通过改良的夹心ELISA定量中性粒细胞胞外诱捕网中的髓过氧化物酶-DNA和中性粒细胞弹性蛋白酶-DNA复合物

摘要

我们提出了一种改良的夹心酶联免疫吸附测定法，用于定量检测活化中性粒细胞来源的中性粒细胞胞外诱捕网残留物中的两个组分：髓过氧化物酶-DNA复合物和中性粒细胞弹性蛋白酶-DNA复合物。

摘要

某些刺激物（如微生物）可诱导中性粒细胞释放中性粒细胞胞外诱捕网（NETs），这些结构本质上是由DNA与颗粒蛋白（如髓过氧化物酶（MPO）和中性粒细胞弹性蛋白酶（NE））以及胞质和细胞骨架蛋白组成的网状结构。尽管近年来对NETs的研究兴趣日益增加，但在临床环境中尚无敏感且可靠的检测方法用于测量NETs。本文介绍了一种改良的夹心酶联免疫吸附测定法，用于定量检测循环NETs中的两个组分——MPO-DNA和NE-DNA复合物，它们是NETs的特异性成分，并作为NETs的降解产物释放到细胞外空间。该检测方法采用针对MPO或NE的特异性单克隆抗体作为捕获抗体，以及一种特异性识别DNA的检测抗体。在含有MPO-DNA或NE-DNA复合物的样本初始孵育过程中，MPO或NE会结合至捕获抗体的一个位点。该检测方法具有良好的线性关系以及较高的批间和批内精密度。我们在16例伴有急性呼吸窘迫综合征的COVID-19患者中应用了该方法，发现其血浆中MPO-DNA和NE-DNA的浓度显著高于健康对照组的血浆。该检测方法是一种可靠、高灵敏度且实用的技术，可用于研究人血浆及细胞培养上清液中NETs的特征。

引言

本文介绍了一种通过夹心酶联免疫吸附测定法（ELISA）检测髓过氧化物酶（MPO）和中性粒细胞弹性蛋白酶（NE）与DNA形成的复合物，从而定量生物液体中中性粒细胞胞外诱捕网（NET）形成的方法^1,2。NET由源自中性粒细胞颗粒的抗菌蛋白酶修饰的DNA骨架组成^3,4。MPO-DNA和NE-DNA复合物均为NET的重要且特异性的组分，并可在NET降解过程中释放至细胞外空间^3,4。

除了在抗菌防御中的重要生理作用外³，中性粒细胞胞外诱捕网也具有多种病理效应^4,5，包括促进血栓形成⁶ 脓毒症的恶化⁷因此，中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）近年来逐渐受到关注。然而， 体内 由于缺乏灵敏且可靠的定量检测方法，NETs 的定量一直具有挑战性。

目前已有多种方法可用于检测中性粒细胞胞外诱捕网（NETs），包括通过荧光显微镜^8,9和流式细胞术¹⁰进行直接检测，以及通过检测循环游离DNA、核小体和瓜氨酸化组蛋白H3进行间接检测，但每种方法均有其优缺点¹¹。尽管免疫荧光显微镜法对NETs具有特异性，能够清晰显示NETs的定位及形成程度，但其样本仅限于活检组织和分泌物。此外，该方法需由经验丰富的研究人员操作，且获得结果所需时间较长。通过流式细胞术检测循环中NET相关成分的方法操作简便且可快速获得结果，但该方法对NETs缺乏特异性¹²。

我们¹³及其他研究者^1,2开发了一种高灵敏度且可靠的检测方法，用于测定人血浆中循环的NET组分（即MPO结合的或NE结合的DNA），该方法采用改良的ELISA技术，以针对MPO或NE的特异性抗体作为捕获抗体，以DNA特异性抗体作为检测抗体。该检测方法也可用于ex vivo实验，以鉴定中性粒细胞在佛波醇12-肉豆蔻酸13-乙酸酯（PMA）刺激下释放至细胞培养上清液中的NET组分。

方案

本研究遵循赫尔辛基宣言进行，并获得了爱知医科大学机构审查委员会的批准（2017-H341，2019-H137）。所有参与者均签署了书面知情同意书。

1. 试剂准备

注意：进行夹心 ELISA 检测时，试剂的配制方法如下所述。

1. 包被缓冲液：
   1. 配制 0.1 mol/L 碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液时，称取 10.6 g 无水碳酸钠（分子量 106 g/mol）和 8.4 g 碳酸氢钠（分子量 84 g/mol）。
   2. 将其加入烧杯中约 900 mL 的蒸馏水中。
   3. 通过加入适量稀盐酸或氢氧化钠溶液，将缓冲液的 pH 值调节至 9.6。
   4. 使用 pH 计检测 pH 值。
   5. 然后加入蒸馏水定容至总体积为 1,000 mL。
   6. 将该 0.1 mol/L 碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液储存于 4 °C 冰箱中。
2. 封闭缓冲液：
   1. 在 70 mL 磷酸盐缓冲液（PBS，含 137 mmol/L NaCl、8.1 mmol/L Na₂HPO₄、2.68 mmol/L KCl 和 1.47 mol/L KH₂PO₄，pH 7.4）中加入约 250 µL 20% 叠氮化钠和 1 g 牛血清白蛋白（BSA），轻轻混匀。
   2. 加入蒸馏水定容至总体积 100 mL。牛血清白蛋白和叠氮化钠的终浓度分别为 1% 和 0.05%。静置 10 分钟后即可使用。
3. 洗涤液：用蒸馏水配制 0.5% 的聚氧乙烯对辛基苯基醚（Triton X-100）溶液。
   1. 将 100% Triton X-100 用蒸馏水稀释至 10%，并将该 10% 溶液放置 1 天后再使用。
   2. 然后将 10% Triton X-100 溶液用蒸馏水再稀释 20 倍，得到 0.5% 的工作浓度。
4. 抗体稀释：
   1. 在检测第 1 天使用前，用包被缓冲液（pH 9.6）将捕获抗体（抗 MPO 抗体 [1 mg/mL] 或抗 NE 抗体 [1 mg/mL]）按 1:2,000 比例稀释；在检测第 3 天使用前，用 PBS 将检测抗体（辣根过氧化物酶标记的抗 DNA 抗体）按 1:40 比例稀释（见下文）。
      注意：在预实验中，将同型对照抗体（IgG 兔源抗体 [5 mg/mL] 和 IgG1 小鼠单克隆抗体 Ci4 [0.5 mg/mL]）分别用包被缓冲液（pH 9.6）按 1:10,000 和 1:1,000 比例稀释。
5. ABTS 底物溶液：根据样本数量，将 1、2 或 3 片 2,2'-联氮-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)（ABTS）底物片剂分别溶于 5 mL、10 mL 或 15 mL ABTS 缓冲液（含过硼酸钠、柠檬酸和磷酸氢二钠）中；每份样本需 100 µL。配制后的溶液避光保存于 2–8 °C，可稳定保存长达 3 个月。

2. 样品采集与保存

1. 血浆分离：
   1. 使用22 G注射器经静脉穿刺采集4 mL外周血样本至含锂肝素的采血管中，于1,600 x g 4 °C 下离心 10 分钟。
   2. 将上清液转移至一个 2 mL 带锁扣的样品管中。
   3. 重新以16,000 x g离心上清液 g 在4 °C下离心10分钟，以去除任何残留细胞。
   4. 将上清液收集到新的安全锁样本管中，注意不要扰动管底的沉淀物。
   5. 将获得的血浆于−80 °C保存，以备后续使用。
      注意：为获得高通量的实验结果，需要使用高质量的样本。若使用血浆样本，需进行第二次离心以去除残留细胞。避免样本反复冻融。使用肝素作为抗凝剂，因为EDTA会影响DNase活性。
2. 多形核中性粒细胞的分离
   1. 使用22 G注射器经静脉穿刺采集外周血样本至含肝素锂的采血管中。
   2. 将6 mL血液叠加到6 mL单步分离液上，然后以1,000 x g离心管体 g 室温（RT）孵育45分钟。
   3. 收集含有中性粒细胞的第三层血沉棕黄层，并在不含酚红的RPMI-1640培养基中以400 × g离心洗涤三次 g 室温下孵育10分钟。
   4. 将中性粒细胞重悬于含2 mM L-谷氨酰胺和6%热灭活胎牛血清的酚红-free RPMI-1640培养基中，使用血细胞计数板在显微镜下计数细胞。
      注意：通过台盼蓝染色排斥法评估，该方法可获得96%至98%的纯度和超过95%的细胞活力。
3. 多形核中性粒细胞的活化与NETosis 体外
   1. 将新分离的多形核中性粒细胞稀释至 1 × 10⁵ 细胞/mL，置于不含酚红的 RPMI-1640 培养基中，该培养基含有 2 mM L-谷氨酰胺并添加 6% 经热灭活的胎牛血清，接种于 35 mm 培养皿中。
   2. 为诱导中性粒细胞胞外诱捕网（NETs），在37 °C、5% CO₂条件下，用25 nM PMA刺激多形核中性粒细胞4小时。₂95% 空气
   3. 孵育4小时后，向培养皿中直接加入0.6 µg/mL DNase I，在室温下作用15分钟，部分消化NETs，随后加入5 mM EDTA终止DNase I活性。
   4. 收集含有合成中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）的培养基，并在400 x g条件下离心 g 4 °C下离心10分钟以去除细胞碎片。
   5. 从4名健康对照者中获取上清液，混合后于−80 °C保存备用。
      ​注意：采用来自四名健康对照者的经DNase消化的PMA刺激中性粒细胞作为NET标准品^1,14,15使用PBS对NET标准品进行系列稀释，绘制标准曲线，并将未稀释NET标准品测得的光密度（OD）值定义为100% NET。

3. 检测方法

注意：以下详细描述了进行该检测的步骤。

1. 第1天
   1. 向每孔（包括空白孔）加入总共100 µL含0.05 µg抗体的稀释后抗MPO或抗NE抗体。
      注意：包被缓冲液中不得含有任何类型的去污剂，否则抗体可能无法均匀且平稳地结合到各孔的孔壁上。为防止钩状效应，包被蛋白浓度不得超过 20 µg/mL，因为高于该浓度会饱和微量滴定板上大多数可用的结合位点。蛋白包被溶液的典型浓度范围为 2–10 µg/mL。在初步实验中，使用稀释的兔同型对照抗体 IgG 作为包被抗体，替代针对 MPO 的特异性单克隆抗体；使用稀释的小鼠同型对照抗体 IgG1 作为包被抗体，替代针对 NE 的特异性单克隆抗体。
   2. 用粘性塑料封膜覆盖酶标板以防止样品蒸发，并于4 °C孵育过夜，使捕获抗体充分结合。
2. 第2天
   1. 弃去孔中的稀释抗体溶液，每孔加入300 µL洗涤液，用移液器吹打混匀，重复洗涤三至四次。
   2. 用纸巾轻拍平板以去除多余的 PBS。
   3. 用 200 µL 封闭缓冲液封闭 ELISA 板的每个孔。
   4. 用粘性塑料封口膜紧密覆盖酶标板，于室温下孵育1.5–2小时，以封闭孔板。
   5. 完全弃去各孔中的封闭液，然后每孔加入300 µL洗涤液，重复洗涤三至四次。
   6. 用纸巾轻拍平板以去除多余的 PBS。
   7. 除空白孔外，每孔加入25 µL血浆或培养基，并加入75 µL PBS作为稀释液，使终体积为100 µL；空白孔加入100 µL PBS。
   8. 然后，将酶标板置于250 rpm的摇床上，在室温下振荡混匀10秒。
   9. 每孔加入 2 µL 100 倍稀释的 DNase I（0.03 mg/mL），包括空白孔（反应体系中 DNase I 的终浓度为 0.6 µg/mL）。
   10. 用粘性塑料封板膜密封反应板，并将板置于250 rpm的摇床上，在室温下充分振荡混匀10秒。
       注意：在开发该检测方法时，为评估DNA消化的最佳条件，我们将含有来自COVID-19患者MPO相关DNA的样本在室温下与0–0.9 µg/mL DNase I共同孵育15分钟，并使用包被有特异性捕获抗体的酶标板 用于MPO或物种匹配的同型对照抗体。
   11. 在室温下孵育样品15分钟。
   12. 移除粘性塑料盖，在每个孔中加入1 µL 0.5 M EDTA以终止DNase反应。
   13. 用粘性塑料封板膜重新密封酶标板，置于摇床以250 rpm在室温下振荡15秒。
   14. 然后，将酶标板在4 °C孵育过夜，以使NETs中的蛋白质成分与捕获抗体结合。
3. 第3天
   1. 移除粘性塑料盖，并弃去孔中的溶液。
   2. 完全弃去孔中的溶液，然后每孔加入300 µL洗涤液，重复洗涤三至四次。
   3. 向每个孔中加入共100 µL稀释后的辣根过氧化物酶标记的抗DNA检测抗体。
   4. 用粘性塑料封板膜紧密密封，室温孵育1.5小时。
   5. 弃去孔中全部溶液，每孔加入300 µL洗涤液，用移液管反复吹打，重复洗涤三至四次。
   6. 小心移除残留溶液。
   7. 向每孔加入共100 µL ABTS底物溶液，并用粘性塑料封板膜覆盖酶标板。
   8. 在250 rpm的摇床上于室温避光孵育20-30分钟。
      注意：每隔 5 分钟监测一次平板，直至获得所需的 OD 读数。
   9. 加入总共 50 µL 的 2 M 硫酸以终止反应。
   10. 轻轻敲击培养板侧壁，混匀各孔中的液体。
   11. 打开酶标仪，并将其连接到计算机。
   12. 打开计算机上的软件应用程序。
   13. 从状态栏创建一个新实验并为其命名。
   14. 设置以下所有参数以进行酶标仪读数： 读数类型：吸光度；读数模式：终点法；波长数：2；第一波长：405 nm；第二波长：490 nm；自动混匀 & 检测前空白，关闭；读板前预读，关闭；自动校准，开启；条带，读取整块板；列波长优先级，列优先；移动速度，正常；自动读取，关闭。
   15. 然后，将含有样品的96孔板放入抽屉中并关闭。
   16. 最后，选择 阅读 按钮，以便立即读取酶标板。
   17. 使用酶标仪在405 nm波长下测定各孔的吸光度（此阶段以490 nm波长作为参考波长）。
   18. 自动扣除检测培养基自身的吸光度值，并对所有未知样品进行校正，保存数据。
       ​注意：使用通过系列稀释的NET标准品获得的标准曲线来计算样品中NET的相对浓度^1,14,15最终结果以如下形式呈现 "MPO-或NE-DNA复合物（占NET标准的百分比）" 检测限（LOD）根据标准偏差（SD）和校准曲线的斜率（S）按以下公式计算：LOD = 3.3(SD/S)。

4. 统计学

1. 使用适当的统计分析软件进行所有统计分析。此处使用 SigmaPlot v14.5。由于大多数参数呈偏态分布，百分比和连续变量以中位数及四分位间距表示。
2. 采用 Wilcoxon 秩和检验比较 COVID-19 患者与健康对照组之间的血浆 MPO-DNA 和 NE-DNA 水平。使用相关性分析探讨光密度与 NET 标准品百分比之间的关系。

结果

本方法采用夹心ELISA法，使用抗MPO、抗NE和抗DNA单克隆抗体来检测与MPO相关的DNA和与NE相关的DNA（图1）。在该方法中，将微孔板的孔用特异性针对MPO或NE的单克隆抗体包被，以捕获与DNA结合的MPO和与DNA结合的NE，以及未与DNA结合的MPO和NE。为计算板内变异系数（CV），对30份来自新型冠状病毒肺炎（COVID-19）患者和健康对照者的样本在同一块板上进行双复孔检测，并以双复孔测量值的均值计算%CV；为计算板间CV（即板与板之间的一致性），在10块不同的板上对来自COVID-19患者和健康对照者的两类样本进行四复孔检测；为验证本检测方法的特异性，使用包被了同型对照抗体而非抗MPO和抗NE特异性单克隆抗体的微孔板，检测不同浓度的MPO-DNA和NE-DNA复合物；为评估检测的灵敏度和线性范围，对一系列稀释的中性粒细胞胞外诱捕网（NET）标准品进行检测，该标准品通过佛波酯（PMA）刺激分离的人中性粒细胞并经轻度DNase消化制备，随后计算相关系数和检测下限（LOD）。

基于系列稀释的NET标准品绘制...

讨论

我们描述了一种夹心ELISA方法，在该方法中，含有MPO-DNA或NE-DNA复合物的样本在初始孵育阶段，MPO或NE会结合到捕获抗体的一个结合位点上。洗涤后，通过加入与过氧化物酶偶联的抗DNA单克隆抗体孵育样本，完成"夹心"结构。在去除未结合的二抗后，通过添加显色性ABTS过氧化物酶底物检测已结合的过氧化物酶偶联物，产生可溶性终产物，可在405 nm处用分光光度法测定。良好的线性关系以及高重复间和重复内精密度表明，本文及其他研究^1,2 中所述的ELISA方法在临床上具有可靠性和可行性。此外，当将经DNase处理的PMA刺激中性粒细胞上清液设定为NET标准品的最大信号时，该ELISA方法可作为半定量检测方法^1,14,15。

NETs 的长染色质纤维上结合有...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
一步法多晶型物	Accurate Chemical and Scientific Corporation	AN221725	从人血中分离中性粒细胞（PMN）。
96孔微孔板	Thermo Fisher Scientific	467466	平底
ABTS缓冲液	Sigma-Aldrich Merck	11 204 530 001	含有过硼酸钠、柠檬酸和磷酸氢二钠。
ABTS片剂	Sigma-Aldrich Merck	11 204 521 001	每片含5 mg ABTS底物和60 mg赋形剂。
粘性塑料封膜，Axygen	Thermo Fisher Scientific	14222348
抗MPO抗体	Sigma-Aldrich Merck	07-496-I	储存于2–8 °C，稳定期1年。宿主物种为兔。
抗NE抗体，克隆株AHN-10	Sigma-Aldrich Merck	MABS461	储存于2–8 °C，稳定期1年。宿主物种为小鼠。
牛血清白蛋白	Biomedical Science	BR-220700081	牛血清白蛋白第V组分。储存于2–8 °C，稳定期2年。
DNase I	New England BioLabs	M0303M	储存于-20 °C
IgG，兔，同型对照	GENETEX, Inc.	GTX35035	以浓缩溶液形式储存于2–8 °C。
IgG1，小鼠同型对照，克隆株Ci4	Merck	MABC002	以浓缩溶液形式储存于2–8 °C。
锂肝素采血管	Becton Dickinson and Company
微孔板混匀仪	As one corporation	NS-P
微孔板读板仪	Molecular Devices	SpectraMax 190	任何能够读取405–490 nm波长的微孔板读板仪均可使用。
微孔板读板仪软件	Molecular Devices	SoftMax pro
辣根过氧化物酶标记抗DNA抗体，细胞死亡检测试剂盒ELISA	Roche Diagnostics	1154467500	2号瓶。储存于2–8 °C，稳定期1年。
佛波醇12-十四烷酸酯13-乙酸酯（PMA）	Sigma-Aldrich Merck	P8139	用于激活人血中性粒细胞（PMN）。
磷酸盐缓冲液	Takara Bio	T9181	室温储存，稳定期6个月。
SigmaPlot v14.5	Systat Software Inc. San Jose, CA, USA
叠氮化钠	Fujifilm Wako Chemicals	190-14901	室温储存。
辛基苯基聚氧乙烯醚，聚乙二醇叔辛基苯基醚	Fujifilm Wako Chemicals	9002-93-1	室温储存。