本文提供了一种详细的实验方案，用于成像活体苔藓组织中细胞壁的三维动态变化，可实现对ggb突变体在长期发育过程中细胞壁脱离现象以及野生型细胞壁增厚模式的可视化观察。
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本文内容
摘要
摘要
利用荧光显微镜进行延时成像，可观察细胞及亚细胞水平上生长与发育的动态变化。通常情况下，长时间观察需要通过荧光蛋白的遗传转化来实现；然而，对于大多数系统而言，遗传转化要么耗时较长，要么在技术上难以实现。本文介绍了一种在小立碗藓（Physcomitrium patens）中建立的、使用钙荧光白染料（可特异性染色植物细胞壁中的纤维素）进行为期3天的三维延时成像实验方案。细胞壁来源的钙荧光白信号稳定，可在一周内保持不明显衰减。利用该方法已证实，ggb突变体（其中香叶基香叶基转移酶I的β亚基蛋白被敲除）中细胞的脱离现象是由不受调控的细胞扩张以及细胞壁完整性缺陷所导致。此外，钙荧光白染色模式随时间发生变化；染色较弱的区域与野生型中未来细胞扩张或分支位点相吻合。该方法可应用于其他含有细胞壁且能被钙荧光白染色的多种生物系统。
引言
植物细胞壁在细胞扩展和发育过程中会发生动态变化1,2,3。维持细胞壁完整性对于植物细胞在生长和发育过程中的细胞黏附以及对环境信号的响应至关重要。尽管长期可视化活细胞的细胞壁动态对于理解发育过程中及适应环境变化时细胞黏附的维持机制至关重要，但目前直接观察细胞壁动态的方法仍然面临挑战。
利用高分辨率荧光显微镜进行细胞变化的延时成像，可以提供有关生物体发育动态的丰富信息4,5,6,7。尽管三维延时成像在研究生长和发育过程中细胞形态动态变化方面具有巨大潜力，但该技术通常需要转入荧光蛋白4,5,6,7。然而，对于大多数系统而言，遗传转化过程要么耗时较长，要么在技术上具有挑战性。作为替代方案，可结合细胞组分的荧光染料早已被广泛应用。这些荧光染料在特定波长的光照激发后能够发射荧光。常见的例子包括Edu、DAPI、PI、FM4-64和calcofluor white8,9,10。然而，其主要缺点之一是，由于这些染料对细胞具有一定的毒性，通常只能用于固定组织或短期实验8,9,10。
通过本方案，当在卷柏藓（P. patens）的延时实验中将荧光增白剂 Calcofluor 混入培养基时，Calcofluor 的信号保持稳定。利用该方法，通过三维延时成像观察了 ggb 突变体细胞在3天内的脱离过程3（图1）。该方法可应用于许多其他含有细胞壁且能被 Calcofluor 染色的生物系统。
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方案
注意：本实验方案中所用材料与设备的清单见材料表，所用溶液清单见表1。
1. 玻璃底培养皿中植物的准备
- 在13 cm培养皿中的BCDAT琼脂培养基上，在恒定白光（约50 µmol m⁻² s⁻¹）条件下培养苔藓原丝体组织。-2s-1在25 °C的培养箱中培养7天。
- 用滤器对荧光增白剂进行除菌处理，并于4 °C保存至使用。该试剂可稳定数月。
- 将7天大的苔藓组织分散到含有20 µL无菌水的1.5 mL微量离心管中。确保苔藓原丝体组织在水中充分分散成小片段。对于野生型（WT），使用镊子分离原丝体；对于突变体 ggb 突变体，使用 P-1000 移液器。
- 向1.5 mL离心管中加入10 µL灭菌的Calcofluor White，将离心管直立放置于通风橱中染色2 min。
- 染色后立即用移液器吸取200 µL冷却的BCDATG（BCDAT培养基添加0.5% (w/v)葡萄糖和0.4% (w/v)结冷胶），上下吹打5次，使植株与溶液充分混匀。
注意：确保 BCDATG 培养基已充分冷却（接近凝固前）以避免对植物造成胁迫。 - 将含有植物和BCDATG培养基的混合物转移至直径为27 mm的玻璃底培养皿中。确保用于混合细胞的BCDATG体积不超过200 µL，并将含有样品的200 µL BCDATG均匀分布在7 mm玻璃底培养皿表面，形成一层薄液膜，使样品处于成像时物镜的工作距离范围内。
- 室温下凝固2分钟后，用3 mL冷却的BCDATG覆盖薄层，静置10分钟使其再次凝固。
注意：为避免污染，步骤1.2-1.5需在无菌操作台中进行。 - 在培养皿底部，分别绘制九条相互平行和垂直的线（图2）。用字母 a 到 h 标记行，用数字 1 到 8 标记列。使用上、下、右、中、左来标记每个方格内的位置。例如，若一株植物位于第二行第六列的方格内，并处于该方格的左上部分，则该植物被命名为 "b6_左上".
- 在生长培养箱中，先将含有植物的玻璃底培养皿在25 °C下用红光预培养5天，随后在白光下培养1–2天，之后每天进行延时成像，持续最多3天。对于野生型（WT），使用弱红光（0.5 µmol m⁻² s⁻¹）进行预培养。-2s-1) 上述条件下培养5天以诱导原丝体的向光性反应，从而使植株能够附着于培养皿底部11.
注意：弱红光是通过将白光穿过一块3 mm厚的红色丙烯酸塑料滤光片进入避光箱而提供的。对于 ggb 突变体，红光预培养为可选步骤，因为 ggb 突变体没有向光性反应3.
2. 成像与三维重建
- 将含有植物的玻璃底培养皿放置在倒置共聚焦显微镜的载物台上，使玻璃底朝向物镜。使用共聚焦显微镜配合20倍物镜观察荧光增白剂（calcofluor）。采用405 nm激光，针孔大小设为1.0，高压增益设为100，偏移-背景调节设为0，激光功率设为5%-7%，扫描尺寸为1,024 × 1,024，以及扫描速度为每秒半帧进行成像。以1.0 µm的步长采集17–30个z序列光学切片。使用步骤1.6中的代码命名图像，例如"b6_upper_left-day0"，并保存。
- 在采集中选择DAPI通道，并在ND采集中勾选Z框。为设置Z堆栈的下限和上限，点击顶部和底部按钮。
- 为重建三维图像，打开.nd2文件（图3A；见材料表），然后点击体积（图3B）。
3. 在不同时间点对相同植株进行成像
- 每次成像后，将玻璃底培养皿放回生长室。
- 重复步骤 2.1 进行成像和三维重建。
注意：为找到相同的植株，请使用步骤 1.6 中提到的代码，并根据植株的生长天数命名，如 "b6_upper_left-day1" 或 "b6_upper_left-day2"。
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结果
该方法可用于观察野生型和ggb突变体在发育过程中细胞壁的动态变化（图1）。结果显示，细胞壁增厚较少的区域与细胞扩展/分枝位点相关，从而可预测野生型中的扩展/分枝位点（图1A）。在ggb突变体中，由于细胞扩展失控，细胞壁表面在发育过程中被撕裂3（图1B）。此外，ggb突变体破裂表面的染色信号（代表较老的纤维素）强于破裂细胞壁表面下方的细胞表面（代表较新的纤维素）。
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讨论
延时三维重建（即四维成像）是观察发育过程中细胞形态动态变化的有力工具。本实验方案中，通过在培养基中加入荧光增白剂Calcofluor white，可在藓类植物P. patens中观察三维细胞形态的动态变化。利用该方法，我们观察到ggb突变体在发育过程中细胞壁表面发生撕裂3。此外，细胞壁增厚程度降低的区域与野生型中的细胞扩展/分枝位点相关，因而可用于预测细胞扩展/分枝的发生位置。进一步地，由于Calcofluor white可与其他染料（如微球）联合使用，因此还能获取关于细胞扩展的额外信息3。
有两种可能的原因可以解释为何荧光增白剂（calcofluor）能够在不影響或損傷其分子靶標的情況下持續結合於植物數天之久。首先，其工作濃度較低（200 µL BCDATG 培養基中加入 10 µL，即 5%），可能低於對苔蘚原絲體產生影響的閾值。其次，calcofluor 可能主要染色纖維素的成熟階段，因為在野生型中，基部區域（組織較老）的染色信號明顯強於頂端細胞...
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披露
作者声明不存在竞争性或经济利益。
致谢
作者感谢路易斯维尔大学的 Soucy Patricia 博士和 Betty Nunn 在共聚焦显微镜使用方面的协助。本研究由美国国家科学基金会（项目编号：1456884，授予 M.P.R.）以及美国国家科学基金会合作协议（项目编号：1849213，授予 M.P.R.）资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 3 毫米厚红色塑料滤光片 | Mitsubishi | no.102 | |
| 直径 27 毫米玻璃底培养皿 | Iwaki | 3930-035 | |
| 琼脂 | Sigma | A6924 | |
| 荧光增白剂白 | Sigma | 18909-100ML-F | Calcofluor White M2R，1 g/L 和伊文思蓝，0.5 g/L |
| 共聚焦显微镜 | Nikon | A1 | NIS element 软件；在 NIS-elements Viewer 中打开 .nd2 文件，下载地址：https://www.microscope.healthcare.nikon. |
| 荧光显微镜 | Nikon | TE200 | 配备 DS-U3 相机； |
| 结冷胶 | Nacali Tesque | 12389-96 | |
| 植物生长培养箱 | SANYO | Sanyo MLR-350H | |
| 带 0.22 μm 滤膜的无菌注射器 | Millipore | SLGV033RS |
参考文献
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- Vaahtera, L., Schulz, J., Hamann, T. Cell wall integrity maintenance during plant development and interaction with the environment. Naure Plants. 5 (9), 924-932 (2019).
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重印与许可
