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发育的特点是细胞器、细胞和器官水平上结构的动态变化。延时成像能够从生理条件下的同一结构中收集四维信息，使其成为研究动态发育过程的理想技术1,2,3,4,5,6。通过实时成像收集的大量数据也能够对发育进行定量分析。尽管延时成像已更广泛地用于单层细胞培养，但由于技术困难，三维活组织或动物的成像更具挑战性，例如活组织的光散射、开发适当的安装策略和标记方法、在广泛的成像期间保持正常的生理状态、合适的显微镜的可及性、 等。这些挑战限制了许多实验室对实时成像的使用。在该方法集中，有七篇论文报告了活体样品制备、标记和基于激光作的新方法。所有这些方法都有助于从不同角度对发育过程进行实时成像。
由于活组织的强烈散射，深部区域的直接成像在技术上具有挑战性。通过解剖暴露内脏器官，可以最大限度地减少这种散射，从而提高图像的空间分辨率。在本集中，Januschke 和 Loyer7 描述了一种解剖 果蝇 幼虫大脑的方案以及使用纤维蛋白凝块的安装方法。这种安装策略允许在同一培养皿上使用倒置显微镜对多个样品进行延时成像，因为它只需要添加纤维蛋白原和凝血酶。Li和Luo8 提出了一种从苍蝇蛹中解剖触角脑外植体的方案，以及维持嗅觉回路正常发育24小时的 离体 培养条件。他们的系统能够从苍蝇嗅觉回路的生理状态可视化苍蝇嗅觉回路组装中的轴突和树突靶向。该外植体系统适用于双光子显微镜和晶格光片显微镜，具有自适应光学成像，可在短时间内实现长期连续成像和高时空分辨率的快速成像。Schramm 等人 9 开发了一种微创外科手术，通过微剥离去除斑马鱼的皮肤和软颅软骨。这使他们能够在发育后期观察到一些关键事件，包括神经元分化、成熟、可塑性和受精后长达 30 天的 Ca2+ 瞬态。它还允许他们在斑马鱼幼虫皮肤色素沉着后进行实时成像。除了解剖之外，样品的适当安装对于实时成像也至关重要。Ratke等人10 提出了一个实验框架，用于使用光片显微镜对多个苍蝇胚胎进行同时实时成像。该协议提高了整体通量，是比较研究的理想选择。
除了样品制备之外，新的标记方法还有助于可视化活组织中的特定结构。Terzi等人11 报道了一种遗传编码的H2O2特异性生物传感器roGFP2-Orp1，用于在发育过程中对培养斑马鱼神经元和整个幼虫的细胞内H2O2 水平进行成像。这种基因编码的H2O2 生物传感器的一个重要优势是提高了H2O2 检测的时间和空间分辨率。Mutlu等人12 的另一项研究描述了受激拉曼散射（SRS）显微镜，这是一种无标记的化学成像方法，用于以亚细胞分辨率快速定量检测活细胞中的脂质。H2O2 和脂质在样品固定过程中都很容易丢失。活组织中标记或成像方法的发展不仅规避了这一挑战，而且在生物过程中保留了这些结构的空间和时间信息。
最后，光也可用于细胞消融。Boutillon 等人 13 展示了一种使用双光子显微镜消融斑马鱼深部和空间明确体积的方法。与基于紫外激光的细胞消融相比，双光子激光提高了轴向分辨率和组织穿透力。该协议提供了一种扰动策略来研究开发过程中的细胞间相互作用。
微观技术的进步使我们能够从四个维度上了解许多发育过程。该集合中的协议将帮助更多科学家克服不同生物系统中实时成像的技术障碍。我们预计未来将开发更多促进实时成像的方法。