蛋白质稳态或蛋白质稳态是细胞和生物体健康的基础 1,2。保守的细胞过程通过影响蛋白质合成、折叠和清除来合作维持正确折叠的蛋白质组 3,4。蛋白质稳态的扰动与与年龄相关的神经退行性疾病和癌症有关 5,6。基于高度的保护，线虫秀丽隐杆线虫（秀丽隐杆线虫）等模式生物在理解蛋白质稳态在人类健康和疾病中的作用方面发挥了重要作用7,8。秀丽隐杆线虫具有许多使其成为理想实验模型的特征，包括生命周期短、角质层透明以及易于化学和基因作9。该方法集合提供了详细的方案来监测秀丽隐杆线虫分子、细胞和生物体水平的蛋白质稳态失衡。
细胞通过激活各种应激反应来响应蛋白质稳态的破坏，包括热休克反应（HSR）、未折叠蛋白反应（UPR）和氧化应激反应（OxSR）以重新调整细胞蛋白质组10。为了提高该领域的可重复性，Golden及其同事描述了HSR稳健诱导的标准化实践11。RT-qPCR是一种广泛使用的灵敏方法，通过量化mRNA来分析基因表达，该测定可用于测量各种热休克诱导基因的细胞mRNA水平11。为了将这种方法扩展到大规模、高通量分析，Chauve等人12描述了一种用于cDNA制备的新适应，与稳健且高度灵敏的纳米流体RT-qPCR平台相结合。可以在单个蠕虫或散装样品12上进行基因表达的精确测量。推荐的应激反应基因靶标以及用于测量应激反应基因转录上调的引物对列在相应的方案12,13中。
使用 RT-qPCR 评估应激反应激活的一个局限性是它可能成本高昂、技术困难，并且需要使用专门的设备。因此，在应激诱导启动子（例如，用于监测HSR的hsp-16.2p：：gfp）下表达荧光蛋白的通路特异性转录报告基因菌株经常用于评估细胞应激反应11。Okkenhaug 及其同事使用名为 Worm-align 的简单开源斐济工作流程与 CellProfiler 管道Worm_CP相结合，概述了14 个快速量化单个蠕虫荧光的步骤。此外，Bar-Ziv等人13描述了一种使用大颗粒流式细胞仪的高通量方法，该方法能够捕获数千只动物的荧光强度，大小和空间（2D）分布。提供了有关用于评估细胞应激反应激活的转录报告基因的信息，以及使用蠕虫生物分选机进行荧光显微镜和定量的推荐设置13。重要的是，这些报告基因可以与特定的生理应激生存测定配对，以监测特定应激方案后动物的健康状况11,13。尽管荧光报告基因具有揭示组织特异性差异的优势，但它们只能检测到高于某个阈值的诱导，并且某些荧光团（例如 GFP）的稳定性排除了基因表达动态变异的检测。此外，大多数生理测定非常耗时，因此可扩展性有限。尽管有这些局限性，但这些方法可以全面表征内部和外部压力源的细胞和生理影响。
慢性蛋白质毒性扰动与蛋白质稳态网络 （PN） 的崩溃有关，蛋白质稳态网络是负责维持功能性蛋白质组的质量控制机制 5,6。蛋白质稳态的进行性下降与许多与年龄相关的疾病有关。秀丽隐杆线虫是一个很好的模型系统，可以检查特定组织对蛋白质稳态失败的脆弱性。Lazaro-Pena 等人 15 描述了一种随着蠕虫衰老监测体壁肌肉或神经元功能的方法。这种方法可以适用于更高通量的遗传分析或药物筛选15。主要挑战是了解体内 PN 的各个组分之间的相互作用是如何工作的。为了解决这一缺点，Dror及其同事 16 开发了一种系统来收集有关分子伴侣（PN 的关键成分）在发育和衰老过程中特定组织中相互作用的特定信息。通过将折叠平衡的组织特异性扰动与可用的突变体或转基因菌株耦合，使 RNAi 能够对靶基因进行组织特异性沉思，可以检查给定组织中的伴侣网络。通过评估特定组织或细胞类型的功能的简单行为测定来补充该策略，可以揭示体内PN的生物学相关相互作用15,16。重要的是要认识到，一种组织或细胞类型的蛋白质稳态失衡可能会以细胞非自主方式影响其他组织的质量控制系统。Miles 和 van-Oosten-Hawle17 描述了一种使用组织特异性 RNAi 方法结合一系列应激报告基因和蛋白质稳态传感器17 来识别细胞非自主 PN 机制和成分的方法。该策略允许检查由于细胞非自主激活应激反应机制而导致的不同组织中的 PN 能力。
秀丽隐杆线虫通常用于模拟由聚谷氨酰胺重复扩增突变引起的与年龄相关的神经退行性疾病，例如亨廷顿病18。大量使用的蛋白质稳态传感器是聚谷氨酰胺 （polyQ） 片段与荧光蛋白融合，根据 polyQ 长度和年龄 19 在体内形成病灶。提高生物试验、个体之间和实验室之间的可重复性，需要定义被评分为病灶的内容。Lazaro-Pena等人15描述了一种在衰老过程中准确测量神经元或体壁肌肉内polyQ：：YFP病灶形成的策略。为了监测具有聚谷氨酰胺扩增的易聚集突变亨廷顿蛋白的周转率，Pigazzini 和 Kirstein20 描述了一种需要使用光可转化荧光团 Dendra2 的无创技术。使用共聚焦显微镜和表达突变亨廷顿蛋白与Dendra2融合的秀丽隐杆线虫菌株，可以监测和量化这种易聚集蛋白质在衰老生物体中的降解20。为了量化易聚集蛋白（如突变亨廷顿蛋白）的淀粉样蛋白纤维化，可以采用荧光寿命成像显微镜（FLIM）21。FLIM通过监测淀粉样蛋白结构附近的荧光团的猝灭，实现对聚集过程的无创分析，从而缩短荧光寿命21。荧光寿命与融合淀粉样蛋白的聚集呈负相关，并且与荧光团表达水平无关。该技术使研究人员能够跟踪衰老和 PN 损伤对任何蛋白质聚集倾向的影响。然而，如果荧光团的强度较低，这可能会成为问题，因为 FLIM 需要采集相对较多的光子。因此，需要更高的激发激光功率，从而导致更快的光漂白和不可靠的衰减曲线。此外，该技术需要复杂且昂贵的设备作为现有显微镜系统的附加组件。对于不同的方案，包括一种重要的标准化方法，用于研究与包含重复扩增的 RNA 相关的重复相关非 AUG 依赖性 （RAN） 翻译。由于 RAN 翻译不需要起始密码子来确定阅读框，因此可能与疾病相关的有毒肽的数量会增加。Rudich 及其同事22 详细介绍了如何使用秀丽隐杆线虫的运动和繁殖来量化 RAN 肽的毒性。
蛋白质稳态的不平衡导致蛋白质错误折叠和蛋白质聚集体的积累，这些聚集体与多种与年龄相关的神经退行性疾病有关 5,6。表达与荧光报告基因融合的各种易聚集蛋白的秀丽隐杆线虫菌株已被用于监测不同细胞和组织类型的蛋白质稳态失衡。对这些模型的分析导致了一系列新的观察结果;Monica Driscoll 及其同事注意到，神经元在“外窥器”中释放 PolyQ 聚集体和其他细胞碎片，例如受损的细胞器，揭示了以前未被识别的神经元蛋白质稳态分支23。由于这是一种新现象，因此提供监测外射体生产的明确说明以确保现场内的可重复性至关重要。Arnold等人24概述了秀丽隐杆线虫的物理特征，其检测策略，识别标准和定量的最佳时机。此外，该协议强调了严格控制生长条件所需的关键关注，以消除可以调节外出物水平的意外应力，从而实现对外出物产量的可重复评估。
该集合提供了多种方法策略来监测 秀丽隐杆线虫分子、细胞和生物体水平的蛋白质稳态失衡。压力源，例如错误折叠的疾病蛋白，可以通过实验引入特定的组织类型，同时随着时间的推移监测细胞和生物体对蛋白质毒性的反应。该集合提供了一个工具包，用于探测和监测蛋白质稳态，评估维持折叠蛋白质组的质量控制系统，并调查导致疾病的这些系统的失调。