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通过荧光共振能量转移研究组蛋白修饰酶与体内转录因子之间的相互作用

DOI：

10.3791/64656

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2022年10月14日

 ,  , 
1Department of Biochemistry and Cell Biology, State University of New York

本文内容

摘要

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荧光共振能量转移（FRET）是一种用于检测活细胞中蛋白质相互作用的成像技术。在这里，提出了一种FRET协议来研究组蛋白修饰酶与转录因子的关联，转录因子将它们募集到靶启动子中，用于植物组织中基因表达的表观遗传调控。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

基因表达的表观遗传调控通常受到组蛋白修饰酶（HME）的影响，这些酶分别产生异色或正色组蛋白标记，用于转录抑制或激活。HME通过转录因子（TF）募集到其靶染色质中。因此，检测和表征 HME 和 TF 之间的直接相互作用对于更好地理解它们的功能和特异性至关重要。如果在 活 组织中体内进行，这些研究将更具生物学相关性。在这里，描述了一种协议，用于使用荧光共振能量转移（FRET）可视化植物组蛋白去泛素酶和植物转录因子之间的植物叶片相互作用，该协议允许检测彼此相距<10nm内的蛋白质分子之间的复合物。介绍了FRET技术的两种变体:SE-FRET（敏化发射）和AB-FRET（受体漂白），其中能量以非辐射方式从供体传递到受体，或者在受体光漂白时由供体辐射发射。SE-FRET和AB-FRET方法都可以很容易地适应，以发现 植物中其他蛋白质之间的其他相互作用。

引言

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植物组蛋白去泛素酶通过组蛋白的翻译后修饰在控制基因表达中起重要作用，特别是通过擦除其单泛素化标记1。到目前为止，OTLD1是拟南芥2，3中为数不多的在分子水平上表征的植物组蛋白去泛素酶之一。OTLD1从H2B组蛋白分子中去除单泛素基团，从而促进靶基因染色质4，5中H3组蛋白的正色乙酰化和甲基化修饰的去除或添加。此外，OTLD1与另一种染色质修饰酶组蛋白赖氨酸去甲基化酶KDM1C相互作用，影响靶基因6，7的转录抑制。

大多数组蛋白修饰酶缺乏DNA结合能力，因此不能直接识别其靶基因。一种可能性是它们与DNA结合转录因子蛋白合作，这些转录因子蛋白结合这些酶并将它们引导到染色质靶标。具体而言，在植物中，已知几种主要的组蛋白修饰酶（即组蛋白甲基转移酶8，9，组蛋白乙酰转移酶10，组蛋白去甲基化酶11和Polycomb抑制复合物12，

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方案

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本氏烟草、根癌农杆菌菌株EHA105或GV3101用于本研究。

1. FRET矢量构建

  1. 为供体/受体FRET对选择荧光标签。
    1. 使用来自pPZP-RCS2A-dest-EGFP-N115，28 的EGFP（参见 材料表）生成供体载体。
    2. 使用来自pPZP-RCS2A-DEST-mRFP-N1的mRFP（参见 材料表）生成受体载体。
  2. 使用位点特异性重组克隆技术34生成供体/受体FRET构建体，例如网关重组克隆系统35。
    1. 扩增感兴趣的蛋白质36 （即拟南芥 OTLD1 和 LSH10）的编码序列15。
      注意:使用阴性对照也是一个好主意，该阴性对照代表一种相互作用的蛋白质的同系物，但预计不会表现出相互作用;OTLD1-LSH10相互作用研究采用LSH10，LSH4的同系物，不识别OTLD1。O....

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结果

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图2 说明了SE-FRET实验的典型结果，其中细胞核同时记录在三个通道中（即供体GFP，受体mRFP和SE-FRET）。这些数据用于生成以伪色标编码的SE-FRET效率图像。在这个尺度上，从蓝色到红色的转变对应于FRET效率的提高，FRET效率是蛋白质 - 蛋白质接近度从0%到100%的衡量标准。在该代表性实验中，SE-FRET信号记录在细胞核中，其LSH10和OTLD1共表达后的强度与mRFP-GFP表达后观察到的强度相当（即阳性对照）。在阴性对照中未观察到SE-FRET（即OTLD1-mRFP和LSH4-GFP的共表达或游离mRFP和LSH10-GFP）。

使用AB-FRET量化LSH10-OTLD1相互作用。为此，在受体mRFP光漂白之前和之后在细胞核中记录供体GFP荧光作为供体和受体荧光测量的光漂白时间序列（补充图4）。记录的细胞核的图像以伪彩色呈现，以量化GFP荧光的变化。 图3 显示，在mRFP受体被光漂白并失去荧光能.......

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讨论

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该FRET协议简单且易于复制;它还需要最少的供应投资，并利用许多现代实验室的标准设备。具体而言，五个主要技术特征区分了该程序的多功能性。首先，FRET构建体是使用位点特异性重组生成的，与传统的限制性内切酶克隆相比，这是一种易于使用的克隆方法，可产生准确的结果并节省时间。其次， 本氏猪笼草 植物生长简单，产生相对大量的组织，大多数实验室都可以买到。第三，农业渗透导致所交付的构建体的瞬时表达，因此，与生产转基因植物所需的几个月相比，在相对较短的时间内（即24-36小时）产生数据。第四，通过共农业渗透提供目标结构的不同组合的能力允许测试任何蛋白质之间的相互作用。最后，SE-FRET和AB-FRET只能通过打开/关闭其中一个激光通道设置来对同一组织样品进行顺序执行。然而，应该注意的是，微轰击递送42 可用作将构造递送到植物组织中的替代方法，而不是农业渗透;在这种情况下，没有必要使用农业渗透所需的二元载体。

该协议的一个关键步骤是正确选择供体和受体荧光染料对以优化FRET效率。应考虑以下三个因素:（1）供体发射光谱需要最大限度.......

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致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

V.C.实验室的工作得到了NIH（R35GM144059和R01GM50224），NSF（MCB1913165和IOS1758046）和BARD（IS-5276-20）对VC的资助。

....

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
乙酰丁香酮（3′，5′-二甲氧基-4′-羟基苯乙酮）Sigma-Aldrich#D134406-1G
Bacto 琼脂BD Biosciences#214010
Bacto 胰蛋白胨BD Biosciences#211705
Bacto 酵母提取物BD Biosciences#212750 
共聚焦激光扫描显微镜 （CLSM）蔡司LSM900任何具有类似功能的 CLSM 都适用
EHA105VWR104013-310我们使用 Citovsky 细菌实验室库存收藏
Gateway BP Clonase II Invitrogen#11789100
Gateway LR Clonase IIInvitrogen#11791020
GV3101VWR104013-296我们使用 Citovsky 细菌实验室原液收藏
ImageJhttps://imagej.nih.gov/ij/download.html
MESSigma-Aldrich#69889-10G
MgCl2Sigma-Aldrich#63068-250G
NaClSigma-Aldrich#S5886-500G
Nicotiana benthamiana 种子学 PtyRA4或LAB我们使用Citovsky种子实验室库存集合中的库存
pDONR207Invitrogen#12213013
pPZP-RCS2A-DEST-EGFP-N1 N/A参考文献 15， 28
pPZP-RCS2A-DEST-mRFP-C1N/A基于 pPZP-RCS2A-DEST-EGFP-C1 构建生成（见参考文献 15， 28）
pPZP-RCS2A-DEST-mRFP-N1 N/A基于 pPZP-RCS2A-DEST-EGFP-N1 构建体生成
利福平Sigma-Aldrich#R7382-5G
大观霉素Sigma-Aldrich#S4014-5G
无针注射器BD309659
用于 CLSM 成像的 Zen 软件蔡司ZEN 3.0 版本该软件应与所使用的 CLSM 兼容
草药

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. March, E., Farrona, S. Plant deubiquitinases and their role in the control of gene expression through modification of histones. Frontiers in Plant Science. 8, 2274(2018).
  2. Isono, E., Nagel, M. K. Deubiquitylating enzymes a....

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Histone Modifying EnzymesTranscription FactorsProtein Protein InteractionFluorescence Resonance EnergySE FRETAB FRETPlant LeavesAgroinfiltrationConfocal MicroscopyImageJ Analysis

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