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方法文章

大鼠胫神经瘤移位模型中的手术操作与行为学检测

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DOI：

10.3791/64659

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2023年1月6日

 ,  ,  , 
1Department of Plastic and Reconstructive Surgery, University Medical Center Utrecht, Utrecht University, 2Axogen, 3Center for Translational Immunology, University Medical Center Utrecht, Utrecht University

本文内容

摘要

本方案描述了胫神经瘤移位模型，该模型包括对胫神经造成损伤，随后将神经近端残端移位至皮下胫前或外侧位置。通过冯弗雷单丝纤维测试对神经瘤疼痛和足底痛觉过敏的行为学表现进行定量评估。

摘要

胫神经瘤移位（TNT）是一种大鼠模型，可独立评估神经瘤部位（胫神经）的异常性疼痛与由完整腓肠神经支配的后足底表面的异常性疼痛。该TNT模型适用于测试针对神经瘤疼痛的治疗方法，例如评估已在临床应用的某些外科疗法的潜在优势，或评价新药对同一动物两种疼痛模式的作用。在该模型中，对胫神经造成远端损伤（神经断裂），并将近端神经末端移位至胫骨前皮下并固定，以便使用15 g von Frey单丝纤维对神经瘤部位进行评估。为评估腓肠神经分布区域的异常性疼痛，可使用von Frey单丝纤维 通过 在后肢足底外侧区域采用上下法进行检测。胫神经切断术后，神经瘤部位在术后1周内出现机械性痛觉过敏，并持续至少至术后12周。与对侧肢体相比，由腓肠神经支配的足底区域在术后3周内出现痛觉超敏。术后12周时，在切断的胫神经近端形成神经瘤，表现为轴突的弥散和旋涡状排列。对于TNT模型手术，需遵循多个关键的（显微）外科操作步骤，建议在终末麻醉条件下进行手术练习。与其他神经病理性疼痛模型（如保留神经损伤模型）相比，TNT模型可独立检测神经瘤部位的痛觉异常与腓肠神经支配区的痛觉过敏。然而，神经瘤部位的检测仅适用于大鼠，不适用于小鼠。本方案中提供的操作要点和指导可帮助从事疼痛研究的科研团队在其机构中成功建立TNT模型。

引言

从简单的撕裂伤到整个肢体的截肢，每种伤口都可能伴随不同程度的周围神经损伤。这种神经损伤可导致神经瘤的形成，即出芽的神经纤维无序缠结。8%至30%的患者会出现疼痛性神经瘤，严重影响其生活质量1,2,3,4,5。在肢体截肢后，50%的患者会发展为神经瘤疼痛6,7,8。报告的症状包括触痛、自发性疼痛、异常性疼痛、痛觉过敏以及支配区域的机械性或热敏感性升高9。若在1年内未得到充分治疗，神经瘤疼痛可能进展为慢性疼痛状态，造成沉重的社会负担和相关的医疗费用10,11,12,13,14。由于目前药物干预效果不佳，神经瘤疼痛通常首选手术切除疼痛的神经瘤，并采用文献中描述的各种外科技术处理神经15。需要强调的是，完全缓解疼痛的情况较为罕见，疼痛常随时间加重，且40%的患者无法从手术中获益，表明亟需新的治疗方法1,16。

标准化的神经瘤疼痛大鼠模型有助于理解驱动神经瘤疼痛的机制，并可能帮助识别新的治疗方法或评估临床中现有的治疗方法。胫神经瘤转位（TNT）模型最初由 Dorsi 等人于 2008 年描述17，并已被多个研究团队使用18,19,20。该方法的总体目标是能够测试不同的神经瘤疼痛治疗技术。与例如 spared nerve injury（SNI）模型21相比，该模型的优势在于允许在神经瘤部位测试异常性疼痛。这是因为该模型涉及将胫神经近端神经断端转位至胫前皮下位置，从而可使用 von Frey 单丝纤维进行探测。此外，在同一动物体内，由完整腓肠神经支配的后肢足底表面也会出现异常性疼痛，该疼痛可独立于神经瘤部位的疼痛进行评估。这与患者神经瘤疼痛的症状相似，临床上在切除疼痛性神经瘤后，持续性神经病理性疼痛有时由邻近神经引起22。此外，在伴有神经瘤的切断神经上出现的异常性疼痛，与在完整邻近神经上出现的异常性疼痛属于不同的疼痛模式。因此，该模型有助于评估新疗法对神经瘤局部异常性疼痛以及在后肢足底测试的更广泛神经病理性疼痛的影响。由于建立 TNT 模型所需的手术操作可能具有挑战性，本文对操作步骤进行了详细阐述，以支持研究人员在其研究机构中成功实施该模型。

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方案

本研究严格遵循乌得勒支动物福利机构（IVD）及动物研究指南进行，项目编号为 AVD1150020198824。

1. Von Frey 基线测量

  1. 手术前，根据下文第5节和第6节所述的Von Frey测试程序，进行基线测量。

2. 麻醉与准备

注意：本研究在15只12周龄的雄性Sprague Dawley大鼠上进行。

  1. 使用5%异氟烷进行诱导麻醉，并以2%-3%异氟烷维持麻醉。
    注意：通常使用2%异氟烷即可达到充分的麻醉效果，并保持自主呼吸，无需气管插管或机械通气。
  2. 用镊子轻夹动物足部以检查其反射反应。确认动物无反应后方可继续操作。使用电动剃毛器剃除从膝部至踝部的手术区域毛发，并在眼睛上涂抹眼用软膏以防止干燥。在腹部皮下注射0.5 mg/kg的镇痛药卡洛芬。
  3. 将麻醉后的 rats 置于仰卧位，头部朝左或朝右，手术侧下肢靠近术者。外旋后肢下段，使内踝向上。将大鼠置于6倍放大倍率的体视手术显微镜下进行操作。
  4. 用碘伏消毒液和酒精交替擦拭剃毛区域，共进行三轮消毒。在腿部覆盖带有手术窗口的无菌单，仅暴露手术区域。手术过程中须始终保持无菌条件。

3. 手术

  1. 在踝关节下方放置一小块棉签，以保持手术区域水平。定位膝关节，并在后肢足部内侧从中段小腿至踝关节处，用手术刀做一条1-2 cm的纵向切口。必要时，用显微剪进一步切开皮肤和皮下组织，直至可见肌肉层。
  2. 辨认浅表神经血管束，其表现为两条或三条白色细线及一条较粗的紫色/红色线，有时伴有细小分支，可在肌肉层上自由移动。使用电凝设备（见材料表）凝固手术区域内的活动性出血或渗血。注意避免损伤神经血管束。
  3. 钝性分离以打开腓肠肌之间的筋膜，位置位于浅表神经血管束（步骤3.2）稍后方。在肌肉筋膜之间可找到胫神经。胫神经的直径约为神经血管束中浅表神经的三倍。可将胫骨作为额外解剖标志（胫神经位于胫骨稍后方）。
  4. 辨认胫神经及其分叉。
    注意：分叉处通常可见一条沿神经纵向走行的较浅色线条。
  5. 小心钝性分离胫神经，使其脱离周围血管束。分离操作时，可轻轻移动胫神经，剪除在移动过程中被牵拉显露的组织。
    注意：若分离后胫神经与横行静脉相连，可对这些静脉进行电凝，以充分暴露整个胫神经。注意避免电凝胫神经束本身。
  6. 向近端暴露胫神经，直至其消失于横行肌肉层下方。此时，胫神经似乎向后肢深部延伸，朝向膝关节方向。向远端暴露胫神经至踝关节处。
    注意：当更远端暴露胫神经时，横行胶原纤维（即与神经纤维走向垂直的纤维）数量将增加。这些胶原纤维需剪断，以便为胫神经转位提供足够长度。
    1. 当整个胫神经完全暴露后，将肌肉层复位，以避免神经脱水。若神经出现脱水（即变得僵硬、暗淡、起皱），且肌肉层覆盖不足以缓解，可滴加生理盐水以保持其湿润。
  7. 使用钝头显微外科器械（推荐使用显微持针器），钝性分离胫前皮肤与皮下肌肉层，以建立皮下隧道。操作时，提起皮肤，将钝头器械平行于皮肤表面推入组织。确保隧道末端位于胫前或更外侧，以便后续神经瘤检测时易于接触该区域。
  8. 将异氟烷浓度提高至5%。返回至胫神经处并暴露之（即回到步骤3.6所述位置）。在靠近踝关节的最远端水平切断胫神经（即切断两条足底分支）。随后将异氟烷浓度降至正常水平2%-3%。
  9. 将显微镜放大倍数调整至10x或16x。辨认步骤3.8切断处近端的胫神经外膜；若胫神经在更近端处分叉，则辨认步骤3.8切断处近端的内侧与外侧足底分支各自的外膜。
    注意：与内部较黄且柔软的神经纤维相比，外膜颜色更白、质地更坚韧。
  10. 小心用镊子夹住近端神经断端的外膜，将8-0尼龙缝线（见材料表）穿过外膜，针尖在神经与外膜之间进针，进针深度约0.5 mm。拉出缝线后，将针在皮下穿入步骤3.7所建立的皮下隧道末端组织，打结固定，从而将神经向侧方转位至皮下隧道内。
    注意：若两条足底分支共用一个外膜，单根缝线即可；若各自拥有独立外膜，则需分别固定。避免缝线穿透皮肤，仅在皮下固定。
  11. 在已固定的神经断端旁，放置一根颜色较深的粗缝线（推荐使用蓝色或黑色4-0缝线），使其与神经末端平齐，但不穿透皮肤。确保该缝线在皮肤外可见。检查在移动足部和肌肉后神经是否保持原位。剪断缝线末端时，4-0缝线末端略长于8-0缝线末端。
  12. 将显微镜放大倍数调回6x。使用8-0缝线进行表皮内缝合关闭皮肤，并用棉签蘸取0.9% NaCl轻轻清洁皮肤。

4. 术后治疗

  1. 将大鼠置于干净的笼子中，在笼子上方铺上纸巾，并使其保持舒适的体位。如果房间温度较低，可在笼子的一部分下方放置加热垫（仅覆盖笼子的一部分，以便动物在需要时能够离开热源）。确保大鼠能够方便地获取食物和饮水。
  2. 术后大鼠在恢复足够的意识、能够维持胸卧位之前，不得无人看管。大鼠在手术后完全从麻醉中恢复，通常约1小时后，当其表现出正常的行走模式和行为时，方可与其他动物合笼饲养。
  3. 术后24小时和48小时，皮下注射（腹部区域）0.5 mg/kg剂量的卡洛芬，以缓解术后疼痛。

5. 后肢足底的Von Frey测试

注意：Von Frey 检测（步骤 5 和 6）在手术前（用于基线测量）以及手术后第 3 天开始进行。

  1. 将大鼠置于网状金属丝底部的笼子中，于基线测量前1周或手术前2周开始，以确保其适应测试环境。
  2. 至少在手术前1周开始进行基线测量，并确保在不同的三天内完成三次独立的基线测量。
  3. 确认大鼠在金属网底笼中处于安静状态。使用一系列对数尺度的Von Frey单丝纤维，垂直作用于后肢足底表面。
    1. 为了刺激腓肠神经（高敏感性区域），将单丝纤维施加于靠近毛发边缘的外侧部位。避免触碰足垫，因为这些区域更为敏感。
    2. 为刺激胫神经（低敏感性区域），将单丝纤维施加于后肢足底表面的中点位置。若将单丝纤维施加于最内侧区域，则可能同时刺激到股神经的分支——隐神经图1）。避免接触足垫。
  4. 从4 g单丝开始。对单丝施加足够的力，使其弯曲并保持3秒，然后观察动物对单丝的反应。阳性反应包括足爪突然回缩、突然颤动、突然舔舐足爪或发出声音。在某些情况下，大鼠会移动并试图寻找或攻击单丝。
  5. 根据对刺激的反应选择下一根单丝 通过 上下法23例如，如果大鼠有反应，则接下来使用2 g单丝纤维进行刺激；如果大鼠无反应，则使用6 g单丝纤维进行刺激，依此类推。根据反应情况，总共施加5–10次刺激。

6. 神经瘤部位的Von Frey测试

  1. 在进行基线测量前至少 5-7 天，或在手术前 2 周开始，每天对动物进行抓握操作。确保按照步骤 6.2 中描述的方式抓握动物，使其适应该体位。
  2. 抓握大鼠时，使其鼻部朝向肘窝方向。若用右手抓握大鼠，则其左后肢应自然悬垂于右手拇指与食指之间（即第一指蹼间）；若用左手抓握，则其右后肢应自然悬垂于左手拇指与食指之间。
  3. 在手术前至少 1 周开始进行基线测量。确保在不同日期完成三次独立的基线测量。
  4. 确认大鼠在被抓握时保持安静且舒适。在基线测量时，将 15 g 单丝纤维轻柔地接触暴露的后肢胫前区域；手术后，则将其接触可见的缝合处（例如神经瘤所在位置）。施加足够的力使纤维弯曲，并持续 1 秒。
    1. 记录每次刺激后的反应。反应类型包括无反应、缓慢回缩、快速回缩和发声。无反应记为 0 分，缓慢回缩、快速回缩或发声均记为 1 分。
  5. 重复进行五组测试，每组包含五次单丝纤维刺激，每次刺激间隔 2-3 秒，每组之间间隔 2-3 分钟或更长时间。总计每只后肢应接受 25 次单丝纤维刺激，并记录每次的反应。

7. 组织学样本回收与制备

注意：组织学检查在初次手术后 12 周进行。

  1. 按照步骤 2.2、2.3 和 2.4 所述，诱导麻醉并准备动物。
  2. 使用手术刀在初次手术留下的瘢痕处轻轻做一长度为2-3 cm的切口，注意不要切得过深，因为神经位置表浅。
  3. 确定神经瘤的位置，仔细分离神经瘤及神经周围的瘢痕组织，并将获取的神经瘤置于固定液中。为评估神经瘤的形态学特征，建议按照 Tork 等人的描述，将组织沿长轴方向包埋于石蜡或环氧树脂中。18.
  4. 组织收获后，在终末麻醉（5% 异氟烷）下处死大鼠 通过 心脏穿刺或断头处死
    注意：建议先在处死大鼠前采集神经瘤，因为此时更容易将神经瘤与其周围组织区分开来 体内.

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结果

在神经瘤部位的评估显示，15 g von Frey 单丝刺激的敏感性增加。在基线时，大鼠通常对25次15 g单丝刺激中的10%-15%（±13%）产生反应。TNT手术后1周，反应率上升至45%-50%（±24%）。在对侧，术后反应次数与基线水平相似（图2A）。约20%的大鼠未形成疼痛性神经瘤，其反应率与基线相比未升高（图2B）。这一情况与人类相似，即并非所有患者（截肢后约50%）在神经瘤形成后都会出现疼痛。所有大鼠在手术后12周时，于横断并移位的胫神经残端均形成了神经瘤（图3）。该神经瘤的特征是轴突和微束在胶原沉积物中呈漩涡状排列。

胫神经横断后，由胫神经支配的后肢足底中部机械敏感性降低（图1）。术后1周即出现感觉减退，自术后3周起，与对侧及基线水平相比差异显著，并持续至术后至少12周（图4

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讨论

实验方案中的关键步骤
TNT 模型涉及切断胫神经，并将其横向和皮下移位至胫前位置，以便在检测腓肠神经支配区域足底痛觉过敏的同时，对神经瘤进行敏感性测试。在 TNT 模型中，神经瘤的位置必须对研究人员清晰可见。因此，优选白化品系大鼠，因为皮下缝线可通过皮肤清晰观察，且缝线颜色宜为深蓝色或黑色。

当进行手术并暴露胫神经时，胫神经的分叉位置（例如近端或远端）存在个体差异。如果大鼠的分叉位置较近端，则在踝关节近端可能观察到两条神经（即内侧和外侧足底神经）（图5A），而非仅有一条胫神经（图5B）。为了通过腓肠神经诱导足底超敏痛，必须将这两个分支均切断并移位。虽然可选择仅移位其中一条足底神经，但在该解剖水平上难以明确区分外侧与内侧足底神经，这可能影响实验结果。因此，建议将两条神经均进行移位。此外，部分大鼠的胫神经分叉位置较远端，此时可能无法仅移位单条足底神经。

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披露

作者声明不存在利益冲突。尽管本研究工作部分由Axogen公司资助，但该公司对研究的实施和结果没有任何影响。

致谢

我们感谢Sabine Versteeg在显微手术期间提供的协助，以及感谢Common Animal Laboratory（Gemeenschappelijk Dieren Laboratorium）的Anja van der Sar和Trudy Oosterveld-Romijn在准备显微镜和手术室以及动物护理方面提供的帮助。

本研究由 Axogen 资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Aesthesio林顿仪器公司514007 至 5140150.6 克至 15 克单丝纤维
卡洛芬当地兽药房n/a当地兽医药房配制卡普洛芬稀释液
棉签Nobamed974255
电灼术Fine Science Tools18010-00
70% 乙醇Interchema BV400406
Ethilon 4.0Johnson &安普与约翰逊1854G重要提示：颜色应为蓝色或黑色
Ethilon 8.0Johnson &安普与约翰逊BV130-5
异氟烷（Isoflo, isoflurane），硕腾（Zoetis）德克拉动物保健产品B506
网底笼具Stoelting公司57816 和 57824
微型镊子Fine Science Tools11251-35
微针持针器 精细科学工具12076-12
微型剪刀Fine Science Tools15019-10
微型镊子Fine Science Tools11254-20
0.9% NaCl特拉德梅德H7 1000-FRE
持针器Fine Science Tools12004-16
眼用软膏 当地兽药房n/a当地兽医药房配制眼膏
手术刀Fine Science Tools10003-12
剪刀Fine Science Tools14001-12
立体手术显微镜LeicaA60 F
带孔无菌单Evercare OneMed1555-01
手术刀片编号15精细科学工具10015-00
镊子Fine Science Tools11617-12

参考文献

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