胞架构 在体内 组织，并缺乏人体内通常存在的血流动力学和机械刺激，包括静水压、周期性拉伸和流体剪切力21.
诸如器官芯片（OOC）之类的微生理系统（MPS）近年来已成为能够在体外模拟复杂生理反应的工具 in vitro22,23。这些模型通常采用微流控平台，可模拟活体器官的动态微环境。
我们结合了三维组织生物工程学和力学生物学的原理，构建了一种复杂的开放式器官芯片（Open-Top Chip）模型，用于模拟人体上皮组织。该模型能够高度还原上皮组织的多细胞结构和动态微环境，包括在活体器官中天然存在的组织特异性生化和生物力学信号，而这些信号常被传统的体外（in vitro）模型所忽略24。该开放式芯片包含两个腔室：血管腔室（图1A）和基质腔室（图1B），两者由多孔膜隔开，允许营养物质在两个腔室之间扩散（图1C）。血管腔室暴露于持续的流体流动中，以模拟生理性的剪切应力；而基质腔室具有可拉伸的设计，可用于模拟呼吸运动或肠道蠕动所引起的机械应变。基质腔室包含一个可调节的三维水凝胶支架，旨在支持组织特异性成纤维细胞的生理生长。该腔室配备可拆卸的顶盖，便于建立气液界面，这一条件不仅更接近人体黏膜组织的生理状态，还可直接接触组织，实现药物对上皮层的直接施加。补充图1展示了开放式芯片设计的一些关键组成部分，包括尺寸和生物腔室结构（补充图1A-D），以及本实验方案中描述的主要技术步骤（补充图1E）。
Open-Top Chip 的灌注通过可编程蠕动泵实现（图 1D）。该蠕动泵系统可同时对 12 个 Open-Top Chip 进行灌注。大多数培养箱可容纳两套该系统，从而在单个培养箱内最多培养 24 个芯片。机械拉伸通过自制的可编程真空压力调节器实现（图 1E），该装置由数字模拟转换器电子控制的电控气动真空调节器组成。换言之，电控气动真空调节器可生成由用户设定振幅和频率的正弦波形真空模式。通过在 Open-Top Chip 的真空通道施加范围为 0 至 -90 kPa、频率为 0.2 Hz 的负压，可产生 0% 至 15% 的周期性应变。该系统为自制装置，其功能等同于先前其他研究中采用并描述的商用 Flexcell 应变单元25。为模拟与肺部呼吸运动或肠道蠕动相关的机械性组织形变，气动驱动器可施加正弦波形的真空/应变，其强度与振幅可调节至与人体细胞在天然组织中所经历的生理应变水平和频率相匹配。
本文介绍了一种在开放式芯片平台原型上构建和培养类器官上皮等效物的高效且可重复的方法。该方法能够在整合血管流体流动和机械拉伸的同时，生成皮肤、肺泡、气道和结肠等复杂的器官模型。我们将概述在应用组织工程技术构建复杂上皮模型时必须考虑的关键技术要点，并讨论当前设计的优势与可能存在的局限性。
实现组织和器官成熟的主要步骤（包括流体和拉伸参数）概述如下：图2 针对皮肤，图3 针对肺泡，图4 针对气道，以及 图5 针对肠道。有关不同器官模型培养所用培养基成分和试剂的附加信息见补充表格（补充表1 针对皮肤；补充表2 针对肺泡；补充表3 针对气道；以及 补充表4 针对肠道）。
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方案
人结肠类器官是根据辛辛那提儿童医院机构生物安全委员会（IBC 2017-2011）的指南，从肠道切除组织中获得的。
1. 表面活化
- 活化缓冲液的制备
- 将交联剂和溶剂缓冲液试剂置于生物安全柜（BSC）中，在使用前于室温（RT）下平衡10分钟。
- 使用无菌避光容器或用铝箔包裹的透明15 mL锥形管，将5 mg交联剂溶于5 mL溶剂缓冲液中，以防止交联剂溶液暴露于直射光下。
- 涡旋混合溶液1分钟以去除所有团块，然后将50 µL交联剂溶液直接加入芯片的底部通道，另取150 µL加入敞口腔室中。
- 使用移液器从芯片表面移除多余的交联溶液。随后再向芯片底部通道加入50 µL交联溶液，向敞口腔室加入150 µL，以排除任何残留的气泡。
- 使用紫外交联仪进行活化
- 在生物安全柜（BSC）内轻轻取下芯片盖，并将其存放于无菌容器中。
- 将含有交联剂溶液的芯片转移至培养皿中，盖上培养皿以避免污染，并将培养皿连同芯片置于紫外交联仪下。
注意：需取下培养皿盖以最大化紫外光照射。 - 设置紫外交联仪的峰值波长为365 nm，强度为100 µJ/cm2，开启紫外灯照射20分钟。
注意：经过20分钟紫外处理后，交联剂溶液颜色会变深（呈棕色）。 - 将芯片重新移回生物安全柜（BSC）中，吸除氧化后的交联剂溶液。随后用溶剂缓冲液清洗所有芯片三次，并在生物安全柜中干燥5–10分钟，以完成聚二甲基硅氧烷（PDMS）表面的化学功能化。
2. 制备间质等效物
- 10倍重建缓冲液的制备（100 mL）
- 将2.2 g碳酸钠溶解于75 mL双蒸水中含0.067 M氢氧化钠的溶液中。
- 加入4.76 g HEPES，用双蒸水定容至100 mL。
- 在生物安全柜中使用一次性无菌瓶顶滤器对溶液进行无菌过滤 0.22 µm 膜
注意：该溶液在储存时可保持约6个月的稳定性 4 °C.
- 预凝胶溶液体积的估算
- 将实验所需的芯片数量乘以 150 µL （中央开放式腔室的内部体积）以估算实验所需的预凝胶溶液量：
所需体积 = （芯片数量 × 150） µL - 在冰上配制胶原预凝胶溶液，混合以下组分：1 体积含所选细胞的 10x EMEM、1 体积 10x 重悬缓冲液（见步骤 2.1）、8 体积 I 型胶原溶液（10 mg/mL）以及 1 µL 每毫克 I 型胶原使用 1 毫升 1 N NaOH 溶液。
注意：建议额外准备15%的体积以弥补实验误差；第2.2节中描述的示例提供了为12个芯片及额外15%体积配制足够预凝胶溶液的详细逐步操作流程。
- 将实验所需的芯片数量乘以 150 µL （中央开放式腔室的内部体积）以估算实验所需的预凝胶溶液量：
- 基质等效物预凝胶溶液的制备（适用于12个芯片）
- 将以下溶液置于冰上并移至生物安全柜中：10x EMEM；10x 重建缓冲液（见步骤2.1）；I型胶原溶液（10 mg/mL）；以及无菌1 N NaOH溶液。
- 按照供应商的说明培养组织特异性间充质细胞，直至细胞融合度达到80%–90%，然后使用胰蛋白酶或其他细胞供应商推荐的方法消化细胞。通过250 x g离心将细胞收集成沉淀。 g 5 分钟，24 ˚C.
- 将细胞沉淀重悬于 225 µL 冰冷的10倍浓度EMEM，并加入 225 µL 冰冷的10倍浓度重构缓冲液（见步骤2.1）。轻轻吹打混匀溶液，然后加入 1,800 µL 冰冷的 I 型胶原蛋白溶液
- 在冰上将预凝胶溶液上下吹打5-6次，避免产生气泡，以充分混匀。
- 芯片上基质等效物的构建（适用于12个芯片）
- 用 18 µL 1 N NaOH。用移液器轻轻吹打混合5-6次，然后移取 150 µL 将含细胞水凝胶注入开放式芯片的中央腔室，避免产生气泡。
注意：如果需要进行微图案化，请进入下一步（第 3 节）。 - 将芯片分组放入不同的培养皿中，并在每个培养皿中放置一个装有2 mL无菌ddH₂O的离心管盖2每个培养皿中加入 O，并将培养皿置于培养箱中孵育 37 °C，5% CO₂2.
注意：90 分钟后，含细胞水凝胶将完全聚合。
- 用 18 µL 1 N NaOH。用移液器轻轻吹打混合5-6次，然后移取 150 µL 将含细胞水凝胶注入开放式芯片的中央腔室，避免产生气泡。
3. 表面微图案化（可选）
- 在移液中和后的胶原蛋白水凝胶（仍处于液态）后，使用3D打印的印章对基质水凝胶进行表面微图案化。
注意：3D打印的印章可提供多种可定制的设计，具体如先前文献所述24。 - 将20 µL中和后的I型胶原预凝胶溶液移液至无菌3D打印印章的图案化表面，并在基质水凝胶仍处于液态时，将印章插入（置于）敞口腔室的内部（上方）。
- 使用吸管装置（或移液器）清除可能从敞口腔室顶部溢出的水凝胶残留物。将所有芯片分组放入不同的培养皿中，并在每个培养皿中放置一个装有2 mL无菌ddH2O的15 mL离心管盖。
- 将所有培养皿在37 °C、5% CO2条件下孵育90分钟，然后将芯片移回生物安全柜中，使用精密镊子轻轻移除印章，以降低损伤水凝胶的风险。
4. 使用组织特异性细胞外基质蛋白包被上皮和血管表面
- 用细胞外基质蛋白包被血管微流控腔室
- 将实验所需的芯片数量乘以 20 µL （血管通道体积）以估算实验所需的血管ECM包被溶液的体积：
所需体积 = （芯片数量 × 20） µL
注意：建议额外准备15%的体积，以弥补实验误差。 - 为所有芯片制备血管ECM包被溶液（例如， 300 µL 每12个芯片使用冰冷的PBS或HBSS。
注意：请参阅补充材料部分中的特定器官实验方案表格（补充表 1 用于皮肤； 补充表2 用于肺泡； 补充表 2 用于气道，以及 补充表4 以确定肠道等组织的特定试剂和推荐的细胞外基质（ECM）组成。 - 移液器 20 µL 将血管ECM包被溶液加入每枚芯片的血管通道中。
- 将实验所需的芯片数量乘以 20 µL （血管通道体积）以估算实验所需的血管ECM包被溶液的体积：
- 用细胞外基质蛋白包被基质类似物的顶端表面
- 将实验所需的芯片数量乘以 50 µL （血管通道的体积）以估算实验所需的上皮细胞外基质包被溶液的体积：
所需体积 = （芯片数量 × 50） µL
注意：建议额外准备15%的体积，以弥补实验误差。 - 为所有芯片准备足量的ECM包被溶液（例如， 750 µL 每12个芯片用冰冻的PBS或HBSS处理并转移 50 µL 将上皮细胞外基质（ECM）包被溶液直接加在水凝胶表面。
注意：请参阅补充材料部分中的特定器官实验方案表格（补充表 1 用于皮肤； 补充表 2 用于肺泡； 补充表 2 用于气道，以及 补充表 4 针对肠道）以确定特定试剂和推荐的细胞外基质（ECM）组成。 - 将芯片分组放入不同的培养皿中，并在每个培养皿中放置一个装有2 mL无菌ddH₂O的离心管15 mL锥形管盖2每个培养皿中加入 O，并将培养皿置于培养箱中孵育 37 °C，5% CO₂2 在进行上皮细胞接种前孵育2 h。
- 将实验所需的芯片数量乘以 50 µL （血管通道的体积）以估算实验所需的上皮细胞外基质包被溶液的体积：
5. 在基质等效物上接种上皮细胞
- 上皮细胞培养
- 按照供应商的指导培养组织特异性上皮细胞，直至细胞融合度达到80%–90%。
- 根据细胞供应商的建议，使用蛋白水解酶方法解离细胞。
注意：为获得最佳效果，应在细胞处于活跃生长期且融合度介于70%–90%时，以低代次（P1–P2）收获上皮细胞。 - 解离后，离心细胞并收集细胞沉淀。
- 将上皮细胞重悬至特定器官实验方案表格中指定的适当细胞/片段密度。
注意：本研究中，皮肤使用细胞悬液密度为 3 x 106 个细胞/mL，肺泡为 1 x 106 个细胞/mL，气道为 6 x 106 个细胞/mL，肠道为 8 x 106 个片段/mL。
- 上皮细胞接种
- 将芯片从培养箱转移至生物安全柜中。吸除血管通道中的包被溶液，并用50 µL新鲜内皮细胞培养基对血管微流控通道冲洗三次。
- 吸除水凝胶表面的包被溶液，并用100 µL新鲜上皮细胞培养基对基质表面冲洗三次，以去除多余的包被溶液。
- 吸除上升的培养基，然后根据补充表格中指定的适当细胞密度，向水凝胶表面接种50 µL上皮细胞悬液，随后将芯片放回培养箱中孵育2小时（结肠类器官可过夜孵育）。
- 用细胞培养基轻轻冲洗水凝胶表面两次，以去除细胞碎片。最后，通过在密封的可高压灭菌容器中进行高压灭菌来更新培养基，并将芯片连接至蠕动泵。
6. 将芯片连接至流体系统
- 准备流体部件
- 剪取2英寸的生物相容性聚丙烯基热塑性弹性体（TPE）转移管（材料表），用于制备连接芯片与培养基储液槽所需的短微流控管路。
- 剪取7.5英寸的生物相容性TPE转移管以制备长微流控管路。
- 准备好足够数量的18 G和19 G金属连接头（材料表）。
注：建议至少在将Open-Top芯片连接至蠕动泵前1天，完成步骤6.1.1和6.1.2中所述管路和连接头的准备与灭菌。 - 使用4英寸的皮下注射针头（材料表）在每个培养基储液槽的盖子上穿孔。
- 培养基脱气
- 使细胞培养基平衡至室温（RT）。
- 将所需体积的培养基转移至锥形滤膜管中。
- 施加-20 PSI的负压真空以对培养基进行脱气（真空驱动过滤）。
注：若无真空条件，可将细胞培养基置于培养箱中过夜平衡，以达到类似效果。
- 为Open-Top芯片建立流体流动做准备
- 将芯片和无菌流体部件移至生物安全柜内，在开始流体流动前，对齐Open-Top芯片的盖子（上部）以密封Open-Top芯片原型。
- 吸取200 µL脱气后的细胞培养基（见器官特异性表格），分别加入芯片的上通道和下通道的进样口，注意避免产生气泡。
- 向短微流控管路中加入300 µL培养基以润洗管路内表面，并将短管路连接至芯片上、下通道的进样口。
- 连接并润洗微流控表面
- 将培养基储液槽放入培养架中，将皮下注射针连接至芯片的底部进样口，最后将所有芯片安置于培养箱内的承载盒中。
- 将芯片连接至蠕动泵，然后检查所有连接头，确保所有芯片均已正确连接，且无细胞培养基可见泄漏。
- 按下泵上的冲洗 按钮，持续约15秒，或直至流出管末端出现培养基液滴为止。
- 使用泵的控制系统设定相应的器官芯片流速（图2、图3、图4和图5）。
7. 器件的维护
- 器官芯片的维护
- 为上皮和/或内皮准备新鲜的细胞培养基，并执行脱气步骤（如之前第6.2步所述）。
- 暂停蠕动泵，小心地将芯片从泵上断开，并取出芯片外壳载体。将芯片从培养箱转移至生物安全柜中，并移除储液池中残留的培养基体积。
- 用5 mL新鲜细胞培养基替换顶部和底部入口储液池中的培养基，并将芯片外壳载体放回培养箱。将芯片重新连接至蠕动泵并恢复流体流动。
注意：建议使用Purge功能快速更新血管腔室中的培养基，以减少气泡产生的风险。 - 每隔一天重复步骤7.1.1–7.1.3，具体参见图2、图3、图4和图5。
- 建立气液界面（ALI）
- 暂停蠕动泵，小心地将芯片从泵上断开，并取出芯片外壳载体。将芯片从培养箱转移至生物安全柜中，并移除顶部储液池中残留的培养基体积。
- 轻柔吸出顶部微流控通道中的全部培养基，并使用长尾夹夹紧连接至顶部入口的短微流管，以减少培养基蒸发并维持气液界面。
- 将开放式顶部芯片放回外壳载体中，重新放入培养箱，并将芯片重新连接至蠕动泵。
注意：建议使用Purge功能快速更新血管腔室中的培养基，以减少气泡产生的风险。 - 启动蠕动泵以恢复流体流动。
- 拉伸（可选）
- 暂停蠕动泵，并使用每个芯片两条长微流管将芯片的真空端口连接至真空模块。
- 使用真空模块将拉伸设置调整为各器官推荐的条件，具体参见各器官操作规程表：补充表1（皮肤）；补充表2（肺泡）；补充表2（气道）；以及补充表4（肠道）。
- 目视检查管路连接，确保所有芯片均已正确连接，且无可见的培养基液滴渗漏。
- 启动蠕动泵以恢复流体流动。
8. 在血管区室中接种内皮细胞
- 准备细胞和芯片用于血管细胞接种
- 按照供应商的指导培养组织特异性内皮细胞，直至细胞融合度达到80%-90%。使用蛋白水解酶法（按供应商建议）将细胞解离，最后将内皮细胞重悬于浓度为3 × 106 个细胞/mL的溶液中。
注意：为获得最佳效果，应在细胞处于活跃生长期且融合度介于70%-90%时，以低代次（P2-P4）收获内皮细胞。 - 暂停蠕动泵。将芯片从培养箱转移至生物安全柜，断开芯片与培养基储液槽及所有连接管路的连接，然后将芯片分组放入不同的培养皿中。
- 用新鲜的上皮细胞培养基更换上皮腔室的培养基。用新鲜的内皮细胞培养基冲洗血管通道两次，然后吸除血管腔室中的培养基。
- 按照供应商的指导培养组织特异性内皮细胞，直至细胞融合度达到80%-90%。使用蛋白水解酶法（按供应商建议）将细胞解离，最后将内皮细胞重悬于浓度为3 × 106 个细胞/mL的溶液中。
- 内皮细胞接种
- 向底部（血管）通道加入25 µL内皮细胞悬液（3 × 106 个细胞/mL），将芯片倒置，使内皮细胞附着于微流控腔室的上表面。
注意：每片芯片加入50 µL细胞悬液（12片芯片共需600 µL）。 - 将芯片分组放入培养皿中，放回37 °C、5% CO2的培养箱中，使内皮细胞贴壁1小时。
- 1小时后，将芯片从培养箱转移至生物安全柜。用内皮细胞培养基冲洗血管通道两次，以去除细胞碎片。
- 重复步骤8.2.1-8.2.2，再次向血管通道接种内皮细胞，并将芯片平放，以促进内皮细胞贴附于血管通道的底面。
- 向底部（血管）通道加入25 µL内皮细胞悬液（3 × 106 个细胞/mL），将芯片倒置，使内皮细胞附着于微流控腔室的上表面。
- 将芯片重新连接至流体系统
- 在生物安全柜中，用脱气的血管细胞培养基填充血管培养基储液槽。
- 将芯片重新放回芯片承载架中，并将芯片一端连接至培养基储液槽，另一端连接至蠕动泵。
注意：建议使用冲洗功能快速更新血管腔室的培养基，以降低气泡风险。 - 目视检查微流控连接，确保所有芯片均已正确连接，且无可见的培养基液滴渗漏。然后启动蠕动泵，恢复液体流动。
9. 常用终点检测方法
- 终止实验时断开芯片连接
- 暂停蠕动泵，小心地将芯片从泵上断开，并取出芯片外壳载体。将芯片外壳载体从培养箱转移至生物安全柜中，并释放芯片。
- 用上皮细胞培养基轻轻冲洗Open-Top芯片的中央腔室，用内皮细胞培养基冲洗血管通道，各冲洗两次，以去除任何细胞碎片。
- 使用镊子取下Open-Top芯片的盖子，以接触芯片的顶端腔室。
- 荧光显微镜用免疫染色
- 进行常规样本固定、通透和封闭。
注：本研究中，样本在200 µL的4%多聚甲醛（PFA）中固定1小时，随后用PBS冲洗，在0.1% Triton X-100中通透40分钟，并在1%牛血清白蛋白中封闭1小时。 - 将芯片与一抗（材料表）在4 °C下孵育过夜，然后用200 µL PBS对芯片的上皮和内皮腔室各冲洗两次。随后加入相应的二抗孵育2小时。
注：将一抗和二抗用PBS + 1% BSA稀释，稀释比例分别为1:100（一抗）和1:200（二抗）。
- 进行常规样本固定、通透和封闭。
- 免疫组织化学
- 使用镊子从Open-Top芯片的主腔室中取出基质等效物，收集至含有10%中性缓冲福尔马林的1.5 mL离心管中，孵育至少24小时。
- 将固定的基质等效物转移至组织处理仪，并按以下步骤进行最佳脱水处理。
- 将水凝胶浸入70%乙醇中90分钟。
- 移除70%乙醇，将水凝胶浸入80%乙醇中90分钟。
- 移除80%乙醇，将水凝胶浸入95%乙醇中90分钟。
- 移除95%乙醇，将水凝胶两次浸入100%乙醇中，每次90分钟。
- 移除100%乙醇，将水凝胶两次浸入二甲苯溶液中，每次120分钟。
- 移除二甲苯溶液，将处理后的基质等效物两次浸入石蜡中，每次约120分钟（~2小时）。
- 将浸透的基质等效物包埋于切片用石蜡块中。
- 此时，可使用切片机将基质等效物按石蜡包埋组织的标准方法进行切片，并根据常规组织学技术进行后续处理26。
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结果
表面微图案化
细胞外基质（ECM）的微图案化技术可用于复现肠道隐窝界面的空间构型。开放式芯片构型可经改造，整合专门设计的微图案化印模，以模拟结肠上皮-基质界面的天然拓扑结构。图 6A，) 以及微米尺度的肠隐窝图 6C-E请注意，我们为皮肤、气道和肺泡模型使用了平坦（非图案化）表面。在此案例中，使用印章是为了获得均匀的水凝胶表面以接种上皮细胞。我们选择了一种能够模拟人类肠黏膜自然结构的设计，该设计由模拟肠隐窝的正负交替穹顶结构组成。
器官模型
我们使用开放式芯片原型培养并分化了四种不同的上皮组织（皮肤、肺泡、气道和肠道），以验证这一仿生平台。'其多功能性。器官芯片的组织学切片证实了上皮细胞的存在，这些细胞在表型上具有独特性，并分别代表了：皮肤中的复层上皮、
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讨论
Open-Top芯片是一种能够在受控微环境中实时研究内皮、间质与上皮之间复杂细胞相互作用的赋能平台。该技术相较于传统的器官型培养和类器官培养具有关键优势，例如整合了与重建人体组织微环境相关的物理和生化信号，包括流体剪切力（流动）、周期性拉伸，以及实现上皮表面拓扑结构的重建 通过 微图案化。在此平台内生长的人类细胞协同作用，以重现可被分析的组织特异性功能 通过 传统技术，包括免疫组织化学以及利用顶部和/或底部腔室流出液（或渗出液）进行的生化检测。当前的设计可便捷地接触上皮层，细胞在此直接与组织特异性成纤维细胞及其他基质细胞接触生长，模拟上皮组织的多细胞结构。值得注意的是，开放式芯片原型为解决其他类器官芯片平台应用中常见的挑战提供了可行方案。它不仅能够在基质腔室中整合多种不同类型的细胞，从而构建出高度复杂的三维组织，还允许轻松地将已形成的组织构建物从芯片装置中取出，用于后续分析，包括传统的H&E染色。
当前设计存在一些局限性。例如，原型开放式器官芯片中位于血管微通道与基质区室（水凝胶）之间的弹性膜明显更厚（≈ 50 µm...
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披露
作者声明存在以下财务利益/个人关系，这些利益或关系可能被视为潜在的竞争利益：Varone Antonio 曾是 Emulate 公司的员工，可能持有 Emulate 公司的股权。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 10x EMEM | Lonza | 12-684F | 培养基；间质 |
| 18号针头 | 微群组 | 316H18RW | 不锈钢316焊接管，18RW全硬 |
| 19 号针头 | 微群组 | 316H19RW | 不锈钢316焊接管，19RW全硬 |
| 2-Stop PharMed BPT | Cole-Palmer | EW-95723-12 | 管，0.25 mm，12个/包 |
| 70% 乙醇和擦拭纸 | - | - | 用于表面灭菌 |
| 8-溴腺苷 3′,5′8-溴-环单磷酸腺苷钠盐 | Sigma | B7880 | 培养基添加剂 |
| A-83-01 | Tocris | 2939 | |
| 腺嘌呤 | Sigma | A9795 | |
| 高级DMEM/F12 | 赛默飞世尔科技 | 12634010 | |
| 气道上皮细胞 | Lifeline Cell Technology | FC-0016 | |
| 铝箔 | - | - | - |
| 肺泡细胞 | 细胞生物技术 | H6621 | |
| 抗ABCA3 | ABCAM | ab24751 | 小鼠单克隆抗体 [3C9] |
| 抗水通道蛋白5 Alexa Fluor 647 | ABCAM | ab215225 | 兔单克隆抗体 [EPR3747] |
| 抗水通道蛋白5 | ABCAM | ab92320 | 兔单克隆抗体 [EPR3747] |
| 抗βIV微管蛋白 | ABCAM | ab11315 | 小鼠单克隆抗体 [ONS.1A6] |
| 抗CD31（PECAM-1） | ABCAM | ab9498 | 小鼠单克隆 [JC/70A] 抗体 |
| 抗-CK5 | ABCAM | ab75869 | 兔重组单克隆抗体 [AY1E6] |
| 抗细胞角蛋白10 | ThermoFisher | MA5-13705 | 小鼠单克隆抗体（DE-K10） |
| 抗细胞角蛋白14 | ABCAM | ab7800 | 小鼠单克隆抗体 |
| 抗E-钙黏蛋白 | ABCAM | ab1416 | 小鼠单克隆抗体 |
| 抗丝聚蛋白 | ThermoFisher | PA5-79267 | 兔多克隆抗体 |
| 抗-HTI-56 | Terrace Biotech | TB-29AHT1-56 | 小鼠单克隆抗体（IgG1） |
| 抗-HTII-280 | Terrace Biotech | TB-27AHT2-280 | 小鼠单克隆抗体（IgM） |
| 抗兜甲蛋白 | ThermoFisher | MA5-11803 | 小鼠单克隆抗体（SY5） |
| 抗-TAp63 亚型α, -β, -γ | 生物工程 | 618902 | 兔多克隆抗体 |
| 抗 Ki67 | ABCAM | ab8191 | 小鼠单克隆抗体 [B126.1] |
| 抗LAMP3 | ABCAM | ab111090 | 兔多克隆抗体 |
| 抗成熟SP-B | Seven Hill | WRAB-48604 | 兔多克隆抗体 |
| 抗 MUC5AC | ThermoFisher | PA5-34612 | 兔多克隆抗体 |
| 抗黏蛋白-2 | SantaCruz Biotechnology | sc-7314 | 小鼠单克隆抗体（IgG1） |
| 抗 p63 | Dako | GA662 | 小鼠单克隆抗体 p63 蛋白（Dako Omnis） 克隆 DAK-p63 |
| 抗PCNA | ThermoFisher | PA5-32541 | 兔多克隆抗体 |
| 抗足蛋白（AT-1）α) | ABCAM | ab128994 | 兔多克隆抗体 |
| 抗Pro + 成熟表面活性蛋白B | ABCAM | ab40876 | 兔多克隆抗体 |
| 抗表面活性剂C | Seven Hill | WRAB-9337 | 兔多克隆抗体 |
| 抗泌尿球蛋白/SCGB1A1 | Hycult Biotech | HM2178 | 小鼠单克隆抗体 [AY1E6] |
| 抗VE-钙黏蛋白 | ABCAM | ab33168 | 兔多克隆抗体 |
| 抗ZO-1 | ThermoFisher | 33-9100 | 小鼠单克隆抗体 [1A12] |
| 抗坏血酸 | Sigma | A4544 | |
| 移液管吸液 | Corning / Falcon | 357558 | 2 mL，聚苯乙烯，独立包装 |
| 吸液头 | - | - | 无菌（高压灭菌） |
| B27 | 赛默飞世尔科技 | 17504044 | |
| PBS 溶液中的封闭剂 BSA（10X） | ThermoFisher | 37525 | 阻断剂 |
| 氯化钙 | Sigma | C7902 | |
| CHIR 99021 | Tocris | 4423 | |
| I 型胶原蛋白 | Advanced Biomatrix | 5133 | 10 mg/mL（基质） |
| I 型胶原蛋白 | Advanced BioMatrix | 5005 | 3 mg/mL（血管ECM） |
| IV型胶原蛋白 | Sigma | C5533 | |
| IV型胶原蛋白 | Sigma | C5533-5MG | 人胎盘胶原蛋白，5 mg 粉末，重悬至 1 mg/mL |
| 结肠成纤维细胞 | 细胞生物技术 | H6231 | |
| 结肠微血管内皮细胞 | 细胞生物技术 | H6203 | |
| 锥形管 | - | - | 15 mL 和 50 mL 聚丙烯，无菌 |
| 交联剂（ER-1） | Emulate | 10461 | 5 mg 粉末 |
| DAPI（4',6-二脒基-2-苯基吲哚，双乳酸盐） | ThermoFisher | D3571 | DNA探针 |
| 真皮成纤维细胞 | ATCC | PCS-201-010 | |
| 真皮微血管内皮细胞 | ATCC | CRL-3243 | |
| 地塞米松 | Sigma | D4902 | |
| DMEM | ThermoFisher | 11054020 | |
| DMEM/F-12 | GIBCO | 11320082 | |
| DMEM/F-12，GlutaMAX | GIBCO | 10565-018 | 气液界面培养基的基础培养基 |
| 驴抗小鼠 IgG H&L（Alexa Fluor 488） | ABCAM | ab150105 | 驴抗小鼠二抗 |
| 驴抗小鼠IgG H&L（Alexa Fluor 568） | ABCAM | ab175472 | 驴抗小鼠二抗 |
| 驴抗小鼠 IgG H&L（Alexa Fluor 647） | ABCAM | ab150107 | 驴抗小鼠二抗 |
| 驴抗兔IgG H&L（Alexa Fluor 488） | ABCAM | ab150073 | 驴抗小鼠二抗 |
| 驴抗兔IgG H&L (Alexa Fluor 568) | ABCAM | ab175470 | 驴抗小鼠二抗 |
| 驴抗兔IgG H&L（Alexa Fluor 647） | ABCAM | ab150075 | 驴抗小鼠二抗 |
| 杜尔贝科’s PBS（DPBS-/-）（不含 Ca²⁺、Mg²⁺） | 康宁 | 21-031-CV | 1x |
| 表皮生长因子（EGF）人源，大肠杆菌重组表达 | PromoCell | C-60170 | 培养基添加剂 |
| F-12 Ham’s | Invitrogen | 21700-108 | 对于血管ECM |
| FibriCol | Advanced BioMatrix | 5133-20ML | I型胶原溶液（10 mg/mL） |
| 纤连蛋白 | 康宁 | 356008 | |
| 人源天然纤连蛋白 | 康宁 | 47743-654 | 人血浆纤连蛋白 |
| 精细尖头精密镊子 | Aven | 18056USA | Technik Style 5B-SA 精密不锈钢镊子 |
| Glutamax | Invitrogen | 21700-108 | |
| Glutamax | Invitrogen | 35050061 | |
| 山羊抗小鼠IgG H&L（Alexa Fluor 594） | ABCAM | ab150080 | 山羊抗小鼠二抗 |
| 山羊抗小鼠IgG H&L（Alexa Fluor 647） | ABCAM | ab150115 | 山羊抗小鼠二抗 |
| 山羊抗小鼠IgG H&L（FITC） | ABCAM | ab6785 | 山羊抗小鼠二抗 |
| 山羊抗小鼠 IgG1 Alexa Fluor 568 | ThermoFisher | A-21124 | 山羊抗小鼠 IgG1 二抗 |
| Alexa Fluor 488 标记的山羊抗小鼠 IgM | ThermoFisher | A-21042 | 山羊抗小鼠 IgM 二抗 |
| 手持式真空吸引器 | 康宁 | 4930 | - |
| 热灭活 HyClone FetalClone II 血清（FCS） | GE Healthcare Life Sciences | SH30066.03 | |
| 血细胞计数板 | - | - | - |
| 猪肠黏膜来源肝素钠盐 | Sigma | H3149 | |
| HEPES | 赛默飞世尔科技 | 15630080 | |
| 人 [Leu15] - 胃泌素 | Sigma | G9145 | |
| 人结肠类器官 | 来自临床切除样本 | 来自临床切除样本 | |
| 人EGF重组蛋白 | 赛默飞世尔科技 | PHG0311L | |
| 人表皮生长因子 | 赛默飞世尔科技 | PHG0311 | |
| HyClone FetalClone II 血清（U.S.） | GE Healthcare | SH30066.02HI | 无菌 FBS 热灭活 |
| 氢化可的松-21-半琥珀酸钠盐 | Sigma | H4881 | |
| 氢化可的松 | PromoCell | C-64420 | 培养基添加剂 |
| 冰桶 | - | - | - |
| Ismatec IPC-N | Cole-Palmer | EW-78000-41 | 低速数字蠕动泵；q24-通道（每12个芯片配1个） |
| ITES | BioWhittaker | 17-839Z | |
| 角质形成细胞生长因子（KGF），又称碱性成纤维细胞生长因子7（FGF-7），人源，HEK中重组表达 | PromoCell | C-63821 | |
| 角质形成细胞 | ATCC | PCS-200-010 | |
| 层粘连蛋白 | Biolamina | CT521-0501 | |
| 层粘连蛋白521 CTG（CT521） | Biolamina | CT521-0501 | 人重组层粘连蛋白521 |
| 肺成纤维细胞 | 细胞生物技术 | H6013 | |
| 肺成纤维细胞 | Lifeline Cell Technology | FC-0049 | |
| 肺微血管内皮细胞 | Lonza | CC-2527 | |
| 肺平滑肌细胞 | Lifeline Cell Technology | FC-0046 | |
| 手动计数器 | - | - | - |
| Masterflex（TPE）转移管 | Cole-Palmer | FV-96880-02 | PharMed BPT，1/32" ID x 5/32" 光密度 |
| 199培养基，无酚红 | 赛默飞世尔科技 | 11043023 | |
| 微量离心管 | - | - | 1.5 mL，无菌 |
| 显微镜（带相机） | - | - | 用于明场成像 |
| N2 | Sigma | 17502001 | |
| N-乙酰半胱氨酸 | Sigma | A5099 | |
| Noggin（HEK293T 条件培养基） | Sigma | N17001 | |
| 正常山羊血清 | ThermoFisher | 50062Z | 封闭液 |
| O-磷酸丝氨酸乙醇胺 | Sigma | P0503 | |
| 多聚甲醛（4% 质量/体积） | EMS | 15710 | 固定剂 |
| 青霉素-链霉素 | GIBCO | 15140122 | |
| 青霉素-链霉素 | Sigma | P4333 | 10,000 U/mL；10 mg/mL |
| 移液器吸头 | - | - | P20、P200 和 P1000 无菌，低黏附 |
| 移液器 | Gilson | F167380 | P20、P200 和 P1000 |
| PluriQ 血清替代物（或替代的 KO 血清替代物） | AMSBIO（或 Thermo） | N/A（或 C1910828010） | |
| 聚-L-赖氨酸包被的显微镜玻片 | Sigma | P0425 | 载玻片 |
| Primocin | InvivoGen | ant-pm-1 | |
| 孕酮 | Sigma | P8783 | |
| ProLong Gold | ThermoFisher | P36931 | 含DAPI的抗荧光淬灭封片剂 |
| 视黄酸 | Sigma | R2625 | |
| ROCK抑制剂（Y27632） | Tocris | TB1254-GMP/10 | |
| R-spondin（HEK293T 条件培养基） | Sigma | SCC111 | |
| SAGM SingleQuots 补充剂 | Lonza | CC-4124 | |
| SAGMTM 小气道上皮细胞生长培养基 BulletKitTM | Lonza | CC-4124 | 培养基添加剂 |
| SB2001190 | Tocris | 1264/10 | |
| 血清移液管 | - | - | 2 mL、5 mL、10 mL 和 25 mL 低内毒素、无菌 |
| 小气道上皮细胞生长培养基（SAGM） | Lonza | CC-4124 | |
| 溶剂缓冲液（ER-2） | Emulate | 10462 | 25 mL 瓶 |
| Steriflip-HV | Millipore | SE1M003M00 | 无菌过滤锥形管 |
| Sterilin 100 mm 方形培养皿 | 赛默飞 | 103 | 无菌，每6个芯片1个 |
| T25 培养瓶 | - | - | - |
| T75 培养瓶 | - | - | - |
| 三碘甲状腺原氨酸 | Sigma | T5516 | |
| Triton X-100（0.3%（vol/vol）） | Sigma | T8787 | 通透化试剂 |
| 台盼蓝 | Sigma | 93595 | 0.4% 溶液 |
| TrypEE溶液 | Sigma | 12604013 | 细胞解离溶液 |
| TWEEN-20 | Sigma | P2287 | 透化剂 |
| 紫外光烘箱（峰值频率 365nm，强度 100 µJ/cm2) | VWR | 21474-598 | UVP，长波紫外，365 nm 60 Hz 型号 CL-1000L |
| 真空装置 | - | - | 最低压力：-70 kPa |
| 血管内皮生长因子165（VEGF-165）人源，大肠杆菌重组表达 | PromoCell | C-64420 | |
| VEGF-165 | PromoCell | C-64420 | 培养基添加剂 |
| FITC 标记的血管性血友病因子 | ABCAM | ab8822 | 羊多克隆抗体 |
| 水浴（或微珠） | - | - | 设为 37 °C |
| Wnt3A（L-Wnt3A 条件培养基） | ATCC | CRL-2647 |
参考文献
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