大鼠胫神经瘤移位模型中的手术操作与行为学检测

摘要

本方案描述了胫神经瘤移位模型，该模型包括对胫神经造成损伤，随后将神经近端残端移位至皮下胫前或外侧位置。通过冯弗雷单丝纤维测试对神经瘤疼痛和足底痛觉过敏的行为学表现进行定量评估。

摘要

胫神经瘤移位（TNT）是一种大鼠模型，可独立评估神经瘤部位（胫神经）的异常性疼痛与由完整腓肠神经支配的后足底表面的异常性疼痛。该TNT模型适用于测试针对神经瘤疼痛的治疗方法，例如评估已在临床应用的某些外科疗法的潜在优势，或评价新药对同一动物两种疼痛模式的作用。在该模型中，对胫神经造成远端损伤（神经断裂），并将近端神经末端移位至胫骨前皮下并固定，以便使用15 g von Frey单丝纤维对神经瘤部位进行评估。为评估腓肠神经分布区域的异常性疼痛，可使用von Frey单丝纤维 通过 在后肢足底外侧区域采用上下法进行检测。胫神经切断术后，神经瘤部位在术后1周内出现机械性痛觉过敏，并持续至少至术后12周。与对侧肢体相比，由腓肠神经支配的足底区域在术后3周内出现痛觉超敏。术后12周时，在切断的胫神经近端形成神经瘤，表现为轴突的弥散和旋涡状排列。对于TNT模型手术，需遵循多个关键的（显微）外科操作步骤，建议在终末麻醉条件下进行手术练习。与其他神经病理性疼痛模型（如保留神经损伤模型）相比，TNT模型可独立检测神经瘤部位的痛觉异常与腓肠神经支配区的痛觉过敏。然而，神经瘤部位的检测仅适用于大鼠，不适用于小鼠。本方案中提供的操作要点和指导可帮助从事疼痛研究的科研团队在其机构中成功建立TNT模型。

引言

从简单的撕裂伤到整个肢体的截肢，每种伤口都可能伴随不同程度的周围神经损伤。这种神经损伤可导致神经瘤的形成，即出芽的神经纤维无序缠结。8%至30%的患者会出现疼痛性神经瘤，严重影响其生活质量^1,2,3,4,5。在肢体截肢后，50%的患者会发展为神经瘤疼痛^6,7,8。报告的症状包括触痛、自发性疼痛、异常性疼痛、痛觉过敏以及支配区域的机械性或热敏感性升高⁹。若在1年内未得到充分治疗，神经瘤疼痛可能进展为慢性疼痛状态，造成沉重的社会负担和相关的医疗费用^{10,11,12,13,....}

方案

本研究严格遵循乌得勒支动物福利机构（IVD）及动物研究指南进行，项目编号为 AVD1150020198824。

1. Von Frey 基线测量

1. 手术前，根据下文第5节和第6节所述的Von Frey测试程序，进行基线测量。

2. 麻醉与准备

注意：本研究在15只12周龄的雄性Sprague Dawley大鼠上进行。

1. 使用5%异氟烷进行诱导麻醉，并以2%-3%异氟烷维持麻醉。
   注意：通常使用2%异氟烷即可达到充分的麻醉效果，并保持自主呼吸，无需气管插管或机械通气。
2. 用镊子轻夹动物足部以检查其反射反应。确认动物无反应后方可继续操作。使用电动剃毛器剃除从膝部至踝部的手术区域毛发，并在眼睛上涂抹眼用软膏以防止干燥。在腹部皮下注射0.5 mg/kg的镇痛药卡洛芬。
3. 将麻醉后的 rats 置于仰卧位，头部朝左或朝右，手术侧下肢靠近术者。外旋后肢下段，使内踝向上。将大鼠置于6倍放大倍率的体视手术显微镜下进行操作。
4. 用碘伏消毒液和酒精交替擦拭剃毛区域，共进行三轮消毒。在腿部覆盖带有手术窗口的无菌单，仅暴露手术区域。手术过程中须始终保持无菌条件。

结果

在神经瘤部位的评估显示，15 g von Frey 单丝刺激的敏感性增加。在基线时，大鼠通常对25次15 g单丝刺激中的10%-15%（±13%）产生反应。TNT手术后1周，反应率上升至45%-50%（±24%）。在对侧，术后反应次数与基线水平相似（图2A）。约20%的大鼠未形成疼痛性神经瘤，其反应率与基线相比未升高（图2B）。这一情况与人类相似，即并非所有患者（截肢后约50%）在神经瘤形成后都会出现疼痛。所有大鼠在手术后12周时，于横断并移位的胫神经残端均形成了神经瘤（图3）。该神经瘤的特征是轴突和微束在胶原沉积物中呈漩涡状排列。

胫神经横断后，由胫神经支配的后肢足底中部机械敏感性降低（图1）。术后1周即出现感觉减退，自术后3周起，与对侧及基线水平相比差异显著，并持续至术后至少12周（图4

讨论

实验方案中的关键步骤
TNT 模型涉及切断胫神经，并将其横向和皮下移位至胫前位置，以便在检测腓肠神经支配区域足底痛觉过敏的同时，对神经瘤进行敏感性测试。在 TNT 模型中，神经瘤的位置必须对研究人员清晰可见。因此，优选白化品系大鼠，因为皮下缝线可通过皮肤清晰观察，且缝线颜色宜为深蓝色或黑色。

当进行手术并暴露胫神经时，胫神经的分叉位置（例如近端或远端）存在个体差异。如果大鼠的分叉位置较近端，则在踝关节近端可能观察到两条神经（即内侧和外侧足底神经）（图5A），而非仅有一条胫神经（图5B）。为了通过腓肠神经诱导足底超敏痛，必须将这两个分支均切断并移位。虽然可选择仅移位其中一条足底神经，但在该解剖水平上难以明确区分外侧与内侧足底神经，这可能影响实验结果。因此，建议将两条神经均进行移位。此外，部分大鼠的胫神经分叉位置较远端，此时可能无法仅移位单条足底神经。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Aesthesio	林顿仪器公司	514007 至 514015	0.6 克至 15 克单丝纤维
卡洛芬	当地兽药房	n/a	当地兽医药房配制卡普洛芬稀释液
棉签	Nobamed	974255
电灼术	Fine Science Tools	18010-00
70% 乙醇	Interchema BV	400406
Ethilon 4.0	Johnson &安普与约翰逊	1854G	重要提示：颜色应为蓝色或黑色
Ethilon 8.0	Johnson &安普与约翰逊	BV130-5
异氟烷（Isoflo, isoflurane），硕腾（Zoetis）	德克拉动物保健产品	B506
网底笼具	Stoelting公司	57816 和 57824
微型镊子	Fine Science Tools	11251-35
微针持针器	精细科学工具	12076-12
微型剪刀	Fine Science Tools	15019-10
微型镊子	Fine Science Tools	11254-20
0.9% NaCl	特拉德梅德	H7 1000-FRE
持针器	Fine Science Tools	12004-16
眼用软膏	当地兽药房	n/a	当地兽医药房配制眼膏
手术刀	Fine Science Tools	10003-12
剪刀	Fine Science Tools	14001-12
立体手术显微镜	Leica	A60 F
带孔无菌单	Evercare OneMed	1555-01
手术刀片编号15	精细科学工具	10015-00
镊子	Fine Science Tools	11617-12