通过改良的夹心ELISA定量中性粒细胞胞外诱捕网中的髓过氧化物酶-DNA和中性粒细胞弹性蛋白酶-DNA复合物

摘要

我们提出了一种改良的夹心酶联免疫吸附测定法，用于定量检测活化中性粒细胞来源的中性粒细胞胞外诱捕网残留物中的两个组分：髓过氧化物酶-DNA复合物和中性粒细胞弹性蛋白酶-DNA复合物。

摘要

某些刺激物（如微生物）可诱导中性粒细胞释放中性粒细胞胞外诱捕网（NETs），这些结构本质上是由DNA与颗粒蛋白（如髓过氧化物酶（MPO）和中性粒细胞弹性蛋白酶（NE））以及胞质和细胞骨架蛋白组成的网状结构。尽管近年来对NETs的研究兴趣日益增加，但在临床环境中尚无敏感且可靠的检测方法用于测量NETs。本文介绍了一种改良的夹心酶联免疫吸附测定法，用于定量检测循环NETs中的两个组分——MPO-DNA和NE-DNA复合物，它们是NETs的特异性成分，并作为NETs的降解产物释放到细胞外空间。该检测方法采用针对MPO或NE的特异性单克隆抗体作为捕获抗体，以及一种特异性识别DNA的检测抗体。在含有MPO-DNA或NE-DNA复合物的样本初始孵育过程中，MPO或NE会结合至捕获抗体的一个位点。该检测方法具有良好的线性关系以及较高的批间和批内精密度。我们在16例伴有急性呼吸窘迫综合征的COVID-19患者中应用了该方法，发现其血浆中MPO-DNA和NE-DNA的浓度显著高于健康对照组的血浆。该检测方法是一种可靠、高灵敏度且实用的技术，可用于研究人血浆及细胞培养上清液中NETs的特征。

引言

本文介绍了一种通过夹心酶联免疫吸附测定法（ELISA）检测髓过氧化物酶（MPO）和中性粒细胞弹性蛋白酶（NE）与DNA形成的复合物，从而定量生物液体中中性粒细胞胞外诱捕网（NET）形成的方法^1,2。NET由源自中性粒细胞颗粒的抗菌蛋白酶修饰的DNA骨架组成^3,4。MPO-DNA和NE-DNA复合物均为NET的重要且特异性的组分，并可在NET降解过程中释放至细胞外空间^3,4。

除了在抗菌防御中的重要生理作用外³，中性粒细胞胞外诱捕网也具有多种病理效应^4,5，包括促进血栓形成⁶ 脓毒症的恶化⁷因此，中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）近年来逐渐受到关注。然而， 体内 由于缺乏灵敏且可靠的定量检测方法，NETs 的定量一直具有挑战性。

方案

本研究遵循赫尔辛基宣言进行，并获得了爱知医科大学机构审查委员会的批准（2017-H341，2019-H137）。所有参与者均签署了书面知情同意书。

1. 试剂准备

注意：进行夹心 ELISA 检测时，试剂的配制方法如下所述。

1. 包被缓冲液：
   1. 配制 0.1 mol/L 碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液时，称取 10.6 g 无水碳酸钠（分子量 106 g/mol）和 8.4 g 碳酸氢钠（分子量 84 g/mol）。
   2. 将其加入烧杯中约 900 mL 的蒸馏水中。
   3. 通过加入适量稀盐酸或氢氧化钠溶液，将缓冲液的 pH 值调节至 9.6。
   4. 使用 pH 计检测 pH 值。
   5. 然后加入蒸馏水定容至总体积为 1,000 mL。
   6. 将该 0.1 mol/L 碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液储存于 4 °C 冰箱中。
2. 封闭缓冲液：
   1. 在 70 mL 磷酸盐缓冲液（PBS，含 137 mmol/L NaCl、8.1 mmol/L Na₂HPO₄、2.68 mmol/L KCl 和 1.47 mol/L KH₂PO₄，pH ....

结果

本方法采用夹心ELISA法，利用抗MPO、抗NE和抗DNA单克隆抗体检测与MPO结合的DNA以及与NE结合的DNA（图1）。在该方法中，将微孔板的孔包被MPO特异性或NE特异性单克隆抗体，以捕获与DNA结合的MPO和NE，以及未与DNA结合的MPO和NE。为计算板内变异系数（CV），对30份来自COVID-19患者和健康对照者的样本在同一块板上进行双复孔检测，并以双复孔测量值的均值计算%CV；为计算板间CV（即板间重复性），在10块不同的板上对来自COVID-19患者和健康对照者的两类样本进行四复孔检测；为验证本检测方法的特异性，使用包被同型对照抗体而非抗MPO和抗NE特异性单克隆抗体的板，检测不同浓度的MPO-DNA和NE-DNA复合物；为评估检测的灵敏度和线性范围，对经PMA刺激分离的人中性粒细胞并进行轻度DNase消化后制备的系列稀释NET标准品进行检测，并计算相关系数和检测下限（LOD）。

来自系列稀释的 NET 标准品的 MPO-DNA 和 NE-DNA 校准曲线如图 2.......

讨论

我们描述了一种夹心ELISA方法，在该方法中，含有MPO-DNA或NE-DNA复合物的样本在初始孵育阶段，MPO或NE会结合到捕获抗体的一个结合位点上。洗涤后，通过加入与过氧化物酶偶联的抗DNA单克隆抗体孵育样本，完成"夹心"结构。在去除未结合的二抗后，通过添加显色性ABTS过氧化物酶底物检测已结合的过氧化物酶偶联物，产生可溶性终产物，可在405 nm处用分光光度法测定。良好的线性关系以及高重复间和重复内精密度表明，本文及其他研究^1,2 中所述的ELISA方法在临床上具有可靠性和可行性。此外，当将经DNase处理的PMA刺激中性粒细胞上清液设定为NET标准品的最大信号时，该ELISA方法可作为半定量检测方法^1,14,15。

NETs 的长染色质纤维上结合有.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
一步法多晶型物	Accurate Chemical and Scientific Corporation	AN221725	从人血中分离中性粒细胞（PMN）。
96孔微孔板	Thermo Fisher Scientific	467466	平底
ABTS缓冲液	Sigma-Aldrich Merck	11 204 530 001	含有过硼酸钠、柠檬酸和磷酸氢二钠。
ABTS片剂	Sigma-Aldrich Merck	11 204 521 001	每片含5 mg ABTS底物和60 mg赋形剂。
粘性塑料封膜，Axygen	Thermo Fisher Scientific	14222348
抗MPO抗体	Sigma-Aldrich Merck	07-496-I	储存于2–8 °C，稳定期1年。宿主物种为兔。
抗NE抗体，克隆株AHN-10	Sigma-Aldrich Merck	MABS461	储存于2–8 °C，稳定期1年。宿主物种为小鼠。
牛血清白蛋白	Biomedical Science	BR-220700081	牛血清白蛋白第V组分。储存于2–8 °C，稳定期2年。
DNase I	New England BioLabs	M0303M	储存于-20 °C
IgG，兔，同型对照	GENETEX, Inc.	GTX35035	以浓缩溶液形式储存于2–8 °C。
IgG1，小鼠同型对照，克隆株Ci4	Merck	MABC002	以浓缩溶液形式储存于2–8 °C。
锂肝素采血管	Becton Dickinson and Company
微孔板混匀仪	As one corporation	NS-P
微孔板读板仪	Molecular Devices	SpectraMax 190	任何能够读取405–490 nm波长的微孔板读板仪均可使用。
微孔板读板仪软件	Molecular Devices	SoftMax pro
辣根过氧化物酶标记抗DNA抗体，细胞死亡检测试剂盒ELISA	Roche Diagnostics	1154467500	2号瓶。储存于2–8 °C，稳定期1年。
佛波醇12-十四烷酸酯13-乙酸酯（PMA）	Sigma-Aldrich Merck	P8139	用于激活人血中性粒细胞（PMN）。
磷酸盐缓冲液	Takara Bio	T9181	室温储存，稳定期6个月。
SigmaPlot v14.5	Systat Software Inc. San Jose, CA, USA
叠氮化钠	Fujifilm Wako Chemicals	190-14901	室温储存。
辛基苯基聚氧乙烯醚，聚乙二醇叔辛基苯基醚	Fujifilm Wako Chemicals	9002-93-1	室温储存。