通过荧光共振能量转移研究组蛋白修饰酶与体内转录因子之间的相互作用

摘要

荧光共振能量转移（FRET）是一种用于检测活细胞中蛋白质相互作用的成像技术。在这里，提出了一种FRET协议来研究组蛋白修饰酶与转录因子的关联，转录因子将它们募集到靶启动子中，用于植物组织中基因表达的表观遗传调控。

摘要

基因表达的表观遗传调控通常受到组蛋白修饰酶（HME）的影响，这些酶分别产生异色或正色组蛋白标记，用于转录抑制或激活。HME通过转录因子（TF）募集到其靶染色质中。因此，检测和表征 HME 和 TF 之间的直接相互作用对于更好地理解它们的功能和特异性至关重要。如果在 活 组织中体内进行，这些研究将更具生物学相关性。在这里，描述了一种协议，用于使用荧光共振能量转移（FRET）可视化植物组蛋白去泛素酶和植物转录因子之间的植物叶片相互作用，该协议允许检测彼此相距<10nm内的蛋白质分子之间的复合物。介绍了FRET技术的两种变体:SE-FRET（敏化发射）和AB-FRET（受体漂白），其中能量以非辐射方式从供体传递到受体，或者在受体光漂白时由供体辐射发射。SE-FRET和AB-FRET方法都可以很容易地适应，以发现 植物中其他蛋白质之间的其他相互作用。

引言

植物组蛋白去泛素酶通过组蛋白的翻译后修饰在控制基因表达中起重要作用，特别是通过擦除其单泛素^化标记1。到目前为止，OTLD1是拟南芥^2，3中为数不多的在分子水平上表征的植物组蛋白去泛素酶之一。OTLD1从H2B组蛋白分子中去除单泛素基团，从而促进靶基因染色质^4，5中H3组蛋白的正色乙酰化和甲基化修饰的去除或添加。此外，OTLD1与另一种染色质修饰酶组蛋白赖氨酸去甲基化酶KDM1C相互作用，影响^{靶基因6，7}的转录抑制。

大多数组蛋白修饰酶缺乏DNA结合能力，因此不能直接识别其靶基因。一种可能性是它们与DNA结合转录因子蛋白合作，这些转录因子蛋白结合这些酶并将它们引导到染色质靶标。具体而言，在植物中，已知几种主要的组蛋白修饰酶（即组蛋白甲基转移酶⁸，⁹，组蛋白乙酰转移酶¹⁰，组蛋白去甲基化酶11和Polycomb抑制复合物12，^13，14）被转录因子招募。与这一想法一致，最近提出了一种将OTLD1募集到目标启动子的可能机制，该机制基于OTLD1与转录因子LSH10¹⁵的特定蛋白质 - 蛋白质相互作用。

LSH10属于植物ALOG（拟南芥LSH1和Oryza G1）蛋白家族，其作为中枢发育调节因子¹⁶，^17，18，¹⁹，²⁰，^21，22。AOG蛋白家族的成员含有DNA结合基序²³并表现出转录调节²²，核定位¹⁹和同源二聚化²⁴的能力，这一事实进一步支持了这些蛋白质（包括LSH10）可能在转录的表观遗传调控过程中充当特异性转录因子的观点。用于表征体内LSH10-OTLD1相互作用的主要实验技术之一是荧光共振能量转移（FRET）¹⁵。

FRET是一种成像技术，用于直接检测活细胞内^{彼此相距<}10 nm以内的蛋白质之间的近距离相互作用 25.FRET方法²⁶有两种主要变体:敏化发射（SE-FRET）（图1A）和受体漂白（AB-FRET）（图1B）。在SE-FRET中，相互作用的蛋白质 - 其中一个用供体荧光染料（例如，绿色荧光蛋白，GFP）标记，另一个用受体荧光染料（例如，单体红色荧光蛋白，mRFP^27，28）标记 - 非辐射地将激发态能量从供体转移到受体。由于在此转移过程中不发射光子，因此会产生荧光信号，其辐射发射光谱与受体的辐射发射光谱相似。在AB-FRET中，当受体被光漂白永久灭活时，根据供体的辐射发射升高来检测和量化蛋白质相互作用，因此无法接收从供体转移的非辐射能量（图1）。重要的是，FRET荧光的亚细胞位置表明细胞中相互作用蛋白的定位。

在活组织中部署FRET并在检测这种相互作用的同时确定相互作用蛋白质的亚细胞定位的能力，使FRET成为体内蛋白质 - 蛋白质相互作用研究和初步表征的首选技术。一种可比的体内荧光成像方法，双分子荧光互补（BiFC）²⁹，³⁰，^31，32，是一种很好的替代方法，尽管与FRET不同，BiFC可能由于自发荧光BiFC报告³³的自发组装而产生假阳性^，并且其数据的定量不太精确。

本文分享了实施SE-FRET和AB-FRET技术的成功经验，并提出了一种部署协议，以研究OTLD1和LSH10在植物细胞中的相互作用。

方案

本氏烟草、根癌农杆菌菌株EHA105或GV3101用于本研究。

1. FRET矢量构建

1. 为供体/受体FRET对选择荧光标签。
   1. 使用来自pPZP-RCS2A-dest-EGFP-N1^15，28 的EGFP（参见 材料表）生成供体载体。
   2. 使用来自pPZP-RCS2A-DEST-mRFP-N1的mRFP（参见 材料表）生成受体载体。
2. 使用位点特异性重组克隆技术³⁴生成供体/受体FRET构建体，例如网关重组克隆系统³⁵。
   1. 扩增感兴趣的蛋白质³⁶ （即拟南芥 OTLD1 和 LSH10）的编码序列¹⁵。
      注意:使用阴性对照也是一个好主意，该阴性对照代表一种相互作用的蛋白质的同系物，但预计不会表现出相互作用;OTLD1-LSH10相互作用研究采用LSH10，LSH4的同系物，不识别OTLD1。OTLD1、LSH10和LSH4 cDNA使用 表1中列出的引物通过PCR扩增。
   2. 通过位点特异性重组克隆技术将 OTLD1，LSH10和 LSH4 克隆到入口载体pDONR207中³⁴。
   3. 使用网关LR克隆酶II（见材料表）将LSH10和LSH4从pDONR207转移到二元目标载体pPZP-RCS2A-dest-egfp-N1中，以生成二元供体构建体p35S::LSH10-GFP（测试构建体）和p35S::LSH4-GFP（阴性对照）。
   4. 使用相同的市售酶（步骤1.2.3）将 OTLD1 从pDONR207转移到二元目标载体pPZP-RCS2A-DEST-mRFP-N1中以生成二元受体构建体p35S::OTLD1-mRFP（测试构建体）。
   5. 使用表1中列出的引物对来自pPZP-RCS2A-DEST-mRFP-N1的³⁶ mRFP进行PCR扩增，通过重组克隆技术将其克隆到pDONR207中，然后使用LR克隆酶II将mRFP转移到pPZP RCS2A-DEST-EGFP-N1中以生成二元融合构建体p35S::mRFP-GFP（阳性对照）。
3. 将供体和受体构建体转化为农杆菌。
   1. 加入步骤1.2.3-1.2.5至100μL根 癌农杆菌 菌株EHA105或GV3101的感受态细胞培养物中的1μg每个质粒，使用标准方案37制备或商业获得，并在³⁷ °C下孵育5分钟。
   2. 向感受态细胞混合物中加入 1 mL LB 培养基（1% 胰蛋白胨、0.5% 酵母提取物和 1% NaCl;参见材料 表），并在 200 rpm 和 28° C 下搅拌 1.5 小时。通过在室温下以3，000× g 离心1分钟来收集细胞。
   3. 通过移液将细胞重悬于0.1mL LB培养基中，并将其散布在补充有适当抗生素（例如，0.01%大观霉素和0.005%利福平;参见 材料表）的LB琼脂上。在28°C下生长2天。
   4. 挑选单个菌落，并将每个菌落分别接种到 1 mL 补充有适当抗生素的 LB 肉汤中。
   5. 将细胞在28°C下培养24小时，并将0.2mL的培养物转移到新管中。通过在室温下以10，000× g 离心30秒来收集细胞。
   6. 通过从农杆菌细胞³⁸ 中分离质粒的标准方案提取质粒 DNA，并将提取的 DNA 重悬于 30 μL 水中。为了鉴定含有所需质粒的菌落，请使用 2 μL 的 DNA 制剂作为 PCR 模板，使用 表 1 中列出的基因特异性引物进行 PCR。将0.7mL鉴定的培养物与0.3mL甘油混合，并储存在-80°C。

2. 农业渗透

1. 种植 本氏烟草 植物。
   注意:在整个实验过程中，所有植物都必须是健康的。
   1. 在含有高密度湿土壤的盆中播种和生长 本氏猪笼草 种子。
   2. 将种植的种子保持在23°C的生长室中，以150-170μmol/ m²秒的光强度进行16小时的光照和8小时的黑暗循环，直到叶绿的直径达到0.5cm。
   3. 将幼苗转移到较大的花盆中，并让它们在具有相同参数的同一腔室中生长。
      注意:当植物最大的叶子直径为 5-7 厘米时，通常在 4-5 周内，植物就可以进行农业渗透。在太年轻的小型植物中，农业渗透的影响对于FRET分析来说太严重了。
2. 准备用于农业渗透的细菌细胞。
   1. 在补充有适当抗生素（步骤1.3.3）和150μM乙酰丁香酮的5mLLB培养基中在28°C下培养含有FRET构建物的每个农杆菌菌落过夜（参见 材料表）。
   2. 在室温下以3，000× g 离心细胞5分钟。
   3. 将细胞重悬于农业浸润缓冲液（10mM MgCl₂，10mM MES pH 5.6，150μM乙酰丁香酮）中至OD₆₀₀ = 0.5。
   4. 在具有适当构建体的细胞之间以1:1 v / v的比例合并重悬的细胞（步骤2.2.5）。
   5. 对于双构建的农业渗透，混合两种培养物的等分试样，对于单构建的农业渗透，混合相同培养物的等分试样:
      1. 测试蛋白质:OTLD1-mRFP + LSH10-GFP（含有p35S::OTLD1-mRFP和p35S::LSH10-GFP构建体的细菌）。
      2. 阴性对照:OTLD1-mRFP + LSH4-GFP（携带p35S::OTLD1-mRFP和p35S::LSH4-GFP构建体的细菌）。
      3. 阴性对照:LSH10-GFP + 游离 mRFP（携带 p35S::LSH10-GFP 和 pPZP-RCS2A-DEST-mRFP-C1 构建体的细菌）。
      4. 阳性对照:mRFP-GFP（携带p35S::mRFP-GFP构建体的细菌）。
   6. 将细胞在28°C孵育0.5-1小时。
3. 进行农业渗透。
   1. 将细菌培养物装入 1 mL 无针注射器中。
   2. 轻轻但坚定地将注射器的喷嘴压在完全膨胀的 本氏猪笼草 叶的远轴侧，同时用戴手套的手指在近轴侧握住叶子。
   3. 在一片叶子上浸润多达四个斑点，每株植物三片叶子，每种细菌培养物浸润两到三株。在样品之间更换手套以防止交叉污染。
   4. 如步骤2.1.2所述，在相同条件下将农业渗透的植物保持在相同的生长室中24小时至36小时。不要将农业渗透的植物保持超过36小时，因为这会降低荧光信号。

3. 共聚焦显微镜

1. 准备用于荧光可视化的显微镜载玻片。
   1. 浸润24-36小时后，使用剃须刀片将每片农浸的叶子切成静脉之间的小块（2mm x 4mm）。
   2. 将叶片放在载玻片上，叶子的远轴表面朝上。将一滴水放在叶片上，并用盖玻片覆盖它们。轻轻敲击盖板玻璃以去除气泡。
   3. 打开显微镜和激光（见 材料表）。将载玻片放入显微镜载物台支架中，以便在特定的FRET参数下成像（步骤3.2和3.3）。
   4. 使用10倍物镜开始观察，以识别同时表现出GFP和mRFP信号的细胞，然后使用40倍物镜进行后续的详细观察。
      注意:重要的是，SE-FRET和AB-FRET通常在同一组织样品上进行，允许使用相同的通道设置（步骤3.2），但FRET通道除外，FRET通道分别针对SE-FRET和AB-FRET观察打开/关闭（步骤3.2.2.3和3.3.1）。
2. 设置SE-FRET的参数（图1A）。
   1. 打开多维采集 （MDA） 工具。
   2. 在同一视场中建立一组三个共聚焦通道（补充图1）。
      1. 设置供体通道（GFP通道），用于使用405 nm激发激光器和400-597 nm发射滤光片激发和发射供体荧光染料。
      2. 使用561 nm激发激光器和400-597 nm发射滤光片设置受体荧光染料激发和发射的受体通道（mRFP通道）。
         注意:mRFP 的发射滤光片设置为 400-597 nm，以将 mRFP 信号与 597-617 nm 处的 FRET 信号分开（步骤 3.2.2.3），从而减少与 FRET 无关的 mRFP 发射。
      3. 设置FRET通道，用于激发供体并使用405 nm激发激光器和597-617 nm发射滤光片发射受体荧光染料。
   3. 将供体激发强度设置为最低水平，以观察FRET，同时避免光漂白，从而降低SE-FRET效率。
      注意:在进行FRET程序之前，该激发强度是通过实验选择的，以避免光漂白。它根据叶子厚度、年龄和过度表达后的时间而变化。
   4. 激发供体并扫描含有受体预期荧光信号的细胞。
   5. 选择包含感兴趣的荧光信号的区域。
   6. 通过按 捕捉 按钮获取 SE-FRET 图像序列。
      1. 图像10-15首先表达mRFP-GFP构建体（阳性对照）的细胞;调整对焦、变焦和智能增益参数，以聚焦于要捕获的感兴趣区域（补充图2）。
      2. 使用相同的设置，对10-15个细胞进行成像，每个细胞分别表达OTLD1-mRFP，游离mRFP，LSH10-GFP或LSH4-GFP。
         注意:这些图像由ImageJ的"PixFRET"插件获取（见 材料表），该插件用于FRET数据分析（步骤3.4.1）以确定受体和供体的光谱渗漏（SBT）值;软件使用这些图像生成OTLD1-mRFP + LSH10-GFP，OTLD1-mRFP + LSH4-GFP和LSH10-GFP +游离mRFP蛋白对的SE-FRET图像（步骤3.2.6.3）。
      3. 此外，使用相同的设置，对共表达OTLD1-mRFP + LSH10-GFP，OTLD1-mRFP + LSH4-GFP和LSH10-GFP +游离mRFP蛋白对的10-15细胞进行成像。
3. 设置AB-FRET的参数（图1B）。
   1. 利用为 SE-FRET 设置的供体和受体通道参数（步骤 3.2.2），但关闭 FRET 通道。
   2. 设置受体光漂白（mRFP）的参数（补充图3）。
      1. 确保在五个图像后开始漂白。每个区域漂白剂允许 200 次迭代。将 100% 激光强度保持在 561 nm。
      2. 保持45秒的漂白时间。确保 400 Hz 的扫描速度为 512 x 512 像素。
   3. 绘制要漂白的单元格区域;例如，对于核相互作用，感兴趣的区域被绘制在细胞核³⁹的整个区域周围。
   4. 通过按 开始实验 按钮激活漂白;激活此功能将执行光漂白并获取AB-FRET图像序列。
4. 分析FRET数据。
   1. 要分析SE-FRET数据，请使用ImageJ软件的"PixFRET"插件在减去SBT⁴⁰ （步骤3.2.6.2）后生成SE-FRET效率的校正图像。
   2. 为了分析AB-FRET数据，使用以下公式⁴¹计算%AB-FRET为mRFP光漂白后GFP发射增加的百分比:%AB-FRET= [（GFPpost - GFPpre） / GFPpre] x 100，其中GFPpost是mRFP光漂白后的GFP发射，GFPpre是mRFP光漂白前的GFP发射。
   3. 查看FRET图像时，请注意FRET信号的亚细胞定位。
      注意:在许多情况下，这些细胞区室（例如，细胞核，叶绿体，ER等）可以很容易地识别，并且作为FRET技术的额外好处，为相互作用蛋白质的生物学功能提供了重要线索。

结果

图2 说明了SE-FRET实验的典型结果，其中细胞核同时记录在三个通道中（即供体GFP，受体mRFP和SE-FRET）。这些数据用于生成以伪色标编码的SE-FRET效率图像。在这个尺度上，从蓝色到红色的转变对应于FRET效率的提高，FRET效率是蛋白质 - 蛋白质接近度从0%到100%的衡量标准。在该代表性实验中，SE-FRET信号记录在细胞核中，其LSH10和OTLD1共表达后的强度与mRFP-GFP表达后观察到的强度相当（即阳性对照）。在阴性对照中未观察到SE-FRET（即OTLD1-mRFP和LSH4-GFP的共表达或游离mRFP和LSH10-GFP）。

使用AB-FRET量化LSH10-OTLD1相互作用。为此，在受体mRFP光漂白之前和之后在细胞核中记录供体GFP荧光作为供体和受体荧光测量的光漂白时间序列（补充图4）。记录的细胞核的图像以伪彩色呈现，以量化GFP荧光的变化。 图3 显示，在mRFP受体被光漂白并失去荧光能...

讨论

该FRET协议简单且易于复制;它还需要最少的供应投资，并利用许多现代实验室的标准设备。具体而言，五个主要技术特征区分了该程序的多功能性。首先，FRET构建体是使用位点特异性重组生成的，与传统的限制性内切酶克隆相比，这是一种易于使用的克隆方法，可产生准确的结果并节省时间。其次， 本氏猪笼草 植物生长简单，产生相对大量的组织，大多数实验室都可以买到。第三，农业渗透导致所交付的构建体的瞬时表达，因此，与生产转基因植物所需的几个月相比，在相对较短的时间内（即24-36小时）产生数据。第四，通过共农业渗透提供目标结构的不同组合的能力允许测试任何蛋白质之间的相互作用。最后，SE-FRET和AB-FRET只能通过打开/关闭其中一个激光通道设置来对同一组织样品进行顺序执行。然而，应该注意的是，微轰击递送⁴² 可用作将构造递送到植物组织中的替代方法，而不是农业渗透;在这种情况下，没有必要使用农业渗透所需的二元载体。

该协议的一个关键步骤是正确选择供体和受体荧光染料对以优化FRET效率。应考虑以下三个因素:（1）供体发射光谱需要最大限度...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
乙酰丁香酮（3′，5′-二甲氧基-4′-羟基苯乙酮）	Sigma-Aldrich	#D134406-1G
Bacto 琼脂	BD Biosciences	#214010
Bacto 胰蛋白胨	BD Biosciences	#211705
Bacto 酵母提取物	BD Biosciences	#212750
共聚焦激光扫描显微镜 （CLSM）	蔡司	LSM900	任何具有类似功能的 CLSM 都适用
EHA105	VWR	104013-310	我们使用 Citovsky 细菌实验室库存收藏
Gateway BP Clonase II	Invitrogen	#11789100
Gateway LR Clonase II	Invitrogen	#11791020
GV3101	VWR	104013-296	我们使用 Citovsky 细菌实验室原液收藏
ImageJ			https://imagej.nih.gov/ij/download.html
MES	Sigma-Aldrich	#69889-10G
MgCl2	Sigma-Aldrich	#63068-250G
NaCl	Sigma-Aldrich	#S5886-500G
Nicotiana benthamiana 种子	学 Pty	RA4或LAB	我们使用Citovsky种子实验室库存集合中的库存
pDONR207	Invitrogen	#12213013
pPZP-RCS2A-DEST-EGFP-N1	N/A		参考文献 15， 28
pPZP-RCS2A-DEST-mRFP-C1	N/A		基于 pPZP-RCS2A-DEST-EGFP-C1 构建生成（见参考文献 15， 28）
pPZP-RCS2A-DEST-mRFP-N1	N/A		基于 pPZP-RCS2A-DEST-EGFP-N1 构建体生成
利福平	Sigma-Aldrich	#R7382-5G
大观霉素	Sigma-Aldrich	#S4014-5G
无针注射器	BD	309659
用于 CLSM 成像的 Zen 软件	蔡司	ZEN 3.0 版本	该软件应与所使用的 CLSM 兼容